Молекулярни генетични методи за диагностициране на наследствени заболявания

Методи ДНК технология се използват за определяне локализацията в определена хромозома на мутантния ген, отговорен за произхода на някои форми на наследствени заболявания. Тъй като генът е ДНК сегмент и генна мутация - увреждане на първичната структура на ДНК (мутация се разбира от всички промени в ДНК последователността, независимо от тяхното местоположение и влиянието на отделните жизнеспособност) след сондиране препарати хромозоми метафаза пациенти наследствено заболяване, е възможно да се установи локализиране на патологичен ген. Методи на молекулярната генетика да създадат възможност за диагностициране на заболявания на променена ДНК структура, те позволяват да се определи локализацията на наследствени заболявания. Молекулярните генетични методи могат да разкрият мутации, свързани с подмяната дори на единична база.

Най-важният етап в идентифицирането на гена е неговата изолация. ДНК може да бъде изолирана от всякакъв вид тъкани и клетки, съдържащи ядра. Етапите на изолиране на ДНК включват бързо лизиране на клетките чрез центрофугиране с отстраняване на фрагменти от клетъчни органели и мембрани, ензимно унищожаване на протеини и тяхното извличане от разтвора с фенол и хлороформ, концентрация на ДНК чрез утаяване в етанол.

В генетичните лаборатории ДНК най-често се изолира от кръвни левкоцити, при които пациентът е взет 5-20 ml венозна кръв в стерилна тръба с антикоагулантен разтвор (хепарин). След това левкоцитите се разделят и обработват съгласно стъпките, описани по-горе.

Следващият етап на материал препарат за изследване - ДНК "нарязани" на фрагменти на обекти с строго специфичен базова последователност се извършва с помощта на бактериални ензими - рестрикционни ендонуклеази (рестрикционни ензими). Рестрикционни ензими разпознават специфични последователности на 4-6, най-малко 8-12 нуклеотиди в двойно-верижна ДНК молекула и неговите разделят на фрагменти от тези последователности локализират сайтове наричат рестрикционни сайтове. Брой произведени рестрикционни фрагменти от ДНК определя от честотата на възникване на рестрикционни сайтове и фрагменти с размер - естеството на разпределението на тези места по дължината на оригиналната ДНК молекула. Колкото по-често се намират местата на рестрикция, толкова по-къси са ДНК-фрагментите след ограничаване. В момента има повече от 500 различни вида рестрикционни ензими от бактериален произход, и всеки от тях ензим признава неговата специфична последователност от нуклеотиди. В бъдеще рестрикционните сайтове могат да се използват като генетични маркери за ДНК. Получените ДНК рестрикционните фрагменти могат да бъдат сортирани по дължина чрез електрофореза в агароза или полиакриламиден гел, и по този начин могат да се определят тяхното молекулно тегло. Обикновено за откриване на ДНК в гела се използва от конкретен оцветяване (обикновено етидиев бромид) и Преглед на гела при преминаваща светлина ултравиолетовия спектър. Местоположенията на локализирането на ДНК имат червен цвят. Въпреки това, човек в обработката на няколко ДНК рестрикционните ендонуклеази образува толкова много фрагменти с различни дължини, че те не могат да бъдат разделени чрез електрофореза, не е възможно за визуално идентифициране на отделните ДНК фрагменти за electrophoregram (произведен равномерно оцветяване по цялата дължина на гела). Следователно, метод за хибридизация с маркирани ДНК проби се използва за идентифициране на желаните ДНК фрагменти в такъв гел.

Всеки едноверижен сегмент на ДНК или РНК е способен да се свърже (хибридизира) с неговата комплементарна верига, а гуанинът винаги се свързва с цитозин, аденин с тимин. Това е образуването на двойно-верижна молекула. Ако едноверижно копие на клонирания ген е белязано с радиоактивен маркер, ще бъде получена сонда. Сондата е в състояние да намери допълнителен сегмент от ДНК, който след това лесно се идентифицира чрез радиоавтография. Радиоактивна сонда, добавена към лекарство с разтеглени хромозоми, позволява генът да бъде локализиран на определена хромозома: някои ДНК проби могат да бъдат идентифицирани с ДНК сонда в Southern blotting. Хибридизацията възниква, ако тестовата част на ДНК съдържа нормален ген. В случая, когато има анормална последователност от нуклеотиди, т.е. Съответните хромозомни структури съдържат мутантен ген, няма да се осъществи хибридизация, която позволява да се определи локализацията на патологичния ген.

За да се получат ДНК проби, се използва методът на генно клониране. Същността на метода се състои в това, че ДНК фрагмента, съответстващ на ген или област на гена вмъква в частицата на клониране, обикновено бактериален плазмид (кръгова екстрахромозомен ДНК настоящето в бактериални клетки и провеждане гени за резистентност към антибиотици), и след това бактериите като плазмид с интегрирана човешкия геном, размножава. Поради процесите на синтез е възможно да се получи плазмид милиарди копия на човешкия ген или част от него.

Освен това, ДНК копия, белязани с радиоактивен маркер или флуорохроми, се използват като сонди за търсене на допълнителни последователности сред групата изследвани ДНК молекули.

Понастоящем има много разновидности на методи, използващи ДНК сонди за диагностициране на генни мутации.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],