Имунологични изследвания в урологията

Предписването на имунограма на урологичен пациент означава, че лекуващият лекар подозира наличието на нарушения в имунната система. Повтарящи се бактериални, вирусни, гъбични инфекции, алергични прояви, системни заболявания могат да бъдат признаци на тези нарушения, които се характеризират с редица синдроми (инфекциозен, онкологичен, алергичен, автоимунен, лимфопролиферативен). Един пациент може да има няколко синдрома. Например, хроничните инфекциозни заболявания (инфекциозен синдром) могат да причинят имунодефицит, а имунодефицитът може да се прояви като предразположеност към инфекциозни и онкологични заболявания (онкологичен синдром). Предразположението към инфекции може да възникне на фона на вторичен имунодефицит, развил се в резултат на лимфопролиферативно заболяване, като левкемия. Съществуват три основни групи патологични промени в имунната система:

• количествен или функционален дефицит на една или друга връзка от имунната система, което води до развитие на имунодефицитно състояние;
• нарушение в разпознаването на антигени от имунната система, водещо до развитие на автоимунни процеси;
• хиперреактивен или „извратен“ имунен отговор, проявяващ се с развитието на алергични заболявания.

Съществуват скринингови (тестове от ниво 1) и уточняващи (тестове от ниво 2) методи на имунодиагностика. Първите съществуват, за да регистрират нарушения в имунната система, вторите - за да установят механизмите, участващи в тяхното осъществяване, с цел по-нататъшна имунокорекция.

В-клетъчен имунитет

Методи за скрининг

• Определяне на относителния и абсолютния брой на В-лимфоцитите чрез имунофлуоресценция или флоуцитофлуорометрия с моноклонални антитела към В-клетъчни антигени (CD19, CD20, където CD са клъстери на диференциация). Нормалното съдържание на В-лимфоцити при възрастни е 8-19% от общия брой левкоцити или 190-380 клетки/μl. Увеличение на съдържанието на В-лимфоцити се наблюдава при остри и хронични бактериални и гъбични инфекции, хронични чернодробни заболявания, системни заболявания на съединителната тъкан, хронична лимфоцитна левкемия и миелом.
• Определяне на концентрацията на неспецифични имуноглобулини (F, M, G, E) чрез проста радиална имунодифузия, нефелометрия или турбометрия, радиоимунологичен анализ или ензимен имуноанализ (ELISA). Норми за възрастни: имуноглобулин (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 03-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. Повишаване на концентрацията на имуноглобулини се наблюдава при същите патологични състояния, при които се наблюдава повишаване на съдържанието на В-лимфоцити. Намаляване на концентрацията на имуноглобулини се наблюдава при вродена хипогамаглобулинемия, неоплазми на имунната система, отстраняване на далака, загуба на протеини, бъбречни или чревни заболявания, лечение с цитостатици и имуносупресори.

Методи за избистряне

• Определяне на циркулиращите имунни комплекси в кръвта чрез селективно утаяване в полиетиленгликол, последвано от спектрофотометрично изследване на плътността (нормално 80-20 U). Увеличението на циркулиращите имунни комплекси е типично за остри бактериални, гъбични, вирусни инфекции, автоимунни, имунокомплексни заболявания, серумна болест, алергични реакции тип 3;
• Определяне на специфични имуноглобулини в кръвта във връзка с бактериални и вирусни антигени, дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК) при автоимунни заболявания, откриване на антиспермални (автоимунен инфертилитет) и антиренални антитела (пиелонефрит и гломерулонефрит) чрез радиална имунодифузия или ELISA метод.
• Определяне на антиспермални антитела в сперматозоидите [MAR тест (смесена антиглобулинова реакция)], нормален - отрицателен резултат.
• Определяне на концентрацията на имуноглобулини в урината с цел диференциална диагноза между пиелонефрит и гломерулонефрит (селективност на протеинурията).
• Определяне на съдържанието на IgE в простатния сок с цел диагностициране на алергичен простатит чрез метода на радиална имунодифузия или ELISA.
• Изследване на отговора в реакцията на бластна трансформация на В-лимфоцитите към В-клетъчен митоген (митоген от покеуийд за стимулиране на реакцията на бластна трансформация на В-лимфоцитите в присъствието на Т-лимфоцити), чиято нормативна стойност е 95-100%.

Т-клетъчна връзка на имунитета

Методи за скрининг

• Определяне на относителния и абсолютния брой на зрелите CD3 Т-лимфоцити чрез имунофлуоресцентна реакция или флоуцитофлуорометрия с използване на моноклонални анти-CD3 антитела. Нормата за възрастни е 58-76% или 1100-1700 клетки/μl. Намаляването на броя на Т-лимфоцитите е индикатор за недостатъчност на клетъчната връзка на имунитета. Това е типично за някои вторични и първични имунодефицити (хронични бактериални и вирусни инфекции: туберкулоза, синдром на придобита имунна недостатъчност, злокачествени тумори, хронична бъбречна недостатъчност, травми, стрес, стареене, недохранване, лечение с цитостатици, излагане на йонизиращо лъчение). Увеличаването на броя на Т-лимфоцитите се наблюдава на фона на имунна хиперактивност или при лимфопролиферативни заболявания. При възпаление броят на Т-лимфоцитите първо се увеличава, а след това намалява. Липсата на намаляване на Т-лимфоцитите показва хроничен възпалителен процес.
• Оценка на лимфоцитни субпопулации.
  • Определяне на броя на Т-хелперите (анти-CD4 антитела). Нормално 36-55% или 400-1100 клетки/mcl. Увеличение на броя на тези клетки се наблюдава при автоимунни заболявания, болест на Валденстром, активиране на антитрансплантационен имунитет; намаляване на броя на Т-хелперите се наблюдава при хронични бактериални, вирусни, протозойни инфекции, туберкулоза, синдром на придобита имунна недостатъчност, злокачествени тумори, изгаряния, травми, недохранване, стареене, лечение с цитостатици, излагане на йонизиращо лъчение.
  • Определяне на броя на Т-супресорите (анти-CD4 антитела). Нормално 17-37% или 300-700 клетки/μl. Увеличение на броя на Т-супресорите настъпва при същите условия, при които броят на Т-хелперите намалява, а тяхното намаляване настъпва при същите условия, при които съдържанието на Т-хелперите се увеличава.
  • Имунорегулаторен индекс CD4/CD8, нормално 1,5-2,5. Хиперактивност със стойности над 2,5 (алергични и автоимунни заболявания); хипоактивност - по-малка от 1,0 (предразположение към хронични инфекции). В началото на възпалителния процес имунорегулаторният индекс се повишава, а когато отшуми, се нормализира.

Методи за избистряне

• Определяне на броя на естествените убийци (NK клетки) - анти-CD16 и анти-CD56 антитела. Нормата за CD 16 лимфоцити е 6-26%, CD56 - 9-19%. Увеличение на броя на NK клетките се наблюдава при отхвърляне на трансплантат, намаление - при вирусни инфекции, рак, първични и вторични имунодефицити, изгаряния, наранявания и стрес, лечение с цитостатици и излагане на йонизиращо лъчение.
• Определяне на броя на Т-лимфоцитите с рецептор към интерлевкин-2 (активационен маркер) - анти-CD25 антитела. Нормата е 10-15%. Увеличение на броя им се наблюдава при алергични заболявания, отхвърляне на трансплантат, отговор към тимус-зависими антигени в острия период на първична инфекция, намаление - при същите заболявания, при които има намаляване на броя на NK клетките.
• Изследване на експресията на активационен маркер - молекула за хистосъвместимост от клас II HLA-DR. Повишена експресия се наблюдава при възпалителни процеси, при пациенти с хепатит C, цьолиакия, сифилис, остри респираторни заболявания.
• Оценка на апоптозата на лимфоцитите. Приблизителна представа за готовността на лимфоцитите за апоптоза може да се определи чрез експресията на Fas рецептора (CD95) на тяхната повърхност и bd-2 протоонкогена в митохондриите. Апоптозата на лимфоцитите се оценява чрез третирането им с две флуоресцентни багрила: пропидиев йодид, който се свързва с ДНК фрагменти, и анексин Y, който се свързва с фосфатидилсерин, който се появява върху клетъчната мембрана в началото на апоптозата. Резултатите се оценяват с помощта на поточен цитофлуорометър. Резултатите се изчисляват въз основа на съотношението на клетките, оцветени с различни багрила. Неоцветените клетки са жизнеспособни, клетките, свързани само с анексин Y, са ранни прояви на апоптоза, като пропидиев йодид и анексин Y са късни прояви на апоптоза, оцветяването само с пропидиев йодид показва некроза.
• Оценка на пролиферацията на Т-лимфоцитите in vitro.
  • Промени в клетъчната бластогенеза - реакция на лимфоцитна бластна трансформация. Левкоцитите се инкубират с всякакъв митоген от растителен произход (лектини). Фитохемаглутининът се използва най-често в продължение на 72 часа, след което се взема намазка, оцветява се и се преброява броят на бластите! Индексът на стимулация е съотношението на процента трансформирани клетки в експеримента (култура с фитохемаглутинин) към процента трансформирани клетки в контролата (култура без фитохемаглутинин). Реакцията на лимфоцитна бластна трансформация може да се оцени чрез включване на радиоактивен маркер (ZN-тимндинум) в култивираните клетки, тъй като синтезът на ДНК се увеличава по време на клетъчното делене. Нарушения в пролиферативния отговор се наблюдават както при първични, така и при вторични имунодефицити, свързани с инфекции, рак, бъбречна недостатъчност и хирургични интервенции.
  • В тези изследвания се оценява експресията на активационни маркери (CD25, трансферинов рецептор - CD71) и молекулата на главния комплекс за хистосъвместимост клас II HLA-DR, които практически липсват върху почиващи Т-лимфоцити. Т-лимфоцитите се стимулират с фитохемаглутинин, след 3 дни експресията на активационни маркери се анализира чрез метода на директна или индиректна имунофлуоресцентна реакция, флуоцитометрия, като се използват моноклонални антитела към изолираните рецептори.
  • Измерване на количеството медиатори, синтезирани от активирани Т-лимфоцити [интерлевкин (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-интерферон и др.], използвайки радиоимунологичен анализ или ELISA. От особено значение е оценката на концентрацията на γ-интерферон и IL-4 като маркери на Th1 и Th2 в супернатанта на активираните култури и вътре в клетката. Ако е възможно, е полезно да се определи генната експресия за съответния цитокин чрез нивото на матриксна рибонуклеинова киселина в клетката продуцент и интензивността на експресия на рецептори за съответните цитокини.
    
• Реакция на инхибиране на миграцията на лимфоцити. Сенсибилизираните Т-лимфоцити в реакция с антиген секретират лимфокини, включително фактори, инхибиращи миграцията на лимфоцити. Феноменът на инхибиране се наблюдава, когато митогените се въведат в клетъчната култура. Оценката на степента на инхибиране ни позволява да преценим способността на лимфоцитите да секретират цитокини. Обикновено честотата на миграция, в зависимост от специфичния митоген, е 20-80%.
• Оценка на цитотоксичността на NK клетките. Определя се способността на естествените клетки убийци да убиват целеви клетки от еритромиелоидната линия K-562. Ако се оценява антитяло-зависимата цитотоксичност, се използват целеви клетки, покрити с IgG антитела. Целевите клетки се маркират с 3H-уридин и се инкубират с ефекторни клетки. Смъртта на целевите клетки се оценява чрез освобождаването на радиоактивния маркер в разтвора. Намаляване на цитотоксичността настъпва при злокачествени неоплазми. В някои случаи, когато е необходимо да се предвиди ефективността на лечението с интерлевкини, цитотоксичността на NK клетките се оценява по време на инкубация с определени цитокини.

Изследване на функцията на фагоцитите

Методи за скрининг

Изследване на интензивността на абсорбция на микробни клетки от фагоцити (фагоцитоза на латексови частици, тестова култура на стафилокок, E. coli или микроорганизми, изолирани от пациента). Чрез центрофугиране на хепаринизирана кръв се изолира суспензия от левкоцити, добавя се серум от IV кръвна група за опсонизация (опсонините са протеини, които усилват фагоцитозата). Микробната суспензия се разрежда, смесва се с левкоцити и се инкубира в продължение на 120 минути, като се вземат проби за анализ 30.90.120 минути след началото на инкубацията. От събраната левкоцитна суспензия се правят натривки. Определят се следните показатели за фагоцитоза:

• фагоцитен индекс - процентът на клетките, които са влезли във фагоцитоза в рамките на 30 минути и 120 минути инкубация; стандартната стойност на фагоцитния индекс (30) е 94%, фагоцитният индекс (120) е 92%;
• фагоцитно число - средният брой бактерии, разположени вътреклетъчно; стандартната стойност на фагоцитното число (30) е 11%, фагоцитното число (120) е 9,8%;
• коефициент на фагоцитно число - съотношението на фагоцитното число (30) към фагоцитното число (120); нормално 1,16;
• Бактерициден индекс на неутрофилите - съотношението на броя на убитите микроби във фагоцитите към общия брой абсорбирани микроби; обикновено 66%.

Методи за избистряне

• Изследване на бактерицидната способност на фагоцитите в тест с нитросин тетразолий (NBT) - NBT тест. Към левкоцитите се добавя жълто нитросин тетразолиев багрило. Когато неутрофил абсорбира багрилото, протича редукционен процес под въздействието на свободни кислородни радикали, което води до синьо оцветяване. Реакцията се провежда в 96-ямкова плоскодънна плака. Разтвор на Ханкс (спонтанен NBT) се добавя към първите три ямки със смес от NBT и левкоцити, а към втората се добавят латексови частици; сместа се инкубира при 37°C за 25 минути. Резултатите се отчитат при 540 nm на четец и се изразяват в произволни единици. Изчислява се коефициентът на стимулация (K _st ), равен на съотношението на оптичната плътност в стимулираните ямки към средната оптична плътност в ямките без стимулация. При здрави хора NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. Кст = _1,78 ±0,36.
• Изследване на адхезионните молекули. Флоуцитофлуорометрията се използва за определяне на експресията на повърхностните антигени CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18. Имунодефицитите с нарушена адхезия се проявяват с рецидивиращи инфекции, бавно заздравяване на рани и липса на гной във огнищата на инфекцията.

Изследване на комплементната система

Методи за скрининг

Определянето на хемолитичната активност на комплемента е изследване на класическия път на активиране на комплемента. Различни разреждания на серум от болен и здрав човек се добавят към еритроцити на овена, покрити с антитела. Единицата за хемолитична активност е реципрочната стойност на разреждането на серума, при което 50% от еритроцитите се разрушават. Степента на хемолиза се оценява фотометрично чрез освобождаването на хемоглобин в разтвора. Намаляване на хемолитичната активност на комплемента се наблюдава при системен лупус еритематозус с увреждане на бъбреците, остър гломерулонефрит, комбинирани имунодефицити, миастения, вирусен хепатит, лимфоми, а повишаване - при обструктивна жълтеница, тиреоидит на Хашимото, ревматизъм, ревматоиден артрит, нодуларен периартериит, дерматомиозит, миокарден инфаркт, улцерозен колит, синдром на Райтер, подагра.

Методи за избистряне

• Определяне на компонентите на комплемента. Количественото определяне се извършва чрез радиална имунодифузия и нефелометрия.
  Изследването не е информативно, освен ако антигенните свойства на компонентите на комплемента не са променени.
• Установено е, че Clq компонентът на комплемента усилва фагоцитозата и медиира клетъчната цитотоксичност. Намаляването му се наблюдава при имунокомплексни заболявания, системен лупус еритематозус, гнойни инфекции и тумори.
• C3 компонентът участва в активирането на класическите и алтернативните пътища на комплемента. Намаляването на концентрацията му е свързано с хронични бактериални и гъбични инфекции, наличието на циркулиращи или тъканни имунни комплекси.
• C4 компонентът участва в активирането на класическия път. Намаляването на концентрацията му е свързано с продължително активиране на комплемента от имунни комплекси и намаляване на концентрацията на C1 инхибитора, който контролира активирането на класическия път на комплемента. C4 дефицит се наблюдава при системен лупус еритематозус, повишаване на C4 се наблюдава при бъбречни заболявания, отхвърляне на трансплантат, остро възпаление и стомашно-чревни заболявания.
• C5a е малък фрагмент от молекулата C5, който се отделя от нея в резултат на активиране на комплементната система. Концентрацията му се увеличава по време на възпаление, сепсис, атопични и алергични заболявания.
• Cl-инхибиторът е многофункционален фактор. Той контролира активирането на комплементния компонент C1, инхибира активността на каликреина, плазмина и активирания фактор на Хагеман, Cl- и Or-протеазите. Дефицитът на C1-инхибитор води до ангиоедем.
• функционални изследвания на комплемента. Тестваният серум се добавя към стандартен серум, в който липсва какъвто и да е компонент на комплемента, и се определя хемолитичната активност на комплемента. Ако хемолитичната активност не се възстанови до нормалното, активността на този компонент на комплемента в тестовия серум се счита за намалена.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]