Лабораторна диагностика на остеоартрит

В повечето случаи пациентите с остеоартрит нямат промени в кръвните и уринарните изследвания, с изключение на случаите на синовит със значителен излив, когато може да се наблюдава повишаване на СУЕ, хипергамаглобулинемия, повишаване на нивото на показателите на острата фаза - CRP, фибриноген и др. При изследване на синовиалната течност не се установяват съществени разлики от нормалните показатели.

През последните години се провежда интензивно търсене на възможни биологични маркери (БМ) на деградация и репарация на ставните тъкани (предимно хрущялни и костни). БМ трябва да отразяват тези динамични промени, да служат като предсказващи фактори за прогнозата на остеоартрозата и маркери за ефективността на патогенетичното лечение. Откриването на нови и по-задълбочено проучване на известни биологични маркери ще позволи по-добро разбиране на механизмите на патогенезата на остеоартрозата. Основната задача на използването на биологични маркери за метаболизма на хрущяла обаче е да се оценят хондропротективните свойства на лекарствата и да се наблюдава лечението с лекарства, принадлежащи към групата DMO AD - "модифициращи заболяването".

При остеоартрит патологичните промени настъпват главно в ставния хрущял, както и в субхондралната кост, синовиалната мембрана и други меки тъкани на ставата. Тъй като възможностите ни за директно изследване на тези структури са ограничени, най-важните източници за събиране на биологични маркери са кръв, урина и синовиална течност.

Изследването на урината е най-предпочитано, тъй като не включва никакви инвазивни процедури. Според нас идеалният материал за изследване е дневната урина. Анализът на сутрешната порция урина би бил по-подходящ, но възможността за използването му се основава само на факта, че този вид анализ се използва за определяне на биологични маркери на костния метаболизъм при остеопороза: известно е, че биологичните маркери са подвластни на циркадните ритми и пиковата концентрация на биологични маркери на костния метаболизъм се наблюдава през нощта. Понастоящем в литературата няма информация за циркадните ритми на биологичните маркери на меките тъкани и хрущялите, така че окончателното решение за избора на адекватен тест за урина ще бъде взето след провеждане на подходящи изследвания.

Кръвните изследвания са рутинни клинични изследвания. Някои биологични маркери вече се определят в кръвта, като например индекси на острата фаза, докато други може да бъдат включени в стандартния списък с биохимични изследвания в близко бъдеще. За всеки биологичен маркер е необходимо да се уточни в кой компонент на кръвта трябва да се определи - плазма или серум. Резултатите от изследванията показват, че концентрацията на биологични маркери в кръвната плазма се различава значително от тази в серума. Биологичните маркери обикновено се определят в кръвен серум. Според В. Раян и др. (1998) концентрациите на биологични маркери в кръв, взета от вена близо до засегнатата става и от по-отдалечена вена, са различни. Тези данни показват необходимостта от стандартизиране на кръвните проби за изследване на биологични маркери.

Според LJ Attencia et al. (1989), хрущялът на синовиалните стави на възрастен човек съставлява само 10% от общата маса на хиалиновия хрущял в тялото, включително междупрешленните дискове. По този начин, определянето на биологични маркери в кръвта и урината отразява системния метаболизъм, а не локалните промени в ставата, засегната от остеоартроза. Синовиалната течност е най-близо до патологичния фокус при остеоартроза и вероятно най-точно отразява процесите, протичащи в засегнатата става. Концентрацията на биологични маркери в синовиалната течност може да бъде значително по-висока, отколкото в кръвта, което означава, че е по-лесна за определяне. Примерите включват епитоп 846 на агрекан - в синовиалната течност той е 40 пъти повече, отколкото в кръвния серум, хрущялни олигомерни матрични протеини (COMP) - 10 пъти повече, отколкото в кръвния серум. Продуктите от разграждането в синовиалната течност по-точно отразяват катаболните процеси в ставния хрущял. Оттичането на молекули от синовиалната течност през локалната лимфна система може да доведе до намаляване на размера им и дори до тяхното разрушаване.

Въпреки инвазивността на техниката за събиране на синовиална течност, свързана с редица възможни усложнения, стойността на определянето на биологични маркери при нея е очевидна. За да се избегнат проблеми с така наречената суха става, 20 ml изотоничен разтвор на NaCl може да се инжектира в ставата непосредствено преди събирането на течността. Веднага след инжектирането на изотоничния разтвор, пациентът трябва да свие и разгъне крайника в ставата 10 пъти, последвано от бърза аспирация на разредената синовиална течност. Според EM-JA Thonar (2000), подобно разреждане на синовиалната течност влияе върху метаболизма в ставния хрущял. Резултатите от проучването на FC Robion et al. (2001) обаче показват, че многократното промиване на коленните стави на конете не причинява значителни промени в метаболизма на хрущяла. Тези данни със сигурност изискват потвърждение. Следователно, за всеки биологичен маркер, ефектът от промиването на ставите върху промените в неговата концентрация трябва да се определи на етапа на предклинични изследвания върху животни.

Следващият важен момент е да се определи времето на полуразпад в синовиалната течност и кръвта за всеки биологичен маркер. Без такива данни интерпретацията на резултатите от теста ще бъде трудна. Обикновено полуживотът на биологично активните вещества в кръвта е по-кратък, отколкото в други течни среди, поради ефективното им елиминиране от черния дроб и бъбреците. Следователно, за всеки биологичен маркер е необходимо да се определи и пътят на елиминиране. По този начин, N-пропептидът на колаген тип III се екскретира от черния дроб чрез рецепторно-медиирана ендоцитоза, а негликозилираните колагенови фрагменти се екскретират главно чрез урината, както и остеокалцинът. Има рецептори за гликозаминогликани върху ендотелните клетки на синусите на чернодробните лобули, така че хиалуроновата киселина и протеогликаните се елиминират от черния дроб. Полуживотът на хиалуроновата киселина в кръвта е 2-5 минути. Наличието на синовит може да ускори елиминирането на биологични маркери от ставите, въпреки че проучване при зайци не е открило значителни разлики в клирънса на протеогликаните със или без синовит. Следователно, трябва да се изследва ефектът на възпалението върху промените в концентрацията на биологични маркери в телесните течности.

Бъбреците селективно филтрират биологични маркери. По този начин, гликозаминогликаните, които носят голям отрицателен заряд, може да не проникнат през бъбречната базална мембрана, докато гликозаминогликани като хондроитин-6-сулфат и хондроитин-4-сулфат се откриват в урината.

В допълнение към патологията (по-специално остеоартрит), редица фактори могат да повлияят на концентрацията на биологични маркери в телесните течности:

1. Циркадните ритми са изследвани само за малък брой биологични маркери. Те са изследвани за маркери на костния метаболизъм. Така, пиковата концентрация на остеокалцин настъпва през нощта, а тази на колагеновите кръстосани връзки сутрин - в 8 часа. При ревматоиден артрит пиковата активност на IL-6 също настъпва през нощта (около 2 часа) и по-рано от тази на остеокалцина. Тези данни представляват известен интерес във връзка с участието на IL-6 във възпалението и физиологията на костната тъкан. TNF-α, напротив, няма циркадни ритми. Рецепторите на този цитокин обаче могат да им се подчиняват.
2. Перисталтика. Хиалуроновата киселина се синтезира от синовиалните клетки (както и от много други клетки) и е потенциален маркер за синовит при остеоартрит и ревматоиден артрит. Най-високата концентрация на хиалуронат обаче се открива в чревната лимфна система. Не е изненадващо, че концентрацията на циркулираща хиалуронова киселина може да се увеличи след хранене. Следователно, вземането на кръвни проби за определяне на биологични маркери трябва да се извършва на гладно или 3 часа след хранене. А ефектът на перисталтиката върху нивото на биологичните маркери в кръвта изисква проучване.
3. Физическата активност сутрин след сън води до повишаване на концентрацията на хиалуронова киселина в кръвта, MMP-3 и епитопа кератан сулфат при здрави индивиди. Физическата активност може да промени концентрацията на някои маркери както в синовиалната течност, така и в кръвния серум. Такова повишаване е по-изразено при пациенти с ревматоиден артрит, освен това концентрацията на биологични маркери корелира с клиничното състояние на тези пациенти.
4. Заболявания на черния дроб и бъбреците. Чернодробната цироза причинява значително повишаване на серумните нива на хиалуронова киселина и вероятно повлиява елиминирането на протеогликани. Известно е, че бъбречните заболявания повлияват концентрациите на остеокалцин. Този въпрос също изисква по-задълбочено проучване.
5. Възраст и пол. По време на растежа активността на клетките на растежните пластинки се увеличава, което е съпроводено с повишаване на концентрацията на скелетни биологични маркери в кръвния серум. Пример за това е повишаването на концентрацията на агреканови фрагменти и колаген тип II в периферната кръв и урината на растящи животни. По този начин интерпретацията на анализите на биологични маркери при деца и юноши с опорно-двигателни заболявания е трудна. За много биологични маркери е установено повишаване на концентрацията им с напредване на възрастта. При мъжете концентрацията на биологични маркери значително надвишава тази при жените в хрущялната и костната тъкан. Освен това, при жените в менопаузалния и постменопаузалния период могат да се очакват промени в концентрацията на биологични маркери на хрущялния метаболизъм, подобни на наблюдаваните в костната тъкан.
6. Хирургичните процедури също могат да повлияят на нивата на биологичните маркери и този ефект може да продължи няколко седмици.

Концепцията за биологични маркери на остеоартрозата се основава на предположението, че те отразяват определени аспекти на метаболитните процеси в ставните тъкани. Връзката между концентрациите на биологични маркери в телесните течности и метаболизма на хрущялните, синовиалните и други тъкани обаче се е оказала много сложна.

Например, концентрацията на маркери за разграждане на ECM на ставния хрущял в синовиалната течност може да зависи не само от степента на разграждане на самата матрица, но и от други фактори, като например степента на елиминиране на молекулярни фрагменти от синовиума, която вече беше спомената по-горе, както и от количеството хрущялна тъкан, останала в ставата.

Въпреки горепосочените факти, концентрацията на биологични маркери в синовиалната течност като цяло корелира с метаболизма на ECM молекулите на ставния хрущял. Например, промените в концентрацията на агреканови фрагменти, епитоп 846, COMB и C-пропептид на колаген II в синовиалната течност след увреждане на ставата и по време на развитието на остеоартроза са в съответствие с промените в интензивността на метаболизма на агрекан, COMB и колаген II в експериментални модели на остеоартроза при животни/и in vivo и в ставния хрущял на пациенти с остеоартроза/и in vitro.

Идентифицирането на специфични източници на молекулни фрагменти е сложен процес. Повишеното освобождаване на молекулни фрагменти може да възникне както поради общо увеличение на процесите на разграждане, които не се компенсират от синтетични процеси, така и поради повишено разграждане с едновременно увеличаване на интензивността на синтеза на същите ECM молекули; във втория случай концентрацията на ECM молекулите не се променя. Следователно е необходимо да се търсят маркери, специфични за разграждането и синтеза. Пример за първото са фрагментите на агрекан, а за второто е C-пропептидът на колаген 11.

Дори ако даден биологичен маркер е свързан със специфичен аспект на метаболизма, е необходимо да се вземат предвид специфичните характеристики на този процес. Например, идентифицираните фрагменти могат да се образуват в резултат на разграждане на de novo синтезирана молекула, която все още не се е интегрирала във функционалния ECM, молекула, която току-що е интегрирана в ECM, и накрая постоянна ECM молекула, която е важна функционална част от зрялата матрица. Друг проблем е дефинирането на специфичната матрична зона (перицелуларна, териториална и интертериториална матрица), която е служила като източник на биологични маркери, открити в синовиалната течност, кръвта или урината. In vitro проучванията показват, че интензивността на метаболизма в отделните зони на ставния хрущял ECM може да бъде различна. Изследването на определени епитопи, свързани със сулфатирането на хондроитин сулфат, може да помогне за идентифициране на популацията на de novo синтезирани агреканови молекули.

Може да се предположи, че появата на фрагменти от молекули, нормално присъстващи в хрущялния ECM в синовиалната течност, е свързана с метаболизма на хрущялната матрица. Това обаче не винаги е така, тъй като зависи от редица фактори, по-специално от това доколко концентрацията на дадена молекула в ставния хрущял надвишава тази в други ставни тъкани и доколко интензивността на нейния метаболизъм в хрущяла надвишава тази в други ставни тъкани. По този начин общата маса на агрекана в ставния хрущял значително надвишава тази например в менискуса на колянната става, докато общата маса на COMB в менискуса практически не се различава от тази в ставния хрущял. Както хондроцитите, така и синовоцитите произвеждат стромелизин-1, но общият брой клетки в синовиалната мембрана надвишава този в хрущяла, така че значителна част от стромелизин-1, открит в синовиалната течност, най-вероятно е със синовиален произход. По този начин идентифицирането на специфичния източник на биологични маркери е изключително трудно и често невъзможно.

При изучаване на биологични маркери в кръвен серум и урина възниква проблемът с определянето на евентуалния им екстраартикуларен източник. Освен това, в случай на моноартикуларно увреждане, биологичните маркери, секретирани от засегнатата става, могат да се смесят с маркери, секретирани от непокътнати стави, включително контралатерални. Ставният хрущял съставлява по-малко от 10% от общата маса на хиалиновия хрущял в тялото. По този начин, определянето на биологични маркери в кръвта и урината може да бъде оправдано по-скоро при полиартикуларни или системни заболявания (във връзка с остеоартрозата - при генерализирана остеоартроза).

Изискванията към биологичните маркери зависят от това дали се използват като диагностичен, прогностичен или оценъчен тест. Например, диагностичният тест определя разликите между здрави индивиди и пациенти с остеоартрит, което се изразява в чувствителност и специфичност на теста. Прогностичният тест идентифицира индивиди в кохорта, които е най-вероятно да прогресират бързо заболяването. И накрая, оценъчният тест се основава на способността на маркера да наблюдава промените във времето при отделен пациент. Освен това, биологичните маркери могат да се използват за определяне на чувствителността на пациентите към определено лекарство.

Първоначално се е предполагало, че биологичните маркери могат да служат като диагностични тестове, които биха помогнали за разграничаване на става, засегната от остеоартроза, от непокътната, както и за провеждане на диференциална диагностика с други ставни заболявания. По този начин определянето на концентрацията на кератан сулфат в кръвния серум се е считало за диагностичен тест за генерализирана остеоартроза. Последвалите проучвания обаче показват, че този биологичен маркер може да отразява разграждането на хрущялните протеогликани само в някои ситуации. Оказа се, че концентрациите на биологични маркери в кръвния серум зависят от възрастта и пола на изследваното лице.

Предполагаеми биологични маркери на метаболизма на ставната тъкан в синовиалната течност и кръвния серум на пациенти с остеоартрит

Биологичен маркер	Процес	В синовиалната течност (линкове)	В кръвния серум (линкове)
1. Хрущял
Агрекан
Фрагменти от основни протеини	Разграждане на агрекана	Ломандър Л.С. и др., 1989; 1993	Thonar EJMA et al., 1985; Campion GV et al., 1989; МехрабанФ. et al., 1991; Spector TD et al., 1992; Lohmander LS., Thonar EJ-MA, 1994; Poole AR et al., 1994) t (Poole AR et al., 1994)
Епитопи на основни протеини (специфични за зоната на разцепване неоепитопи)	Разграждане на агрекана	Sandy JD et al., 1992; LohmanderLS. et al., 1993; LarkM.W. и др., 1997
Епитопи на кератонични сулфати	Разграждане на агрекана	Кампион Г.В. и др., 1989 г.; Белчър К. и др., 1997 г.
Епитопи на хондроитин сулфати (846, ЗВЗ, 7D4 и DR.)	Синтез/разграждане на агрекан	Poole AR et al., 1994; HazellP.K. et al., 1995; Slater RR Jr. et al., 1995; Plaas AHK et al., 1997; 1998 г.; Lohmander LS. и др., 1998
Съотношението на хондроитин-6 и хондроитин-4 сулфати	Синтез/разграждане на агрекан	Шинме и М. и др. 1993 г.
Малки протеогликани	Разграждане на малки протеогликани	Вич-ПремП. и др., 1992 г.
Матрични протеини на хрущяла
ХОМП	Разграждане на HOMP	Saxne T., Heinegerd D., 1992"; LohmanderLS. et al., 1994; Petersson IF et al., 1997	Шариф М. и др., 1995 г.
Хрущялни колагени
С-пропептид от колаген тип II	Синтез на колаген II	ShinmeiM. et al., 1993; ЙошихараЙ. et al., 1995; LohmanderLS. и др., 1996
Фрагменти от алфа веригата на колаген тип II	Разграждане на колаген II	Hollander AP et al., 1994; Billinghurst RC et al., 1997; AtleyLM. и др., 1998
ММП и техните инхибитори	Синтез и секреция	От синовиалната мембрана или ставния хрущял?
II. Менисци
ХОМП	Разграждане на HOMP	От ставния хрущял, менискуса или синовиума?
Малки протеогликани	Разграждане на малки протеогликани
III. Синовиална мембрана
Хиалуронова киселина	Синтез на хиалуронова киселина		Голдбърг Р.Л. и др., 1991; Хедин П.-Й. и др., 1991; Шариф М. и др., 1995
ММП и техните инхибитори
Стромелизин (MMP-3)	Синтез и секреция на MMP-3	ЛохманерЛС и др., 1993 г.	ZuckerS. et al., 1994; ЙошихараЙ. и др., 1995
Интерстициална колагеназа (MMP-1)	Синтез и секреция на MMP-1	Кларк И. М. и др., 1993; Ломандър Л. С. и др., 1993	Маникюр Д. Х. и др., 1994 г.
ТИМП	Синтез и секреция на TIMP	Lohmander LS. et al., 1993; Manicourt DH et al., 1994	Yoshihara Y. et al., 1995
N-пропептид от колаген тип III	Синтез/разграждане на колаген III	Шариф М. и др., 1996 г.	Шариф М. и др., 1996 г.

Редица проучвания са демонстрирали разлики в концентрациите на агреканови фрагменти, HOMP и MMP и техните инхибитори в ставната течност на коленните стави на здрави доброволци, пациенти с ревматоиден артрит, реактивен артрит или остеоартроза. Въпреки факта, че авторите демонстрират значителни разлики в средните концентрации на биологични маркери, интерпретацията на данните е трудна, тъй като сравнителният анализ е бил профилен и ретроспективен. Прогностичните свойства на тези тестове е необходимо да бъдат потвърдени в проспективни проучвания.

Биологичните маркери могат да се използват за оценка на тежестта на заболяването или стадия на патологичния процес. В случай на остеоартроза, тежестта на заболяването и неговите стадии се преценяват по резултатите от рентгенови изследвания, артроскопия, както и по тежестта на болковия синдром, ограничаването на функцията на засегнатите стави и функционалния капацитет на пациента. L. Dahlberg et al. (1992) и T. Saxne и D. Heinegard (1992) предлагат използването на някои молекулярни маркери на метаболизма на ставния хрущял за допълнителна характеристика на стадиите на остеоартрозата. Необходими са обаче по-нататъшни изследвания в тази насока, за да се въведат такива биологични маркери в медицинската практика.

Има съобщения за възможното използване на биологични маркери като прогностични тестове. Например, показано е, че концентрацията на хиалуронова киселина (но не и кератан сулфат) в серума на пациенти с остеоартрит на коляното в началото на проучването показва прогресия на гонартрозата през 5-годишното наблюдение. В същата популация от пациенти е показано, че повишеното съдържание на COMB в серума на пациенти с гонартроза през първата година след началото на проучването е свързано с рентгенографска прогресия през 5-годишното наблюдение. Проучвания на биологични маркери при пациенти с ревматоиден артрит показват, че концентрацията на COMB, епитоп 846, хондроитин сулфат в серума е свързана с по-бързо прогресиране на заболяването. Тези резултати, получени при малки групи пациенти, често не демонстрират силата на връзката между нивото на биологичните маркери и прогресията на заболяването, т.е. са необходими допълнителни проучвания, проспективни и върху по-големи кохорти от пациенти.

TD Spector et al. (1997) установяват леко повишаване на серумния CRP при пациенти с ранен остеоартрит и съобщават, че CRP може да е предсказващ фактор за прогресията на остеоартрита. В този случай повишаването на CRP отразява процесите на увреждане на ставната тъкан и може да е свързано с повишаване на хиалуроновата киселина, което също показва прогресия на заболяването. Възможно е синовиалната мембрана да е отговорна за по-голямата част от хиалуроновата киселина, определена в серума, което показва наличието на лек синовит. Повишените концентрации на стромелизин MMP в синовиалната течност и серума на пациенти с остеоартрит и след травма на ставите също могат да бъдат свързани с лек синовит.

Накрая, биологичните маркери могат да се използват като критерии за ефикасност в клиничните изпитвания на лекарства, както и за мониторинг на патогенетичното лечение. Съществуват обаче два взаимосвързани проблема: липсата на лекарства с доказани „структурно-модифициращи“ или „болесто-модифициращи“ свойства се дължи до голяма степен на липсата на надеждни биологични маркери и обратно, липсата на специфични маркери на метаболизма на ставната тъкан се дължи до голяма степен на липсата на контролирани проучвания на лекарства в тези групи.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]