Причини за туберкулоза

Семейство Mycobacteriaceae от разред Actinomycetales съдържа единствения род Mycobacterium. През 1975 г. този род е съдържал около 30 вида, а до 2000 г. този брой вече е достигнал 100. Повечето видове микобактерии са класифицирани като сапрофитни микроорганизми, широко разпространени в околната среда.

Групата на облигатните паразити е незначителна, но практическото ѝ значение е голямо и се определя от видовете, които причиняват туберкулоза при хората и животните. Съществува мнение, че предшествениците на патогенните за хората микобактерии са били древни почвени микобактерии.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Таксономия на микобактериите

Всички микобактерии се разделят на патогенни за хората и опортюнистични.

В клиничната микробиология се използват няколко подхода за класифициране на микобактериите:

• чрез скоростта и оптималната температура на растеж, способността за образуване на пигмент;
• за клинично значими комплекси.

Видовете микобактерии, които причиняват туберкулоза, са обединени в комплекса M. tuberculosis, който включва M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti, M. canettii. Наскоро към него бяха добавени M. pinnipedii и M. sarrae, които са филогенетично свързани с M. microti и M. bovis.

Останалите микобактерии, причиняващи различни микобактериози, се класифицират като нетуберкулозни микобактерии. От тази група се разграничават следните комплекси: M. avium, състоящ се от M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum; M.fortuitum, включващ подвидовете M.fortuitum и M. chelonae, и M. terrae, включително M. terrae, M. triviale и M. nonchromogenicum. Най-важните групи са причинителят на проказа M. leprae, както и причинителят на улцерозни лезии Buruli M. ulcerans.

Тази класификация обединява видове микобактерии с еднакво клинично значение, когато по-фината им диференциация не е от съществено значение. За идентифициране на видове в рамките на групи и комплекси се използват биологични, биохимични и молекулярни методи.

Класификацията на нетуберкулозните микобактерии, основана на културните различия, е разработена от Ръньон през 1959 г. Според нея се разграничават 4 групи микобактерии.

Група I - фотохромогенни микобактерии

Тази група включва микобактерии, които не са пигментирани, когато се отглеждат на тъмно, но придобиват ярко жълта или жълто-оранжева пигментация след излагане на светлина. Потенциално патогенни щамове, принадлежащи към тази група, са M. asiaticum, M. kansasii, M. marinum, M. simiae. Сред микобактериите от тази група има както бързорастящи (M. marinum), така и бавнорастящи (M. asiaticum, M. kansasii). Оптималната температура на растеж варира от 25 ^° C за M. simiae, 32-33 ^° C за M. marinum до 37 ^° C за M. asiaticum.

Най-клинично значимият вид у нас е M. kansasii, който се среща във водни басейни. Щамът M. kansasii (M. luciflavum) причинява заболявания при хората. Той расте в яйчена среда като груби или гладки колонии, с температурен оптимум от 37 ^° C. Морфологично бактериите са с умерена дължина. Досега са описани два варианта на M. kansasii: оранжев и бял. При въвеждане в морски свинчета, M. kansasii причинява инфилтрати и уплътняване на регионалните лимфни възли.

Група II - скотохромогенни микобактерии (от гръцката дума scotos - тъмнина)

Тази група включва микобактерии, които образуват пигмент на тъмно. Скоростта на растеж е 30-60 дни. Към тази група спадат M. aquae (M. gordonae) и M. scrofulaceum.

M. scrofulaceum се счита за потенциално патогенен вид. Върху яйчна среда бактериите от този вид растат като гладки или грапави колонии с оранжев цвят. Морфологично микобактериите са с пръчковидна форма, къси или дълги. Те растат при температура 25-37 ^° C. При децата причиняват увреждане на лимфните възли и белите дробове.

M. aquae (M. gordonae) са класифицирани като сапрофитни скотохромогенни микобактерии. Те растат в яйчна среда като оранжеви колонии при температура 25-37 °C. Морфологично микобактериите са с пръчковидна форма и умерено дълги (>5 μm). Срещат се във водни басейни.

Група III - нефотохромогенни микобактерии

Тази група включва микобактерии, които не образуват пигмент или имат бледожълт цвят, който не се засилва на светлина. Те растат в продължение на 2-3 или 5-6 седмици. Те включват: M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M. terrae, M. gastri, M. hattey, M. bruiiense.

M. avium (птичи микобактерии) растат върху средата на Lowenstein-Jensen като пигментирани или слабо пигментирани колонии при 37 ^° C и 45 ^° C. Морфологично те са пръчици със средна дължина. Те могат да бъдат патогенни за хората и редица лабораторни и домашни животни (напр. свине). Срещат се във вода и почва.

M. xenopi е изолиран от жаба. Младите култури растат като непигментирани колонии. По-късно се появява жълт пигмент. Морфологично те представляват дълги нишковидни пръчици. Растят при температура 40-45 ^° C. Условно патогенни са за хората.

M. terrae са изолирани за първи път от репички. Те растат върху среда на Lowenstein-Jensen и като колонии без пигмент. Оптималната температура на растеж е 37 ^° C. Морфологично са представени от пръчици с умерена дължина, сапрофити.

Група IV - бързорастящи микобактерии

Микобактериите, принадлежащи към тази група, се характеризират с бърз растеж (до 7-10 дни). Те растат под формата на пигментирани или непигментирани колонии, по-често под формата на R-форма. Добър растеж се наблюдава в продължение на 2-5 дни при температура 25 ^° C. Тази група включва потенциално патогенни микобактерии M.fortuitum, както и сапрофитни микобактерии, като M. phlei, M. smegmatis и др. M. fortuitum дава видим растеж върху яйчната среда на 2-4-ия ден под формата на "розетка". Морфологично микобактериите са представени от къси пръчици. В средата на Lowenstein-Jensen те могат да абсорбират малахитово зелено и да станат зелени. Те са широко разпространени в природата.

Класификацията на Ръньон се е доказала като много удобна за идентифициране на най-често срещаните видове микобактерии. Откриването на нови видове и появата на все по-голям брой междинни форми на микобактерии обаче създава трудности при регистрирането им в една или друга група на Ръньон.

M. tuberculosis е млада еволюционна формация. Напоследък се наблюдава тенденция за разделяне на M. tuberculosis на клъстери или семейства. Най-важните щамове са тези, принадлежащи към семейство Пекин, които се отличават с клонално поведение и способност да причиняват микроогнища на туберкулоза.

Морфология на микобактериите

Микобактериите са тънки пръчковидни клетки с характерното свойство на киселинно- и алкохолоустойчивост (в един от етапите на растеж), аеробни. При оцветяване по Грам те са слабо грам-положителни. Микобактериите са неподвижни, не образуват спори. Липсват конидии или капсули. Те растат върху плътни хранителни среди бавно или много бавно: при оптимална температура видими колонии се появяват след 2-60 дни. Колониите са розови, оранжеви или жълти, особено когато растат на светлина. Пигментът не дифундира. Повърхността на колониите обикновено е матова (S-тип) или грапава (R-тип). Микобактериите често растат под формата на слузести или набръчкани колонии. Върху течни среди микобактериите растат на повърхността. Нежният сух филм се удебелява с времето, става неравномерен и придобива жълтеникав оттенък. Бульонът остава прозрачен и може да се постигне дифузен растеж в присъствието на детергенти. В микроколониите на M. tuberculosis (т.е. в ранните стадии) се образуват структури, наподобяващи шнурове - характеристика, която се свързва с фактора на шнуровете.

Когато са оцветени с карбол фуксин, микобактериите туберкулоза изглеждат като тънки, леко извити пръчици с малиновочервен цвят, съдържащи различен брой гранули.

Дължината на микобактериите е приблизително 1-10 µm, а ширината е 0,2-0,7 µm. Понякога могат да се открият извити или усукани варианти. Микроорганизмите, разположени поединично, по двойки или в групи, се открояват добре на синия фон на другите компоненти на препарата. Бактериалните клетки често могат да бъдат подредени във формата на римската цифра "V".

Препаратът може също да разкрие променени кокоидни киселинно-устойчиви форми на патогена, закръглени сферични или мицел-подобни структури. В този случай положителният отговор трябва да бъде потвърден с допълнителни методи.

Структурата на клетъчната стена на микобактериите

Клетъчната стена на микобактериите е най-сложната в сравнение с други прокариоти.

Докато грам-отрицателните бактерии имат две мембрани, клетъчната стена на микобактериите се състои от няколко слоя, някои от които съдържат захари и се характеризират с относително постоянен състав. Външните слоеве имат променящ се химичен състав и са представени главно от липиди, повечето от които са миколови киселини и техни производни. Като правило тези слоеве не се виждат под електронна микроскопия. Основната рамка на клетъчната стена е омрежени пептидни гликани - електрон-плътен слой. Арабиногалактановият слой повтаря пептид гликановия слой, образувайки полизахаридна строма на клетъчната стена. Той има точки на свързване със пептид гликановия слой и структури за прикрепване на миколови киселини и техните производни.

Миколовите киселини се срещат под формата на свободни сулфолипиди и кордов фактор, чието наличие върху клетъчната повърхност е свързано с характерното образуване на колонии на M. tuberculosis под формата на флагели. Уникалността и ключовата роля на миколовите киселини в структурната организация и физиологията на микобактериите ги правят отлична мишена за етиотропна терапия.

Гликолипидният слой се нарича „микозиди“ и понякога се сравнява с микрокапсула. Микозидите са структурно и функционално подобни на липополизахаридите на външната мембрана на грам-отрицателните бактерии, но им липсва тяхната агресивност; въпреки това те са токсични и (както корд факторът и сулфолипидите) причиняват образуването на грануломи.

Клетъчната мембрана и слоевете на клетъчната стена са пронизани с канали или пори, сред които можем да различим пасивни пори с кратък живот, осигуряващи контролирана дифузия на веществата, и канали с по-дълъг живот, осигуряващи енергозависим транспорт на веществата.

Друг компонент на клетъчната стена на микобактериите е липоарабиномананът. Той е закрепен към плазмената мембрана, прониква през клетъчната стена и излиза на повърхността ѝ. В това отношение е подобен на липотейхоевите киселини на грам-положителните бактерии или на липополизахаридния О-антиген на грам-отрицателните бактерии. Крайните фрагменти на липоарабиномананана, предимно неговите манозни радикали, неспецифично потискат активирането на Т-лимфоцитите и левкоцитите в периферната кръв. Това води до нарушаване на имунния отговор към микобактериите.

Променливост и форми на съществуване на микобактериите

Персистентността на бактериите има особено патогенетично значение. Лабораторни експерименти, проведени in vitro и in vivo, показват, че бактерицидните лекарства изониазид и пиразинамид убиват микобактериите само във фазата на размножаване. Ако микобактериите са във фаза на ниска метаболитна активност (т.е. бактериалният растеж е почти напълно спрян и бактериите могат да се нарекат „латентни“), бактерицидните лекарства не им действат. Това състояние обикновено се нарича латентно, а микроорганизмите – персистерни. Персистерните не са чувствителни към химиотерапевтични лекарства, т.е. те се държат като резистентни микроорганизми. Всъщност те могат да запазят чувствителност към лекарства.

Мощен стимул за прехода на микобактериалните клетки в латентно състояние са химиотерапевтичните лекарства, както и факторите на имунната система на гостоприемника. Персистерните бактерии са способни да останат в лезиите в продължение на месеци или дори години. По време на персистирането микобактериите могат да се трансформират в L-форми. В тази форма микобактериите проявяват изключително ниска метаболитна активност, насочена предимно към увеличаване на дебелината на клетъчната стена и извънклетъчната матрица, което предотвратява простата дифузия на веществата. Освен това, микобактериите натрупват генетичен материал, което увеличава вероятността за пресъздаване на нормално функционираща клетка при настъпване на благоприятни условия. Откриването на L-форми чрез стандартни микробиологични методи е трудно.

Ако спящите микобактерии възвърнат метаболитната си активност и започнат да се размножават по време на химиотерапия, те бързо умират. Ако химиотерапията приключи, такива „съживени“ микобактерии продължават да се размножават и да причиняват рецидив на заболяването. Това обяснява оправданието за дълги курсове на химиотерапия и използването на последващи кратки профилактични, обикновено сезонни, курсове на химиопрофилактика.

Физиология на микобактериите

В царството на прокариотите, микобактериите са безспорните лидери в областта на синтеза на сложни органични съединения. Те вероятно притежават най-гъвкавия метаболизъм, осигуряващ необходимата вариабилност за оцеляване както във външната среда, така и в макроорганизма. Към днешна дата са описани повече от 100 ензимни реакции, показващи разклонения и сложен характер на микобактериалния метаболизъм. За синтезиране на крайни съединения или осигуряване на необходимите физиологични функции при микобактериите могат да се осъществяват паралелни метаболитни пътища в зависимост от наличието на субстрат, химическата среда, осигуряването на дихателните цикли с необходимите компоненти (метални йони, парциално налягане на кислород, въглероден диоксид и др.).

Биохимични свойства на микобактериите

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Липиден метаболизъм

Липидите на клетъчната стена, които съставляват до 60% от сухата маса на клетката, определят нестандартните тинкториални, физиологични и екологични свойства на микобактериите.

Специфичните липиди на микобактериите, описани до момента, са разделени на 7 основни групи според структурните им характеристики:

1. производни на мастни киселини на въглехидрати (главно трехалоза - корд фактор):
2. фосфатидил миоинозитол манозиди:
3. производни на мастни киселини на пептиди;
4. N-ацилпептидни гликозиди - микозиди C;
5. естери на мастни киселини с фтиоцероли;
6. микозиди A, B. G;
7. глицеролови миколати.

Липидите от групи 4-6 се срещат само в микобактериите.

Сред уникалните, заслужава да се отбележат туберкулостеариновата и туберкулопалмитиновата киселини, които са предшественици на миколовите киселини.

Миколовите киселини са група високомолекулни мастни киселини с дължина на веригата до 84 въглеродни атома, чиято структура на основната верига се определя от систематичното положение на микроорганизма и условията на неговия растеж. Ниската им реактивност осигурява висока химическа устойчивост на клетъчната стена на микобактериите. Миколовите киселини потискат ензимното разцепване на клетъчната стена и реакциите на свободните радикали.

Кордният фактор е класифициран като липидна група 1. Той е свързан с висока токсичност на микобактериите и вирулентност.

Повърхностно активните липиди, или сулфолипиди, играят важна роля във вътреклетъчната адаптация на микобактериите. Заедно с кордовия фактор те образуват цитотоксични мембранотропни комплекси.

Липоарабиномананът е хетерогенна смес от високомолекулни липополизахариди: разклонени полимери на арабиноза и маноза с диацилглицеролни производни на палмитинова и туберкулостеаринова киселини.

Микозидите C са пептидни гликолипиди, които образуват външната мембрана на микобактериите, която може да се наблюдава под електронна микроскопия като прозрачна зона по периферията на клетките. Микозидите са видовете специфични съединения. Антигенните свойства на микобактериите зависят от техния вид.

Количественият и качествен състав на липидните съединения на микобактериите е динамичен и зависи от възрастта на клетките, състава на хранителната среда и физикохимичните характеристики на околната среда. Младите микобактериални клетки започват да образуват клетъчна стена чрез синтезиране на липополизахариди с относително къси алифатни вериги. На този етап те са доста уязвими и достъпни за имунната система. С нарастването на клетъчната стена и образуването на високомолекулни липиди, микобактериите придобиват резистентност и безразличие във взаимодействията си с имунната система.

Въглехидратен метаболизъм

Най-предпочитаният източник на въглерод за микобактериите е глицеролът.

Най-важните въглехидрати са арабиноза, маноза и малтоза, които съставляват повече от половината от всички захариди. Освен това, трехалозата, глюкозата, фруктозата, галактозата, рамнозата и някои други захариди играят роля в жизнената активност на клетката. В този случай синтезът протича по хидролазния и алдолазния път. Пируватният път се използва за синтезиране на гликоген. Арабинозата и манозата участват в образуването на важни структурни съединения. Пентозофосфатният път на окисление на глюкозата се използва за получаване на енергия. Той се осигурява от ензимите малат, изоцитрат и сукцинат дехидрогенази, което придава гъвкавост на дихателната система.

Глиоксилатният път, който микобактериите използват, за да включат свободни мастни киселини, натрупващи се по време на растежа на микобактериите, в цикъла на трикарбоксилните киселини, е уникален. Този цикъл е привлякъл вниманието на изследователите като възможен механизъм за хемотаксис на микобактериите по време на персистиране.

Метаболизъм на азот и аминокиселини

Скоростта на усвояване на нитрати, нитрити и хидроксиламини от микобактериите може да се използва за идентифициране на видовете. Микобактериите предпочитат аспарагин като източник на азот. Синтезът на аминокиселини е енергозависим процес и се осигурява от група ензими, които позволяват използването на други аминокиселинни съединения, като глутамат.

Активност на нитрит- и нитрат-редуктаза

Mycobacterium tuberculosis може да образува аденозин трифосфат (АТФ) чрез пренасяне на електрони по верига от носители, завършваща с NO3 _, а не с O2 _. Тези реакции редуцират NO3 _до NH3 _в количества, необходими за синтеза на аминокиселини, пуринови и пиримидинови бази. Това се постига чрез последователното действие на нитратните и нитритните редуктази.

Каталазна и пероксидазна активност

Каталазата предотвратява натрупването на водороден пероксид, който се образува по време на аеробното окисление на редуцирани флавопротеини. Ензимната активност зависи от pH на средата и температурата. При температура от 56 °C каталазата не е активна. Съществуват тестове за принадлежност към патогенния комплекс от микобактерии, базирани на термолабилността на каталазата.

Известно е, че 70% от щамовете на Mycobacterium tuberculosis, резистентни на изониазид, губят каталазната и пероксидазната си активност.

Пероксидазната и каталазната активност се осъществяват от един и същ ензимен комплекс.

[ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Витамини и коензими

M. tuberculosis съдържа витамини от група В (рибофлавин, пиридоксин, цианокобаламин, тиамин), витамини С и К, пара-аминобензоена киселина, пантотенова и никотинова киселини, биотин и фолиева киселина.

Метаболизъм, хранене и дишане на микобактерии

При нормални, благоприятни условия, микобактериите туберкулоза са стриктни аероби и мезофили, т.е. растат в присъствието на кислород и в температурния диапазон от 30-42 ^o C, най-добре при 37 ^o C. При неблагоприятни външни условия и/или кислороден дефицит, микобактериите туберкулоза се проявяват като микроаерофили и дори като анаероби. В този случай метаболизмът им претърпява значителни промени.

_{По отношение на консумацията на кислород и развитието на оксидазни системи, микобактериите са подобни на истинските гъби. Витамин К9} служи като връзка между NADH дехидрогеназата и цитохром b в трансферната система на рода Mycobacterium. Тази цитохромна система наподобява митохондриалната. Тя е чувствителна към динитрофенол, точно както при висшите организми.

Описаният тип дишане не е единственият източник на образуване на АТФ. В допълнение към О2 _- терминала, микобактериите могат да използват дихателни вериги, които пренасят електрони и завършват с нитрати (NO3- ₎^. Резервът на дихателната система на микобактериите е глиоксилатният цикъл.

Аноксичното (ендогенно) дишане, което протича в атмосфера с концентрация на кислород по-малка от 1%, се стимулира от азидни съединения, които намаляват окислението на пируват или трехалоза.

Растеж и размножаване на микобактерии

Mycobacterium tuberculosis се размножава изключително бавно: периодът на удвояване е 18-24 часа (нормалните бактерии се делят на всеки 15 минути). Следователно, за да се получи видим растеж на типичните колонии, са необходими поне 4-6 седмици. Една от причините за бавното размножаване на микобактериите се счита за тяхната изразена хидрофобност, която затруднява дифузията на хранителни вещества. По-вероятно е това да е генетично обусловено и да е свързано с по-сложна структура на микобактериите. Известно е например, че повечето бактерии имат множество копия на рибозомния рибонуклеинов киселинен (рРНК) оперон. Бавно растящите микобактерии (M. tuberculosis, M. leprae) имат едно копие на оперона, а бързорастящите (M. smegmatis) - само две копия.

Когато се култивират в течна среда, микобактериите растат на повърхността. Деликатният сух филм се удебелява с времето, става неравен и набръчкан и придобива жълтеникав оттенък, често сравняван с цвета на слонова кост. Бульонът остава прозрачен, а дифузен растеж може да се постигне само в присъствието на детергенти, като Tween-80. В микроколониите (т.е. в ранните етапи) се образуват структури, наподобяващи снопове - характеристика, свързана с кордовия фактор на M. tuberculosis.

Генетика на микобактериите

Родът Mycobacterium е генетично много разнообразен. За разлика от много сапрофитни и нетуберкулозни микобактерии, Mycobacterium tuberculosis не съдържа екстрахромозомни включвания (напр. плазмиди). Цялото разнообразие от свойства на Mycobacterium tuberculosis се определя от неговата хромозома.

Геномът на комплекса M. tuberculosis е изключително консервативен. Неговите представители имат ДНК хомология на ниво 85-100%, докато ДНК на други видове микобактерии е хомоложна на M. tuberculosis само с 4-26%.

Представителите на рода Mycobacteria имат големи геноми в сравнение с други прокариоти - 3,1-4,5x10 ⁹ Da. Геномите на патогенните видове обаче са по-малки от тези на други микобактерии (при M. tuberculosis - 2,5x10 ⁹ Da). Класическият причинител на човешката туберкулоза, M. tuberculosis, има повече гени от M. africanum и M. bovis, които са загубили част от генетичния си материал по време на еволюцията.

През 1998 г. е публикувана нуклеотидната последователност на хромозомата на щама H37Rv на M. tuberculosis. Дължината ѝ е 4 411 529 базови двойки. Хромозомата на туберкулозния микобактериум е пръстеновидна структура. Тя съдържа около 4000 гена, кодиращи протеини, както и 60 кодиращи функционални РНК компонента: уникален рибозомен РНК оперон, 10Sa РНК, участваща в разграждането на протеини с атипична матрична РНК, 45 транспортни РНК (тРНК), повече от 90 липопротеина.

Повече от 20% от генома е зает от гени на метаболизма на мастни киселини в клетъчната стена, включително миколови киселини, богати на глицин киселинни полипептиди (семейства PE и PPE), кодирани от полиморфни региони на генома PGRS (Polymorphic GC-rich repetitive sequence) и MPTR (Major polymorphic tandem repeat) съответно (петият и четвъртият пръстен на геномната хромозомна карта). Променливостта на тези геномни региони осигурява разлики в антигените и способността за инхибиране на имунния отговор. Геномът на Mycobacterium tuberculosis съдържа широко гени, които контролират факторите на вирулентност.

Mycobacterium tuberculosis синтезира всички компоненти, необходими за метаболизма: есенциални аминокиселини, витамини, ензими и кофактори. В сравнение с други видове бактерии, M. tuberculosis има повишена активност на ензимите на липогенезата. Два гена кодират хемоглобиноподобни протеини, които действат като антиоксидантни протектори или капани за излишния клетъчен кислород. Тези характеристики улесняват бързата адаптация на Mycobacterium tuberculosis към резки промени в условията на околната среда.

Отличителна черта на генома на комплекса M. tuberculosis е големият брой повтарящи се ДНК последователности. Така, хромозомата на M. tuberculosis H37Rv съдържа до 56 копия на IS елементи (инсерционни последователности), които осигуряват ДНК полиморфизъм на Mycobacterium tuberculosis. Повечето от тях, с изключение на елемента IS6110, са непроменени. Хромозомите на различни щамове на Mycobacterium tuberculosis обикновено съдържат от 5 до 20 копия на IS6110, но има щамове, които нямат този елемент. Наред с IS елементите, геномът съдържа няколко вида къси нуклеотидни повторения (PGRS и MPTR), както и директни повторения DR (Direct Repeat), разположени в DR областта и разделени от променливи последователности - спейсъри (шестият пръстен на хромозомната карта). Разликите в броя на копията и локализацията върху хромозомата на тези генетични елементи се използват за диференциране на щамовете на Mycobacterium tuberculosis в молекулярната епидемиология. Най-модерните схеми за генотипизиране на микобактерии се основават на откриването на геномен полиморфизъм, причинен от елемента IS6110, както и от DR и техните спейсъри. Характерно е, че дивергенцията на видовете M. tuberculosis се случва, като правило, поради рекомбинации между копия на елемента IS6110, които фланкират различни гени.

В генома на H37Rv бяха открити два профага, phiRv1 и phiRv2. Подобно на полиморфния сайт Dral, те вероятно са свързани с фактори на патогенност, тъй като тези региони на генома се различават от подобни региони на авирулентните щамове на M. tuberculosis H37Ra и M. bom BCG. Идентифицирани са региони на генома (mutT, ogt-гени), отговорни за увеличаване на честотата на мутации и адаптация на Mycobacterium tuberculosis в условия на преса. Откриването на тригерни гени за латентност на Mycobacterium tuberculosis промени концепцията за латентна туберкулозна инфекция.

Изследване на полиморфизма на гени, кодиращи каталаза, пероксидаза и А-субединица на ДНК гираза. В комплекса M. tuberculosis са идентифицирани три генотипни групи. Най-древната (от гледна точка на еволюцията) е група I: M. africanum, M. bovis, M. tuberculosis и M. microti. Групи II и III включват различни щамове на M. tuberculosis, които са станали широко разпространени в някои географски региони. Клоналното поведение е характерно за групи I и II, а щамовете от група III изключително рядко причиняват масови заболявания. Генетичните семейства на M. tuberculosis, получили имената Харлем, Африка, Филипинска, са широко разпространени в различни региони на света.

Специално място заема семейство Пекин, идентифицирано за първи път в хистологични препарати на белодробна тъкан от пациенти в предградията на Пекин през 1956-1990 г. Към днешна дата щамове от това семейство са открити в азиатски страни, Южна Африка, Карибите и Съединените щати. Разпространението на този генотип в различни територии се определя от етническите характеристики на коренното население и мигрантите. Наскоро бяха получени данни за разпространението на щамове от генотипа SI/Beijing в северозападната част на европейската част на Русия (Санкт Петербург) и в районите на Сибир.

Микобактериална резистентност

По време на еволюцията, туберкулозните микобактерии са развили различни механизми за преодоляване или инактивиране на неблагоприятни фактори на околната среда. Първо, това е мощна клетъчна стена. Второ, това са обширни метаболитни възможности. Те са способни да инактивират много клетъчни токсини и вещества (различни пероксиди, алдехиди и други), които разрушават клетъчната мембрана. Трето, това е морфологична пластичност, която се състои в трансформация на микобактериите (образуване на L-форми на спящи клетки). По отношение на своята стабилност, след спорообразуващите бактерии, те заемат водещо място в царството на прокариотите.

Патогенът остава жизнеспособен в сухо състояние до 3 години. При нагряване туберкулозните микобактерии могат да издържат на температури значително по-високи от 80°C. Днес се смята, че туберкулозните микобактерии, открити в храчките, остават жизнеспособни, когато последните се варят открито в продължение на 5 минути.

Mycobacterium tuberculosis е устойчив на органични и неорганични киселини, основи, много окислители, както и на редица антисептични и дехидратиращи вещества, които имат вредно въздействие върху други патогенни микроорганизми. Mycobacterium проявява устойчивост на въздействието на алкохоли и ацетон.

Отбелязва се, че продуктите на основата на кватернерни амониеви йони не проявяват противотуберкулозна активност. При определени условия, концентрации на хлор и кислородни радикали до 0,5% също нямат вредно въздействие върху туберкулозните микобактерии. Това предполага невъзможността за използване на такива продукти за стерилизиране на храчки и други инфектирани биологични материали.

Mycobacterium tuberculosis е нечувствителен към дифузна слънчева светлина и може да съществува във външната среда повече от година, без да губи жизнеспособност. Късовълновото ултравиолетово лъчение има универсален бактерициден ефект върху всички микроорганизми. В реални условия обаче, когато Mycobacterium tuberculosis е суспендиран под формата на клетъчни агломерати с прахови частици, устойчивостта му към ултравиолетово лъчение се увеличава.

Високата степен на оцеляване на туберкулозните микобактерии допринася за изключително широкото разпространение на тази инфекция сред населението, независимо от климатичните условия. Това обаче не е единственият фактор, който допринася за глобализацията на проблема - туберкулозните микобактерии могат да персистират в човешкото тяло дълго време и да се реактивират през неограничени интервали.

Локализацията на туберкулозния микобактериум вътре в макрофагите осигурява достатъчна стабилност на субстрата, като се отчита „дълголетието“ на мононуклеарните фагоцити и продължителността на микобактериалната репликация, както и изолация от ефектори на хуморалния имунитет. В същото време патогенът избира биотоп, който е неприемлив за повечето микроорганизми, поради потенциалната му опасност. Тази симбиоза се осигурява от редица адаптивни механизми на микобактериите.

Процесът на увреждане на макрофагите и паразитизъм в тях изглежда така: проникване на микобактерии в макрофага без неговото активиране; потискане на образуването на фаголизозоми или превръщането им в зона, удобна за бактериите; пробив от фагозомите в цитоплазмата с инактивиране на антимикробни фактори; намеса в жизнената активност на клетката; отслабване на чувствителността на макрофагите към активиращи сигнали на Т-лимфоцитите; намаляване на антиген-представящата функция на макрофагите и свързаното с това отслабване на реакциите на цитотоксичните Т-лимфоцити, конфигурирани да унищожават заразените клетки.

Разбира се, характеристиките на клетъчната стена играят важна роля за осигуряването на това, както и метаболитните и функционалните възможности. При първия контакт с микобактериите, имунните системи на макроорганизма не са в състояние да активират хуморалния имунитет, бързо да неутрализират и елиминират клетката от тялото, тъй като мобилните алифатни вериги на микобактериалната стена не позволяват оценка на повърхностните структури на патогена и предават съответната информация за синтеза на необходимия набор от антитела.

Високата хидрофобност на микобактериите осигурява неспецифични, т.е. рецепторно-независими, контакти с макрофагите. Чрез образуване на фагозом около клетката на микобактерията, макрофагът я поставя вътре в себе си. Повърхностните микозидни и липоарабиномананови комплекси могат да бъдат разпознати от рецепторите, но сигналите, задействани чрез тях, не активират или слабо активират макрофагите. В резултат на това фагоцитозата не е съпроводена с освобождаване на свободнорадикални форми на кислород и азот. Смята се, че това е по-характерно за вирулентните щамове на M. tuberculosis, които поради структурните особености на липоарабиноманана инициират „неагресивна“ фагоцитоза. Други макрофагови рецептори, по-специално CD 14 и рецепторите на комплементния компонент C3 (CR1-CR3), също участват в разпознаването на M. tuberculosis.

След като проникна във вътрешността на макрофага, микобактерията включва редица механизми, които предотвратяват образуването на фаголизозома: производството на амоний, който алкализира средата вътре във фагозомата, синтеза на сулфолипиди, което води до образуването на отрицателен заряд на повърхността на фагозомата, което предотвратява сливането на фагозомата и лизозомата.

Ако се образува фаголизозома, микобактерията, благодарение на мощната си восъчна обвивка, е способна да потуши реакциите на свободните радикали, причинени от бактерицидни вещества на фагоцитите. Амоният алкализира средата, блокирайки активността на лизозомните ензими, а сулфолипидите неутрализират мембранотропните катионни протеини. Освен това, туберкулозните микобактерии произвеждат високоактивни ензими с каталазна и пероксидазна активност, които се конкурират с пероксидазните системи на макрофагите и едновременно с това инактивират лизозомните хидропероксиди. Всичко това повишава устойчивостта на микобактериите към оксидативен стрес.

По-нататъшната адаптация на микобактериите се състои в използване на желязосъдържащи съединения на макрофагите за техните ензимни системи и блокиране на имуноспецифичните функции на макрофагите. Макрофагите са един от основните резервоари на желязо, излишъкът от което се натрупва под формата на феритин. Съдържанието на желязо в алвеоларните макрофаги е 100 пъти по-високо, отколкото в кръвните моноцити, което със сигурност допринася за колонизацията им от туберкулозни микобактерии.

Микобактериите упражняват токсични ефекти върху макрофагите посредством ендотоксини и неспецифични фактори. И двете засягат предимно дихателната система на макрофагите - митохондриите. Ендотоксините включват миколни арабинолипиди, които инхибират митохондриалното дишане. Неспецифичните токсини включват продукти от синтеза на липидната част на микобактериалната клетка - фтиен и фтионови киселини, които причиняват разединяване на окислителното фосфорилиране. Засилените метаболитни процеси при тези условия не са съпроводени с правилен синтез на АТФ. Клетките гостоприемници започват да изпитват енергиен глад, което води до инхибиране на жизнената им активност и впоследствие до цитолиза и апоптоза.

Възможно е някои патогенни фактори да се образуват само вътре в заразените клетки, както е при други бактерии, които предпочитат вътреклетъчен начин на живот. Например, салмонелата, паразитираща вътре в макрофагите, допълнително експресира повече от 30 гена. Въпреки пълното описание на генома на туберкулозния микобактериум, 30% от кодоните са свързани с протеини с неизвестни свойства.

Лекарствена резистентност на микобактериите

От клинична гледна точка, лекарствената чувствителност на даден микроорганизъм определя дали стандартната химиотерапия с посоченото лекарство може да се използва за лечение на заболяването, причинено от изолирания щам. Резистентността „предсказва неуспех на лечението с тестваното лекарство“. С други думи, използването на стандартна химиотерапия, която води до системна лекарствена концентрация, обикновено ефективна при нормални условия, не потиска пролиферацията на „резистентни микроорганизми“.

В микробиологията определението за лекарствена чувствителност или лекарствена резистентност се основава на популационния подход, който предполага различна степен на резистентност на пул (хетерогенен набор) от микробни клетки. Лекарствената резистентност се оценява по количествени характеристики, като например „минималната инхибираща концентрация“ (МИК). Например, при МИК-90, 90% от микроорганизмите умират (бактериостатична концентрация). Следователно, резистентността трябва да се разбира като нейната степен в част от микробната популация, което предопределя неуспеха на лечението в повечето случаи. Общоприето е, че 10% от резистентните щамове сред цялата микробна популация на пациента могат да имат патогенен ефект. Във фтизиобактериологията, за противотуберкулозните лекарства от първа линия, това е 1%. или 20 колонии-образуващи единици - CFU). Такава част от микробната популация е способна да измести първоначалната за един месец и да образува лезия. За противотуберкулозните лекарства от втора линия критерият за резистентност е 10% увеличение на микробната популация.

Развитието на лекарствена резистентност при микроорганизмите е свързано със селекция в присъствието на антибиотик и с преференциалното оцеляване на част от микробната популация, която има механизми на защита срещу антибактериалния агент. Всяка популация съдържа малък брой мутантни клетки (обикновено 106-109 ^{), които сарезистентни} към определено лекарство. По време на химиотерапията чувствителните микробни клетки умират, а резистентните се размножават. В резултат на това чувствителните клетки се заместват от резистентни.

Микобактериите първоначално имат висока естествена резистентност към много широкоспектърни антибактериални лекарства, но различните видове имат различен спектър и степен на тази чувствителност.

Истинската естествена резистентност се разбира като постоянна видово-специфична характеристика на микроорганизмите, свързана с липсата на цел за действието на антибиотик или недостъпността на целта поради първоначално ниската пропускливост на клетъчната стена, ензимна инактивация на веществото или други механизми.

Придобитата резистентност е способността на отделните щамове да останат жизнеспособни при антибиотични концентрации, които потискат растежа на основната част от микробната популация. Придобиването на резистентност във всички случаи е генетично обусловено: поява на нова генетична информация или промяна в нивото на експресия на собствените гени.

В момента са открити различни молекулярни механизми на резистентност на Mycobacterium tuberculosis:

• инактивиране на антибиотици (ензимна инактивация), например чрез β-лактамази;
• модификация на целта на действие (промяна в пространствената конфигурация на протеина поради мутация в съответния регион на генома):
• хиперпродукция на целта, водеща до промяна в съотношението агент-цел и освобождаване на част от жизнеподдържащите протеини на бактериите;
• активно отстраняване на лекарството от микробната клетка (ефлукс) поради активирането на механизмите за защита от стрес:
• промени в параметрите на пропускливост на външните структури на микробната клетка, блокиращи способността на антибиотика да проникне в клетката;
• включване на „метаболитен шънт“ (байпасен метаболитен път).

В допълнение към директното въздействие върху метаболизма на микробните клетки, много антибактериални лекарства (бензилпеницилин, стрептомицин, рифампицин) и други неблагоприятни фактори (биоциди на имунната система) водят до появата на променени форми на микобактерии (протопласти, L-форми), а също така превеждат клетките в латентно състояние: интензивността на клетъчния метаболизъм намалява и бактерията става нечувствителна към действието на антибиотика.

Всички механизми формират различна степен на резистентност, осигурявайки устойчивост към различни концентрации на химиотерапевтични лекарства, така че появата на резистентност при бактериите не винаги е съпроводена с намаляване на клиничната ефективност на антибиотика. За да се оцени ефективността и прогнозата на лечението, е важно да се знае степента на резистентност.

Понастоящем за всяко лекарство от първа линия за борба с туберкулозата и за повечето резервни лекарства е идентифициран поне един ген. Специфични мутации в който водят до развитието на резистентни варианти на микобактерии. При широкото разпространение на лекарствена резистентност при микобактериите, високата честота на мутации in vivo, по-висока отколкото in vitro, е важна.

[ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ]

Видове лекарствена резистентност на микобактериите

Прави се разлика между първична и придобита лекарствена резистентност. Микроорганизмите с първична резистентност включват щамове, изолирани от пациенти, които не са получавали специфична терапия или са получавали лекарства в продължение на месец или по-малко. Ако е невъзможно да се изясни фактът на употребата на противотуберкулозни лекарства, се използва терминът „първична резистентност“.

Първичната лекарствена резистентност е от голямо клинично и епидемиологично значение, следователно, за нейната правилна оценка е необходимо да не се прилага химиотерапия на новодиагностициран пациент с туберкулоза преди микробиологично изследване на диагностичния материал. Честотата на първичната лекарствена резистентност се изчислява като съотношение на броя на новодиагностицираните пациенти с първична резистентност към броя на всички новодиагностицирани пациенти, изследвани за лекарствена чувствителност през годината. Ако по време на противотуберкулозна терапия, прилагана в продължение на месец или повече, от пациент се изолира резистентен щам, резистентността се счита за придобита. Честотата на първичната лекарствена резистентност характеризира епидемиологичното състояние на популацията на туберкулозните патогени.

Придобитата лекарствена резистентност сред новодиагностицираните пациенти е резултат от неуспешно лечение (неправилен подбор на лекарства, неспазване на режима, намаляване на дозите на лекарствата, непостоянно снабдяване и лошо качество на лекарствата). Тези фактори водят до намаляване на системната концентрация на лекарства в кръвта и тяхната ефективност, като едновременно с това „задействат“ защитни механизми в микобактериалните клетки.

За епидемиологични цели се изчислява честотата на преди това лекуваните случаи. За тази цел се вземат предвид пациентите, регистрирани за повторно лечение след неуспешен курс на химиотерапия или рецидиви. Изчислява се съотношението на броя на резистентните култури на Mycobacterium tuberculosis към броя на всички щамове, тествани за лекарствена резистентност през годината сред пациентите от тази група към момента на регистрацията им.

В структурата на лекарствената резистентност на Mycobacterium tuberculosis се разграничават следните:

Монорезистентност - резистентност към едно от противотуберкулозните лекарства, чувствителността към други лекарства е запазена. При използване на комплексна терапия монорезистентността се открива доста рядко и като правило към стрептомицин (в 10-15% от случаите сред новодиагностицираните пациенти).

Полирезистентността е резистентност към две или повече лекарства.

Множествената лекарствена резистентност е резистентност към изониазид и рифампицин едновременно (независимо от наличието на резистентност към други лекарства). Обикновено е съпроводена с резистентност към стрептомицин и др. В момента MDR на туберкулозните патогени се е превърнала в епидемиологично опасно явление. Изчисленията показват, че откриването на патогени с MDR в повече от 6,6% от случаите (сред новодиагностицирани пациенти) изисква промяна в стратегията на Националната противотуберкулозна програма. Според данните от мониторинга на лекарствената резистентност, честотата на MDR сред новодиагностицираните пациенти варира от 4 до 15%, сред рецидивите - 45-55%, а сред случаите на неуспешно лечение - до 80%.

Свръхрезистентността е множествена лекарствена резистентност, комбинирана с резистентност към флуорохинолони и едно от инжекционните лекарства (канамицин, амикацин, капреомицин). Туберкулозата, причинена от щамове със свръхрезистентност, представлява пряка заплаха за живота на пациентите, тъй като други противотуберкулозни лекарства от втора линия нямат изразен антибактериален ефект. От 2006 г. насам някои страни организират наблюдение за разпространението на щамове на микобактерии със свръхрезистентност. В чужбина този MDR вариант обикновено се обозначава като XDR.

Кръстосана резистентност е когато резистентността към едно лекарство води до резистентност към други лекарства. При M. tuberculosis мутациите, свързани с резистентността, обикновено не са взаимосвързани. Развитието на кръстосана резистентност се дължи на сходството в химическата структура на някои противотуберкулозни лекарства. Кръстосаната резистентност се открива особено често в рамките на една група лекарства, като например аминогликозиди. За да се предскаже кръстосана резистентност, са необходими генетични изследвания на микобактериални култури в комбинация с микробиологични изследвания на резистентност.

Нетуберкулозни микобактерии

Нетуберкулозните микобактерии се предават от човек на човек изключително рядко. Честотата на изолиране на някои от видовете им от материал от пациенти е сравнима с честотата на изолиране на тези видове от обекти на околната среда. Източници на инфекция могат да бъдат селскостопански животни и птици, непреработени продукти. Микобактериите се откриват в следкланичен материал и мляко от говеда.

Според бактериологични лаборатории, разпространението на нетуберкулозни микобактерии през 2004-2005 г. е било 0,5-6,2% сред всички микобактерии при новодиагностицирани пациенти. Честотата вероятно е малко по-висока, тъй като методът, използван за обработка на диагностичния материал, не е оптимален за нетуберкулозни микобактерии. Сапрофитни микобактерии могат да присъстват в диагностичния материал, ако не се спазват правилата за събиране или поради характеристиките на материала (например, M. smegmatis може да бъде изолирана от урината на мъже пациенти).

В тази връзка е важно многократно да се потвърди откритият вид микобактерии от материала на пациента.

Микобактериите засягат кожата, меките тъкани и могат да причинят микобактериоза на белите дробове, която е особено често срещана при имунодефицитни състояния. При белодробна локализация се открива по-често при възрастни мъже с анамнеза за хронични белодробни заболявания, включително гъбични лезии.

От всички микобактерии, комплексът M. avium-intracellulare е най-честият причинител на белодробна микобактериоза при хората. Той причинява заболявания на белите дробове, периферните лимфни възли и дисеминирани процеси. В северната част на Европейския регион около 60% от белодробните микобактериози. Преобладават фибро-кавернозните и инфилтративните процеси, които приемат хроничен ход поради висока резистентност към противотуберкулозни лекарства.

M. kansasii са причинители на хронични белодробни заболявания, наподобяващи туберкулоза. Химиотерапията е по-ефективна поради по-високата чувствителност на M. kansasii към антибактериални лекарства. M. xenopi и M. malmoense причиняват главно хронични белодробни заболявания. Те могат да замърсят системите за водоснабдяване с топла и студена вода. Местообитанието на M. malmoens не е напълно установено. M. xenopi показват сравнително добра чувствителност към противотуберкулозна терапия. M. malmoense показват сравнително висока чувствителност към антибиотици in vitro, но консервативното лечение често е неефективно и дори фатално. M. fortuitum и M. chelonae са признати за причинители на заболявания на костите и меките тъкани поради директно замърсяване на рана по време на травма, операция и проникващо нараняване. Те причиняват до 10% от белодробните микобактериози. Протича като хронична деструктивна двустранна лезия, често фатална. Противотуберкулозните лекарства и широкоспектърните антибиотици не са активни или имат малка активност срещу тези видове микобактерии.

В южните райони микобактериозите на кожата и меките тъкани, причинени от M. leprae, M. ulceranse, са широко разпространени. Идентифицирането на нетуберкулозни микобактерии се извършва в лабораториите на водещите противотуберкулозни институции в страната. Това изисква висока квалификация и добро оборудване на лабораториите.