Имунологични изследвания в урологията

Приписването на имунограма на урологичен пациент означава, че лекуващият лекар приема, че има смущения в имунната система. Дублиращи бактериални, вирусни, гъбични инфекции, алергични реакции, системни заболявания могат да бъдат симптоми на тези заболявания, които се характеризират с редица синдроми (инфекция, рак, алергични, автоимунни, лимфопролиферативно). Един пациент може да има няколко синдрома. Например, хронични инфекциозни заболявания (инфекциозен синдром) може да предизвика имунна недостатъчност и имунен дефицит може да се прояви предразположение към инфекциозни заболявания и рак (синдром на рак). Предразположението към инфекции може да възникне на фона на вторичен имунен дефицит, който се разви в резултат на лимфопролиферативно заболяване, например левкемия. Има три основни групи патологични промени в имунната система:

• количествената или функционалната недостатъчност на една или друга връзка на имунитета, която води до развитие на състояние на имунна недостатъчност;
• нарушение в разпознаването на антигена от имунната система, което води до развитие на автоимунни процеси;
• хиперреактивен или "перверзен" имунен отговор, проявен от развитието на алергични заболявания.

Има скрининг (тестове на ниво 1) и квалификационни (тестове на 2-ро ниво) методи на имунодиагностика. Първите съществуват, за да установят нарушения в имунната система, а втората - да установят механизмите, свързани с тяхното прилагане с цел по-нататъшна имунокорекция.

B-клетъчна връзка на имунитет

Методи за скрининг

• Определяне на относителния и абсолютния брой на В-лимфоцити чрез имунофлуоресценция или поточна цитометрия, използвайки моноклонални антитела срещу В-клетъчни антигени (CD19, CD20, където CD - клъстера на диференциация). Съдържанието на В-лимфоцити е нормално при възрастни: 8-19% от общия брой левкоцити или 190-380 клетки / μl. Увеличаването съдържанието на лимфоцити настъпва при остри и хронични бактериални и гъбични инфекции, хронично чернодробно заболяване, системни заболявания на съединителната тъкан, хронична лимфоцитна левкемия, множествена миелома.
• Определяне на концентрацията на имуноглобулини nespespetsificheskih (F, F, G, Е) чрез проста радиална имунодифузия, или turbometrii нефелометрия, радиоимуноанализ или ензимен имуноанализ (EIA). Норми за възрастни: имуноглобулин (Ig) A 0.9-4.5 g / l. IgM 03-3.7 g / 1. IgG 8.0-17 g / 1. Увеличаването на концентрацията на имуноглобулини става при същите патологични състояния, при които се наблюдава повишаване на съдържанието на В лимфоцитите. Намаляването на концентрацията на имуноглобулини е вродена хипогамаглобулинемия, тумори на имунната система, отстраняване на далака, загуба на протеин, при заболявания на бъбреците или червата, лечение с цитостатици и immunodepreesantami.

Определяне на методи

• Определяне на циркулиращи имунни комплекси в кръвта чрез селективно утаяване в полисилен гликол, последвано от спектрофотометрично измерване на плътността (нормално 80-20 UE). Увеличаването на циркулиращите имунни комплекси е характерно за остри бактериални, гъбични, вирусни инфекции, автоимунни, имунокомплексни заболявания, серумна болест, алергични реакции от тип 3;
• Определяне на специфични имуноглобулини в кръвта по отношение на бактериални и вирусни антигени, дезоксирибонуклеиновата киселина (ДНК) в автоимунни заболявания, идентифицирането на сперматозоиди (автоимунен стерилитет) и protivopochechnyh антитела (пиелонефрит и гломерулонефрит) чрез радиална имунодифузия или ELISA.
• Определяне на антитеспермични антитела в сперматозоидите [MAR-тест (смесена антиглобулинова реакция)], нормата е отрицателна.
• Определяне на концентрацията на имуноглобулини в урината с цел диференциална диагноза между пиелонефрит и гломерулонефрит (селективност на протеинурията).
• Определяне съдържанието на IgE в сока на простатата за диагностициране на алергичен простатит чрез радиална имунодифузия или ELISA. 
• Изследвания в blasttransformation реакция реакция на лимфоцити на В-клетъчен митоген на (митоген за стимулиране на blasttransformation реакция на В-лимфоцитите в присъствието на Т-лимфоцити), където стандартната стойност от 95-100%.

Т-клетъчна връзка на имунитета

Методи за скрининг

• Определяне на относителния и абсолютния брой на реакционната зрял CD3 Т лимфоцити чрез имунофлуоресценция или поток цитофлуорометрия като се използва анти-SDZ моноклонални антитела. Нормални възрастни 58-76%, или 1100-1700 клетки / мл. Намаляване на броя на Т-лимфоцитите индикатор провал клетъчен имунитет. Това е характеристика на няколко вторични и първични имунодефицитни (хронични бактериални и вирусни инфекции: туберкулоза, синдром на придобита имунна недостатъчност, рак, хронична бъбречна недостатъчност, травма, стрес, стареене, недохранване, лечение с цитотоксични лекарства, йонизираща радиация). Увеличаването на броя на Т-лимфоцити е на фона на имунната хиперактивност или лимфопролиферативни заболявания. При възпаление на броя на Т-лимфоцити първо се покачва и след това намалена. Не намаляване на Т-лимфоцити показва, хронично възпаление.
• Оценка на субпопулациите на лимфоцитите.
  • Определяне на броя на Т-помощниците (анти-СО4 антитяло). Обикновено 36-55% или 400-1100 клетки / μl. Увеличаването на броя на тези клетки се наблюдава при автоимунни заболявания, болестта на Waldenstrom, активиране на имплантация на антиграфт; намаляване на броя на Т-хелперни клетки настъпва при хронични бактериални, вирусни, протозойни инфекции, туберкулоза, синдром на придобита имунна недостатъчност, злокачествени заболявания, изгаряния, травма, недохранване, стареене, лечение цитостатици, йонизиращо лъчение.
  • Определяне на броя на Т-супресорите (анти-CD4 антитяло). Обикновено, 17-37% или 300-700 клетки / μl. Увеличаване на броя на супресорната Т настъпва при същите условия, при които намаляване на броя на Т-хелперните клетки и тяхното намаляване при същите условия, при които съдържанието на Т-хелперните клетки се увеличава.
  • Имунорегулиращ индекс CD4 / CD8, в нормата 1,5-2,5. Хиперактивност при честота над 2,5 (алергични и автоимунни заболявания); хипоактивност - по-малко от 1,0 (предразположеност към хронични инфекции). При настъпването на възпалителния процес индексът на имунорегулацията се повишава и когато се понижи, той се нормализира.

Определяне на методи

• Определяне на броя на естествените убийци (NK клетки) - анти-CD16 и анти-CD56-антитела. Нормата за CD 16-лимфоцитите е 6-26%, CD56 - 9-19%. Увеличаването на броя на NK-клетки се среща в отхвърляне на присадка, намаляване - в вирусни инфекции, рак, първични и вторични имунодефицитни, изгаряния, травма и стрес, лечение с цитостатици и йонизиращо лъчение. 
• Определяне на броя на Т-лимфоцитите с рецептора за интерлевкин-2 (активиращ маркер) - анти-CD25 антитела. Нормата е 10-15%. Едно увеличаване на техния брой е наблюдавана при алергични заболявания, отхвърляне на трансплантант, реакция на тимус-зависими антигени, по време на острата първична инфекция, намаляването - при същите заболявания, които включват намаляване на броя на NK-клетки.
• Изследване на експресията на маркера за активиране - хистосъвместима молекула от клас II HLA-DR. Повишена експресия възниква при възпалителни процеси, при пациенти с хепатит С, целиакия, сифилис, остри респираторни инфекции.
• Оценка на апоптозата на лимфоцитите. Индикация на готовността на лимфоцитите апоптозата могат да бъдат идентифицирани чрез тяхната експресия на повърхността Fas-рецептор (CD95) в митохондриите и BD-2 протоонкоген. Апоптозата се оценява чрез обработка лимфоцити две флуоресцентни багрила: пропидиев йодид, който се свързва с ДНК фрагментите и анексин Y, свързване с фосфатидилсерин в клетъчната мембрана се появява в началото на апоптоза. Оценката на резултатите се извършва на поток цитофлуориметър. Изчисляването на резултатите се основава на съотношението на клетките, оцветени с различни багрила. Неоцветени клетки са жизнеспособни клетки, свързани само с Анексин на Y, - ранни признаци на апоптоза, с пропидиев йодид и анексин I - края на прояви на апоптоза, оцветени само пропидиев йодид показва некроза.
• Оценка на пролиферацията на Т-лимфоцити in vitro.
  • Промяната в клетъчната бластогенеза е реакция на бласт-трансформацията на лимфоцитите. Левкоцитите се инкубират с всеки митоген от растителен произход (лектини). По-често използван фитохемаглутинин в продължение на 72 часа, след това направете смазка, оцветете го и бройте броя на взрива! Индексът на стимулиране е съотношението на процента на трансформираните клетки в експеримента (култура с фитохемаглутинин) спрямо процента на трансформираните клетки в контролата (култура без фитохемаглутинин). Реакцията на бласт-трансформацията на лимфоцитите може да бъде оценена чрез включване на радиоактивен маркер (ZN-тимин) в култивирани клетки, тъй като ДНК синтеза се увеличава при разделяне на клетките. Нарушенията в пролиферативния отговор се проявяват както при първични, така и при вторични имунодефицити, свързани с инфекции, онкологични заболявания, бъбречна недостатъчност и хирургични интервенции.
  • Оценката на тези проучвания, експресията на маркерите за активиране (CD25, рецептор на трансферин до - CD71) молекули и МНС клас II HLA-DR, които са по същество отсъствие на покой Т-лимфоцити. Т лимфоцити, стимулирани с фитохемаглутинин след 3 дни експресионни активиране маркери бяха анализирани чрез директна или индиректна имунофлуоресценция, поточна цитометрия с помощта на моноклонални антитела, секретирани рецептори.
  • Измерване на количеството на медиатори синтезира от активирани Т лимфоцити [интерлевкин (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, гама-интерферон, и т.н.], чрез радиоимуноанализ или ELISA. Особено важно е оценката на концентрацията на y-интерферон и IL-4 като маркери на TH и Th2 в супернатанта на активираните култури и в клетката. Ако е възможно, е полезно да се определи експресията на гена за съответния цитокин от нивото на пратеник рибонуклеинова киселина в производството на клетки и експресия на рецептора интензитети за съответните цитокини на треонин.
    
• Реакцията на инхибиране на миграцията на лимфоцитите. Сенситизирани Т-лимфоцити в реакцията с лимфокини, освобождаващи антиген, включително фактори. Инхибиране на миграцията на лимфоцитите. Феноменът на инхибиране се наблюдава, когато митогените се въвеждат в културата на клетките. Оценката на степента на инхибиране дава възможност да се прецени способността на лимфоцитите да освобождават цитокини. Обикновено честотата на миграция, в зависимост от специфичния митоген, е 20-80%.
• Оценка на цитотоксичността на NK клетките. Определя способността на естествените убийци да убиват целевите клетки на еритромелоидната линия К-562. Ако се оценява антитяло-зависимата цитотоксичност, се използват целеви клетки, покрити с IgG антитела. Таргетните клетки се маркират с ЗН-уридин и се инкубират с ефекторни клетки. Смъртта на прицелните клетки се оценява от освобождаването на радиоактивния маркер в разтвора. Намаляването на цитотоксичността се наблюдава при злокачествени неоплазми. В някои случаи, когато е необходима прогноза за ефективността на лечението с интерлевкини, цитотоксичността на NK клетките се оценява, когато се инкубира с определени цитокини.

Изследване на функцията на фагоцитите

Методи за скрининг

Абсорбция интензитет фагоцити Изследване на микробни клетки (фагоцитоза на латексови частици, тест култура ауреус, Ешерихия коли, или микроорганизми, изолирани от пациента). Чрез центрофугиране на хепаринизираната кръв се изолира суспензия от левкоцити, се добавя серум от IV кръвна група за оксанизация (оксасини са протеини, които усилват фагоцитозата). Микробната суспензия се разрежда, смесва се с левкоцити и се инкубира в продължение на 120 минути, вземане на проби за анализ след 30.90.120 минути след началото на инкубацията. От избраните левкоцитни суспензии се прави петно. Определете следните показатели за фагоцитоза:

• фагоцитен индекс - процентът на клетките, които са навлизали в фагоцитоза за 30 минути и 120 минути инкубация; нормативна стойност на фагоцитния индекс (30) 94% от фагоцитния индекс (120) - 92%;
• фагоцитно число - средният брой бактерии, които са вътреклетъчни; нормативната стойност на фагоцитно число (30) 11%, фагоцитно число (120) - 9,8%;  
• коефициент на фагоцитно число - съотношение фагоцитно число (30) към фагоцитно число (120); нормално 1,16;
• бактерицидният индекс на неутрофилите е съотношението на броя на микробите, убити във фагоцитите, спрямо общия брой взети микроби; в нормата от 66%.

Определяне на методи

• Изследването на бактерицидната активност на фагоцитите в теста с нитрозин тетразол (NST) е NST теста. Към левкоцитите се добавя жълто оцветяващ азотен оксид тетразол. Когато багрилото се абсорбира от неутрофилите, процесът на редукция се осъществява под действието на свободни радикали на кислород, което води до синьо оцветяване. Реакцията се провежда в плоча с 96 гнезда с плоско дъно. В първите три кладенчета със смес от НСТ и левкоцити се прибавя разтвор на Hanks (спонтанен HCT), в последния - латексови частици; инкубират се при 37 ° С в продължение на 25 минути. Резултатите се отчитат при 540 nm на четящото устройство и се изразяват в конвенционални единици. Изчислете стимулиращия фактор (K _st ), равен на съотношението на оптичната плътност в стимулираните ямки до средната оптична плътност в ямките без стимулация. При здрави хора _{HCT spont} = 90 ± 45 UE, NST _Stim = 140 ± 60 UE. K _st = 1.78 ± 0.36.
• Изследване на адхезионни молекули. С помощта на поточна цитофлуориметрия се определя експресията на повърхностните антигени CD11a / CD18, CD11b / CD18, CD11c / CD18. Имунодефицитностите с нарушение на адхезията се проявяват чрез рецидивиращи инфекции, бавно излекуване на рани и отсъствие на гной в огнищата на инфекцията.

Проучване на системата на комплемента

Методи за скрининг

Определяне на хемолитичната активност на комплемента - изследване на класическия път на активиране на комплемента. Различни разреждания на серум на пациента и здрав човек се добавят към еритроцитите на овен, покрит с антитела. Единица на хемолитична активност се приема като обратна на разреждането на серума, в който 50% от еритроцитите са унищожени. Степента на хемолизата се оценява фотометрично чрез добива на хемоглобин в разтвора. Намаляване на хемолитичната активност на комплемента се наблюдава при системен лупус еритематозус с бъбречно засягане, остър гломерулонефрит. Комбинирани имунодефицити, миастения гравис, вирусен хепатит, лимфоми, увеличение - с обструктивна жълтеница, тиреоидит Хашимото. Ревматизъм, ревматоиден артрит, нодуларен периартерит. Дерматомиозит, миокарден инфаркт, улцерозен колит, синдром на Reiter, подагра.

Определяне на методи

• Определяне на компонентите на комплемента. Количественото определяне се извършва по метода на радиална имунодифузия и нефелометрия.
  Изследването не е информативно, освен ако не се променят антигенните свойства на компонентите на комплемента.
• Установено е, че Clq-компонентът на комплемента подобрява фагоцитозата и медиира клетъчната цитотоксичност. Намаляването му се наблюдава при заболявания на имунните комплекси, системния лупус еритематозус, гнойни инфекции и тумори.
• Компонентът С3 участва в активизирането на класическия и алтернативния път на допълване. Намаляването на концентрацията му е свързано с хронични бактериални и гъбични инфекции, наличието на циркулиращи или тъканни имунни комплекси.
• Компонентът C4 участва в активизирането на класическата пътека. Намаляването на концентрацията му е свързано с продължително активиране на комплемента от имунните комплекси и намаляването на концентрацията на С1 инхибитора, който контролира активирането на класическия път на комплемента. СС дефицит настъпва при системен лупус еритематозус, повишение на С4 възниква при бъбречно заболяване, отхвърляне на трансплантат, остро възпаление и заболявания на стомашно-чревния тракт.
• С5а е малък фрагмент от С5 молекулата, отделена от нея в резултат на активиране на комплементарната система. Увеличаването на концентрацията се наблюдава при възпаление, сепсис, атопични и алергични заболявания.
• С1-инхибиторът е мултифункционален фактор. Той контролира активирането на С1 компонента на комплемента, инхибира активността на каликреин, плазмин и активиран фактор Hageman, протеази С1 и Or. Дефицитът на С1-инхибитор води до ангиоедем.
• допълнителни проучвания. Към стандартния серум, в който липсва компонент на комплемента, се прибавя тестовият серум и се определя хемолитичната активност на комплемента. Ако хемолитичната активност не се възстанови до нормална стойност, се смята, че активността на този компонент на комплемента в тестовия серум е намалена.

[1], [2], [3], [4], [5], [6]