Ограничения, опасности и усложнения на клетъчната трансплантация

Регенеративната пластична медицина се основава на клиничното приложение на тоти- и плурипотентните свойства на ембрионални и прогениторни стволови клетки, които позволяват in vitro и in vivo създаването на специфични клетъчни линии, които репопулират увредени тъкани и органи на болен човек.

Реалната възможност за използване на ембрионални стволови клетки и стволови клетки от окончателни тъкани (т. нар. „възрастни“ стволови клетки) на хора за терапевтични цели вече не е под съмнение. Експерти от Националната и Медицинската академии на САЩ (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press) и Националния институт по здравеопазване на САЩ (Stem cells and the future regenerative medicine. Nat. Inst, of Health USA) обаче препоръчват по-подробно проучване на свойствата на стволовите клетки в експерименти върху адекватни биологични модели и обективна оценка на всички последици от трансплантацията, и едва след това да се използват стволови клетки в клиниката.

Установено е, че стволовите клетки са част от тъканните производни на трите зародишни слоя. Стволовите клетки се намират в ретината, роговицата, кожния епидермис, костния мозък и периферната кръв, в кръвоносните съдове, зъбната пулпа, бъбреците, стомашно-чревния епител, панкреаса и черния дроб. С помощта на съвременни методи е доказано, че невронните стволови клетки са локализирани в мозъка и гръбначния мозък на възрастен. Тези сензационни данни привлякоха специално внимание от страна на учените и медиите, тъй като невроните в мозъка послужиха като класически пример за статична клетъчна популация, която не се възстановява. Както в ранния, така и в късния период на онтогенезата, неврони, астроцити и олигодендроцити се образуват в мозъка на животни и хора благодарение на невронните стволови клетки (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

Въпреки това, при нормални условия, пластичността на стволовите клетки от дефинитивни тъкани не се проявява. За да се реализира пластичният потенциал на стволовите клетки от дефинитивни тъкани, те трябва да бъдат изолирани и след това култивирани в среда с цитокини (LIF, EGF, FGF). Освен това, производните на стволови клетки се присаждат успешно само когато са трансплантирани в тялото на животно с потисната имунна система (γ-облъчване, цитостатици, бусулфан и др.). Досега не са получени убедителни доказателства за прилагането на пластичността на стволовите клетки при животни, които не са били изложени на радиация или други ефекти, причиняващи дълбока имуносупресия.

В такива условия опасният потенциал на ембрионалните стволови клетки (ESC) се проявява, на първо място, по време на трансплантацията им в ектопични области - при подкожно инжектиране на ESC в имунодефицитни мишки, на мястото на инжектиране се образуват тератокарциноми. Освен това, по време на развитието на човешкия ембрион честотата на хромозомните аномалии е по-висока, отколкото при ембриогенезата при животните. На етап бластоциста само 20-25% от човешките ембриони се състоят от клетки с нормален кариотип, а по-голямата част от ранните човешки ембриони, получени след ин витро оплождане, показват хаотичен хромозомен мозаицизъм и много често срещат числени и структурни аберации.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Благоприятните ефекти на стволовите клетки

Предварителните резултати от клиничните изпитвания потвърждават благоприятния ефект на стволовите клетки върху пациента, но все още няма информация за дългосрочните ефекти от клетъчната трансплантация. В литературата първоначално доминираха съобщения за положителни резултати от трансплантация на ембрионални мозъчни фрагменти при болестта на Паркинсон, но след това започнаха да се появяват данни, отричащи ефективния терапевтичен ефект на ембрионална или фетална нервна тъкан, трансплантирана в мозъка на пациенти.

В средата на 20-ти век за първи път е открито възстановяването на хематопоезата при летално облъчени животни след интравенозно преливане на клетки от костен мозък, а през 1969 г. американският изследовател Д. Томас извършва първата трансплантация на костен мозък при хора. Липсата на познания за механизмите на имунологична несъвместимост на клетките от костен мозък на донор и реципиент по това време води до висока смъртност поради чест неуспех на трансплантацията и развитие на реакция „присадка срещу гостоприемник“. Откриването на главния комплекс за хистосъвместимост, който включва човешки левкоцитни антигени (HbA1c), и усъвършенстването на методите за тяхното типизиране правят възможно значителното увеличаване на преживяемостта след трансплантация на костен мозък, което води до широкото използване на този метод на лечение в онкохематологията. Десетилетие по-късно са извършени първите трансплантации на хематопоетични стволови клетки (HSCs), получени от периферна кръв чрез левкофереза. През 1988 г. кръвта от пъпна връв е използвана за първи път като източник на ХСК във Франция за лечение на дете с анемия на Фанкони, а от края на 2000 г. в пресата се появяват съобщения за способността на ХСК да се диференцират в клетки от различни видове тъкани, което потенциално разширява обхвата на тяхното клинично приложение. Оказва се обаче, че трансплантационният материал, наред с ХСК, съдържа значителен брой нехемопоетични клетъчни примеси с различно естество и свойства. В тази връзка се разработват методи за пречистване на трансплантата и критерии за оценка на клетъчната му чистота. По-специално се използва положителна имуноселекция на CD34+ клетки, която позволява изолирането на ХСК с помощта на моноклонални антитела.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Усложнения при терапия със стволови клетки

Усложненията при трансплантацията на костен мозък най-често са хематологични и са свързани с дълъг период на ятрогенна панцитопения. Най-често се развиват инфекциозни усложнения, анемия и кръвоизливи. В тази връзка е изключително важно да се избере оптималният режим на събиране, обработка и съхранение на костен мозък за максимално запазване на стволовите клетки, което ще осигури бързо и стабилно възстановяване на хематопоезата. При характеризиране на трансплантат понастоящем обикновено се оценяват следните параметри: броят на мононуклеарните и/или ядрените клетки, колониообразуващите единици и съдържанието на CD34-позитивни клетки. За съжаление, тези показатели дават само косвена оценка на реалния хематопоетичен капацитет на популацията от стволови клетки на трансплантата. Днес няма абсолютно точни параметри за определяне на достатъчността на трансплантат за дългосрочно възстановяване на хематопоезата при пациенти, дори при автоложна трансплантация на костен мозък. Разработването на общи критерии е изключително трудно поради липсата на строги стандарти за обработка, криоконсервация и тестване на трансплантата. Освен това е необходимо да се вземе предвид цялото разнообразие от фактори, влияещи върху параметрите на успешното възстановяване на хематопоезата при всеки отделен пациент. При автоложна трансплантация на костен мозък най-важните от тях са броят на предишните курсове на химиотерапия, характеристиките на режима на кондициониране, периодът на заболяването, в който е събран костният мозък, и схемите за използване на колонии-стимулиращи фактори в посттрансплантационния период. Освен това не бива да се забравя, че химиотерапията, предшестваща вземането на трансплантата, може да има отрицателен ефект върху стволовите клетки от костен мозък.

Честотата на тежките токсични усложнения се увеличава значително по време на алогенна трансплантация на костен мозък. В тази връзка интерес представляват статистическите данни за алогенна трансплантация на костен мозък при таласемия. Докладите на Европейската група за трансплантация на костен мозък са регистрирали около 800 трансплантации на костен мозък на пациенти с таласемия майор. Алогенната трансплантация при таласемия се извършва в по-голямата част от случаите от HLA-идентични братя и сестри, което е свързано с тежки усложнения и висока смъртност по време на трансплантация на стволов клетъчен материал от частично съвместими родствени или съвместими несвързани донори. За да се сведе до минимум рискът от фатални инфекциозни усложнения, пациентите се поставят в изолирани асептични кутии с ламинарен въздушен поток и получават ниско- или абактериална диета. За бактериална деконтаминация на червата се предписват нерезорбируеми форми на антибиотици и противогъбични лекарства per os. За профилактика се прилага амфотерицин B интравенозно. Превенцията на системните инфекции се подсилва с амикацин и цефтазидим, които се предписват ден преди трансплантацията, като лечението продължава до изписването на пациента. Всички кръвни продукти се облъчват с доза от 30 Gy преди трансфузия. Парентералното хранене по време на трансплантация е необходимо условие и започва веднага след ограничаване на приема на храна по естествен път.

Редица усложнения са свързани с високата токсичност на имуносупресивните лекарства, които често причиняват гадене, повръщане и мукозит, увреждане на бъбреците и интерстициална пневмония. Едно от най-тежките усложнения на химиотерапията е вено-оклузивното заболяване на черния дроб, водещо до смърт в ранния посттрансплантационен период. Рисковите фактори за тромбоза на вените на порталната система на черния дроб включват възрастта на пациентите, наличието на хепатит и чернодробна фиброза, както и имуносупресивната терапия след трансплантация на костен мозък. Вено-оклузивното заболяване е особено опасно при таласемия, която е съпроводена с хемосидероза на черния дроб, хепатит и фиброза - чести спътници на трансфузионната терапия. Тромбозата на вените на порталната система на черния дроб се развива 1-2 седмици след трансплантацията и се характеризира с бързо повишаване на съдържанието на билирубин и трансаминазна активност в кръвта, прогресия на хепатомегалия, асцит, енцефалопатия и болка в горната част на корема. Хистологично, аутопсичният материал разкрива ендотелни увреждания, субендотелни кръвоизливи, увреждане на центрилобуларните хепатоцити, тромботична обструкция на венулите и централните вени на черния дроб. Описани са случаи на фатален сърдечен арест, свързан с токсичните ефекти на цитостатиците, при пациенти с таласемия.

В предтрансплантационния период циклофосфамидът и бусулфанът често причиняват токсично-хеморагичен цистит с патологични промени в уроепителните клетки. Употребата на циклоспорин А при трансплантация на костен мозък често е съпроводена с нефро- и невротоксичност, хипертоничен синдром, задържане на течности в организма и цитолиза на хепатоцитите. Сексуалната и репродуктивна дисфункция се наблюдава по-често при жените. При малките деца пубертетното развитие обикновено не е засегнато след трансплантацията, но при по-големите деца патологията на развитието на половата сфера може да бъде много сериозна - до стерилност. Усложненията, пряко свързани със самата трансплантация, включват отхвърляне на алогенни клетки от костен мозък, ABO несъвместимост, остри и хронични форми на реакция на присадката срещу гостоприемника.

При пациенти с ABO-несъвместима трансплантация на костен мозък, изоаглутинините на донора, генерирани от гостоприемник срещу ABO система, се произвеждат в продължение на 330-605 дни след трансплантацията, което може да доведе до продължителна хемолиза и драстично да увеличи нуждата от кръвопреливания. Това усложнение се предотвратява чрез преливане само на червени кръвни клетки тип 0. След трансплантация някои пациенти развиват автоимунна неутропения, тромбоцитопения или панцитопения, които изискват спленектомия за коригиране.

При 35-40% от реципиентите, остра реакция на присадката срещу гостоприемника се развива в рамките на 100 дни след алогенна HLA-идентична трансплантация на костен мозък. Степента на засягане на кожата, черния дроб и червата варира от обрив, диария и умерена хипербилирубинемия до десквамация на кожата, чревна непроходимост и остра чернодробна недостатъчност. При пациенти с таласемия честотата на остра реакция на присадката срещу гостоприемника от степен I след трансплантация на костен мозък е 75%, а от степен II и по-висока е 11-53%. Хроничната реакция на присадката срещу гостоприемника като системен полиорганен синдром обикновено се развива в рамките на 100-500 дни след алогенна трансплантация на костен мозък при 30-50% от пациентите. Засегнати са кожата, устната кухина, черният дроб, очите, хранопроводът и горните дихателни пътища. Прави се разлика между ограничена форма на хронична реакция на присадката срещу гостоприемника, когато са засегнати кожата и/или черният дроб, и широко разпространена форма, когато генерализираните кожни лезии се комбинират с хроничен агресивен хепатит, лезии на очите, слюнчените жлези или друг орган. Смъртта често е причинена от инфекциозни усложнения, произтичащи от тежък имунодефицит. При таласемия лека форма на хронична реакция „присадка срещу гостоприемник“ се среща при 12%, умерена форма - при 3%, а тежка форма - при 0,9% от реципиентите на алогенен HLA-съвместим костен мозък. Тежко усложнение на трансплантацията на костен мозък е отхвърлянето на присадката, което се развива 50-130 дни след операцията. Честотата на отхвърляне зависи от режима на кондициониране. По-специално, при пациенти с таласемия, които са получавали само метотрексат по време на подготвителния период, отхвърляне на трансплантата на костен мозък е наблюдавано в 26% от случаите, при комбинация от метотрексат с циклоспорин А - в 9% от случаите, а при прилагане само на циклоспорин А - в 8% от случаите (Gaziev et al., 1995).

Инфекциозните усложнения след трансплантация на костен мозък се причиняват от вируси, бактерии и гъбички. Развитието им е свързано с дълбока неутропения, индуцирана от химиотерапевтични лекарства по време на периода на кондициониране, увреждане на лигавичните бариери от цитостатици и реакцията „присадка срещу гостоприемник“. В зависимост от времето на развитие се разграничават три фази на инфекциозни усложнения. В първата фаза (развива се през първия месец след трансплантацията) преобладават увреждането на лигавичните бариери и неутропенията, често съпроводени от вирусни инфекции (херпес, вирус на Епщайн-Бар, цитомегаловирус, Varicella zoster), както и инфекции, причинени от грам-положителни и грам-отрицателни бактерии, гъбички Candida, аспергили. В ранния посттрансплантационен период (вторият и третият месец след трансплантацията) най-тежката инфекция е цитомегаловирусната, която често води до смърт на пациенти във втората фаза на инфекциозни усложнения. При таласемия цитомегаловирусната инфекция след трансплантация на костен мозък се развива при 1,7-4,4% от реципиентите. Третата фаза се наблюдава в късния посттрансплантационен период (три месеца след операцията) и се характеризира с тежък комбиниран имунодефицит. Инфекции, причинени от Varicella zoster, стрептококи, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae и хепатотропни вируси, са често срещани през този период. При таласемия смъртността при пациенти след трансплантация на костен мозък е свързана с бактериален и гъбичен сепсис, идиопатична интерстициална и цитомегаловирусна пневмония, остър респираторен дистрес синдром, остра сърдечна недостатъчност, сърдечна тампонада, мозъчен кръвоизлив, вено-оклузивно чернодробно заболяване и остра реакция на присадката срещу гостоприемника.

Понастоящем са постигнати известни успехи в разработването на методи за изолиране на чисти популации от хематопоетични стволови клетки от костен мозък. Техниката за получаване на фетална кръв от пъпната връв е подобрена и са създадени методи за изолиране на хематопоетични клетки от кръв от пъпна връв. В научния печат има съобщения, че хематопоетичните стволови клетки са способни да се размножават, когато се култивират в среди с цитокини. При използване на специално проектирани биореактори за разширяване на хематопоетични стволови клетки, биомасата на хематопоетичните стволови клетки, изолирани от костен мозък, периферна или пъпна кръв, се увеличава значително. Възможността за разширяване на хематопоетичните стволови клетки е важна стъпка към клиничното развитие на клетъчната трансплантация.

Въпреки това, преди in vitro размножаване на хематопоетични стволови клетки, е необходимо да се изолира хомогенна популация от хематопоетични стволови клетки. Това обикновено се постига с помощта на маркери, които позволяват селективно маркиране на хематопоетични стволови клетки с моноклонални антитела, ковалентно свързани с флуоресцентен или магнитен маркер, и тяхното изолиране с помощта на подходящ клетъчен сортировчик. В същото време въпросът за фенотипните характеристики на хематопоетичните стволови клетки не е окончателно решен. А. Петренко, В. Гришченко (2003) разглеждат клетки с CD34, AC133 и Thyl антигени на повърхността си и без CD38, HLA-DR или други маркери за диференциация (клетки с CD34+Liir фенотип) като кандидати за хематопоетични стволови клетки. Маркерите за линия (Lin) включват гликофорин А (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Клетки с фенотип CD34+CD45RalüW CD71low, както и фенотип CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low, се считат за обещаващи за трансплантация.

Въпросът за броя на хематопоетичните стволови клетки, достатъчни за ефективна трансплантация, остава проблематичен. Понастоящем източниците на хематопоетични стволови клетки са костен мозък, периферна и пъпна кръв, както и ембрионален черен дроб. Разширяването на хематопоетичните стволови клетки се постига чрез култивирането им в присъствието на ендотелни клетки и хематопоетични растежни фактори. В различни протоколи за индуциране на пролиферация на HSC се използват миелопротеини, SCF, еритропоетин, инсулиноподобни растежни фактори, кортикостероиди и естрогени. При използване на комбинации от цитокини in vitro е възможно да се постигне значително увеличение на пула на HSC с пик в продукцията им в края на втората седмица на култивиране.

Традиционно, трансплантацията на хемопоетични стволови клетки от пъпна кръв се използва главно за хемобластози. Минималната доза хемопоетични клетки, необходима за успешна трансплантация на клетки от пъпна кръв, обаче е 3,7 x 10 ⁷ ядрени клетки на 1 kg телесно тегло на реципиента. Използването на по-малък брой хемопоетични стволови клетки от пъпна кръв значително увеличава риска от неуспех на присадката и рецидив на заболяването. Следователно, трансплантацията на хемопоетични стволови клетки от пъпна кръв се използва главно за лечение на хемобластози при деца.

За съжаление, все още няма стандарти за набавяне или стандартизирани протоколи за клиничното използване на хематопоетични клетки от пъпна кръв. Съответно, самите стволови клетки от пъпна кръв не са законно признат източник на хематопоетични клетки за трансплантация. Освен това, няма етични или правни норми, регулиращи дейността и организацията на банките за пъпна кръв, каквито съществуват в чужбина. Междувременно, за безопасна трансплантация, всички проби от пъпна кръв трябва да бъдат внимателно наблюдавани. Преди вземане на кръв от бременна жена, трябва да се получи нейното съгласие. Всяка бременна жена трябва да бъде изследвана за носителство на HBsAg, наличие на антитела срещу вируси на хепатит C, HIV и сифилис. Всяка проба от пъпна кръв трябва да бъде тествана стандартно за брой ядрени клетки, CD34+ и способност за образуване на колонии. Освен това се извършва HbA типизиране, определяне на кръвната група по ABO и принадлежността ѝ по Rh фактор. Необходимите процедури за изследване са бактериологично посявка за стерилност, серологично изследване за HIV-1 и HIV-2 инфекции, HBsAg, вирусен хепатит C, цитомегаловирусна инфекция, HTLY-1 и HTLY-II, сифилис и токсоплазмоза. Освен това се извършва полимеразна верижна реакция за откриване на цитомегаловирус и HIV инфекции. Изглежда препоръчително протоколите за изследване да се допълнят с анализ на GSC от пъпна връв за откриване на генетични заболявания като α-таласемия, сърповидно-клетъчна анемия, аденозин деаминазен дефицит, агамаглобулинемия на Брутон, болести на Хърлер и Понтер.

Следващият етап от подготовката за трансплантация е въпросът за запазването на хематопоетичните стволови клетки. Най-опасните процедури за жизнеспособността на клетките по време на тяхното приготвяне са замразяването и размразяването. При замразяване на хематопоетичните клетки значителна част от тях може да бъде унищожена поради образуване на кристали. За намаляване на процента на клетъчна смърт се използват специални вещества - криопротектори. Най-често като криопротектор се използва DMSO в крайна концентрация от 10%. DMSO в такава концентрация обаче се характеризира с директен цитотоксичен ефект, който се проявява дори при условия на минимално облъчване. Намаляването на цитотоксичния ефект се постига чрез стриктно поддържане на нулева температура на режима на облъчване, както и спазване на правилата за обработка на материала по време и след размразяване (скорост на всички манипулации, използване на многократни процедури за измиване). Не трябва да се използват концентрации на DMSO под 5%, тъй като това причинява масивна смърт на хематопоетичните клетки по време на периода на замразяване.

Наличието на еритроцитни примеси в суспензионната смес от хематопоетични стволови клетки създава риск от развитие на реакция на несъвместимост за еритроцитни антигени. Същевременно, когато еритроцитите се отстраняват, загубата на хематопоетични клетки се увеличава значително. В тази връзка е предложен метод за нефракционирано изолиране на хематопоетични стволови клетки. В този случай се използва 10% разтвор на DMSO и охлаждане с постоянна скорост (GS/мин) до -80°C, за да се предпазят ядрените клетки от вредното въздействие на ниските температури, след което клетъчната суспензия се замразява в течен азот. Смята се, че този метод на криоконсервация води до частичен лизис на еритроцитите, така че кръвните проби не изискват фракциониране. Преди трансплантация клетъчната суспензия се размразява, промива се от свободен хемоглобин и DMSO в разтвор на човешки албумин или в кръвен серум. Запазването на хематопоетичните прекурсори при използване на този метод наистина е по-високо, отколкото след фракциониране на кръв от пъпна връв, но рискът от трансфузионни усложнения поради трансфузия на ABO-несъвместими еритроцити остава.

Създаването на банкова система за съхранение на HLA-тествани и типизирани проби от HSC би могло да реши горепосочените проблеми. Това обаче изисква разработване на етични и правни норми, които в момента само се обсъждат. Преди създаването на банкова мрежа е необходимо да се приемат редица разпоредби и документи относно стандартизацията на процедурите за събиране, фракциониране, тестване и типизиране, както и криоконсервация на HSC. Задължително условие за ефективното функциониране на банките за HSC е организирането на компютърна база за взаимодействие с регистрите на Световната асоциация на донорите на костен мозък (WMDA) и Националната програма за донорство на костен мозък на Съединените щати (NMDP).

Освен това е необходимо да се оптимизират и стандартизират методите за in vitro разширяване на HSC, предимно на хематопоетични клетки от пъпна връв. Разширяването на HSC от пъпна връв е необходимо за увеличаване на броя на потенциалните реципиенти, съвместими с HLA системата. Поради малките обеми на пъпна връв, броят на HSC, съдържащи се в нея, обикновено не е в състояние да осигури репопулация на костен мозък при възрастни пациенти. В същото време, за да се извършват несвързани трансплантации, е необходим достъп до достатъчен брой типизирани проби от HSC (от 10 000 до 1 500 000 на реципиент).

Трансплантацията на хемопоетични стволови клетки не елиминира усложненията, които съпътстват трансплантацията на костен мозък. Анализът показва, че при трансплантация на стволови клетки от пъпна кръв, тежки форми на остра реакция на присадка срещу гостоприемник се развиват при 23% от реципиентите, а хронични форми - при 25% от реципиентите. При онкохематологични пациенти рецидиви на остра левкемия през първата година след трансплантация на стволови клетки от пъпна кръв се наблюдават в 26% от случаите.

През последните години методите за трансплантация на периферни хемопоетични стволови клетки се развиват интензивно. Съдържанието на HSC в периферната кръв е толкова малко (1 HSC на 100 000 кръвни клетки), че изолирането им без специална подготовка няма смисъл. Следователно, на донора първо се прилага курс на лекарствена стимулация на освобождаването на хемопоетични клетки от костния мозък в кръвта. За тази цел се използват такива далеч не безвредни лекарства като циклофосфамид и гранулоцитен колониостимулиращ фактор. Но дори след процедурата по мобилизиране на HSC в периферната кръв, съдържанието на CD34+ клетки в нея не надвишава 1,6%.

За мобилизация на хемопоетични стволови клетки в клиниката най-често се използва S-SEC, която се характеризира с относително добра поносимост, с изключение на почти естествената поява на костна болка. Трябва да се отбележи, че използването на съвременни кръвни сепаратори позволява ефективно изолиране на хемопоетични стволови клетки. Въпреки това, при нормални условия на хематопоеза, трябва да се извършат поне 6 процедури, за да се получи достатъчен брой хемопоетични стволови клетки, сравними по капацитет за репопулация със суспензия от костен мозък. Всяка такава процедура изисква 10-12 литра кръв, която да се обработи на сепаратора, което може да причини тромбоцитопения и левкопения. Процедурата по разделяне включва въвеждането на антикоагулант (натриев цитрат) на донора, което обаче не изключва контактна активация на тромбоцитите по време на екстракорпорално центрофугиране. Тези фактори създават условия за развитие на инфекциозни и хеморагични усложнения. Друг недостатък на метода е значителната вариабилност на мобилизационния отговор, което изисква наблюдение на съдържанието на HSCs в периферната кръв на донорите, необходимо за определяне на максималното им ниво.

Автогенната трансплантация на хемопоетични стволови клетки, за разлика от алогенната трансплантация, напълно елиминира развитието на реакция на отхвърляне. Съществен недостатък на автотрансплантацията на хемопоетични стволови клетки, който ограничава обхвата на показанията за нейното прилагане, обаче е високата вероятност за реинфузия на левкемични клонирани клетки с трансплантата. Освен това, липсата на имунно-медиирания ефект „присадка срещу тумор“ значително увеличава честотата на рецидивите на злокачествени кръвни заболявания. Следователно, единственият радикален метод за елиминиране на неопластичната клонална хематопоеза и възстановяване на нормалната поликлонална хематопоеза при миелодиспластични синдроми остава интензивната полихимиотерапия с трансплантация на алогенна хематопоеза.

Но дори и в този случай, лечението на повечето хемобластози е насочено само към увеличаване на времето за преживяемост на пациентите и подобряване на качеството им на живот. Според няколко големи проучвания, дългосрочна преживяемост без рецидив след алотрансплантация на ХСК се постига при 40% от онкохематологичните пациенти. При използване на стволови клетки от HLA-съвместим брат/сестра, най-добри резултати се наблюдават при млади пациенти с кратка анамнеза на заболяването, брой бластни клетки до 10% и благоприятна цитогенетика. За съжаление, смъртността, свързана с процедурата по алотрансплантация на ХСК при пациенти с миелодиспластични заболявания, остава висока (в повечето доклади - около 40%). Резултатите от 10-годишната работа на Националната програма за донорство на костен мозък в САЩ (510 пациенти, средна възраст - 38 години) показват, че преживяемостта без рецидив за две години е 29% с относително ниска вероятност за рецидив (14%). Въпреки това, смъртността, свързана с процедурата на алотрансплантация на ХСК от несвързан донор, е изключително висока и достига 54% за период от две години. Подобни резултати са получени в европейско проучване (118 пациенти, медиана на възрастта - 24 години, двугодишна преживяемост без рецидив - 28%, рецидив - 35%, смъртност - 58%).

По време на интензивни курсове на химиотерапия с последващо възстановяване на хематопоезата с алогенни хематопоетични клетки, често възникват имунохематологични и трансфузионни усложнения. Те до голяма степен се дължат на факта, че човешките кръвни групи се унаследяват независимо от MHC молекулите. Следователно, дори ако донорът и реципиентът са съвместими по отношение на основните HLA антигени, техните еритроцити могат да имат различни фенотипове. Прави се разлика между „голяма“ несъвместимост, когато реципиентът има предварително съществуващи антитела към еритроцитните антигени на донора, и „малка“ несъвместимост, когато донорът има антитела към еритроцитните антигени на реципиента. Възможни са случаи на комбинация от „голяма“ и „малка“ несъвместимост.

Резултатите от сравнителен анализ на клиничната ефективност на алотрансплантацията на хемопоетични стволови клетки от костен мозък и пъпна кръв при хемобластози показват, че при деца след алотрансплантация на хемопоетични стволови клетки от пъпна кръв рискът от развитие на реакция „присадка срещу гостоприемник“ е значително намален, но се наблюдава по-дълъг период на възстановяване на броя на неутрофилите и тромбоцитите с по-висока честота на 100-дневна посттрансплантационна смъртност.

Проучването на причините за ранна смъртност позволи да се изяснят противопоказанията за алогенна трансплантация на HSC, сред които най-важните са:

• наличие на положителни тестове за цитомегаловирусна инфекция при реципиента или донора (без превантивно лечение);
• остра лъчева болест;
• наличието или дори съмнението за наличие на микотична инфекция при пациент (без провеждане на системна ранна профилактика с фунгицидни лекарства);
• хемобластози, при които пациентите са получавали дългосрочно лечение с цитостатици (поради високата вероятност от внезапен сърдечен арест и полиорганна недостатъчност);
• трансплантация от HLA-неидентични донори (без профилактика на остра реакция „присадка срещу гостоприемник“ с циклоспорин А);
• хроничен вирусен хепатит C (поради високия риск от развитие на вено-оклузивно заболяване на черния дроб).

По този начин, трансплантацията на HSCs може да причини сериозни усложнения, които често водят до смърт. В ранния (до 100 дни след трансплантацията) период те включват инфекциозни усложнения, остра реакция на присадката срещу гостоприемника, отхвърляне на присадката (неуспех на донорските HSCs), вено-оклузивно чернодробно заболяване, както и увреждане на тъканите, причинено от токсичността на режима на кондициониране, който се характеризира с висока степен на ремоделиране (кожа, съдов ендотел, чревен епител). Усложненията в късния посттрансплантационен период включват хронична реакция на присадката срещу гостоприемника, рецидиви на основното заболяване, забавяне на растежа при деца, дисфункция на репродуктивната система и щитовидната жлеза и увреждане на очите.

Наскоро, във връзка с публикациите за пластичността на клетките на костния мозък, възникна идеята за използване на HSCs за лечение на инфаркти и други заболявания. Въпреки че някои експерименти с животни подкрепят тази възможност, заключенията за пластичността на клетките на костния мозък е необходимо да бъдат потвърдени. Това обстоятелство трябва да се вземе предвид от онези изследователи, които смятат, че трансплантираните човешки клетки от костен мозък лесно се трансформират в клетки на скелетните мускули, миокарда или ЦНС. Хипотезата, че HSCs са естествен клетъчен източник на регенерация на тези органи, изисква сериозни доказателства.

По-специално, публикувани са първите резултати от отворено рандомизирано проучване на В. Беленков (2003). Целта му е била да се проучи ефектът на C-SvK (т.е. мобилизация на автоложни HSCs в кръвта) върху клиничния, хемодинамичния и неврохуморалния статус на пациенти с умерена до тежка хронична сърдечна недостатъчност, както и да се оцени неговата безопасност на фона на стандартна терапия (инхибитори на ангиотензин-конвертиращия ензим, бета-блокери, диуретици, сърдечни гликозиди). В първата публикация на резултатите от проучването авторите на програмата отбелязват, че единственият аргумент в полза на O-SvK са резултатите от лечението на един пациент, който е показал безспорно подобрение във всички клинични и хемодинамични параметри на фона на терапия с това лекарство. Теорията за мобилизация на HSCs в кръвния поток с последваща миокардна регенерация в постинфарктната зона обаче не е потвърдена - дори при пациент с положителна клинична динамика, стрес ехокардиографията с добутамин не е разкрила появата на зони на жизнеспособен миокард в областта на белега.

Трябва да се отбележи, че понастоящем очевидно няма достатъчно данни, за да се препоръча заместителна клетъчна терапия за широко приложение в ежедневната клинична практика. Необходими са добре разработени и висококачествени клинични проучвания, за да се определи ефективността на различните варианти за регенеративна клетъчна терапия, да се разработят показания и противопоказания за нея, както и насоки за комбинирано приложение на регенеративно-пластична терапия и традиционно хирургично или консервативно лечение. Все още няма отговор на въпроса коя конкретна популация от клетки от костен мозък (стволови хематопоетични или стромални) може да даде началото на неврони и кардиомиоцити, а също така не е ясно какви условия допринасят за това in vivo.

Работа в тези области се провежда в много страни. В резюмето на симпозиума за остра чернодробна недостатъчност на Националните здравни институти на САЩ, сред обещаващите методи на лечение, наред с чернодробната трансплантация, се отбелязва трансплантацията на ксено- или алогенни хепатоцити и екстракорпоралното свързване на биореактори с чернодробни клетки. Има преки доказателства, че само чужди функционално активни хепатоцити са способни да осигурят ефективна подкрепа на черния дроб на реципиента. За клиничното използване на изолирани хепатоцити е необходимо да се създаде клетъчна банка, която значително ще намали времето между изолирането на клетките и тяхното използване. Най-приемливият метод за създаване на банка от изолирани хепатоцити е криоконсервацията на чернодробни клетки в течен азот. При използване на такива клетки в клиниката при пациенти с остра и хронична чернодробна недостатъчност е разкрит сравнително висок терапевтичен ефект.

Въпреки оптимистичните и окуражаващи резултати от трансплантацията на чернодробни клетки в експерименти и клинична практика, все още има много проблеми, които далеч не са решени. Те включват ограничения брой органи, подходящи за получаване на изолирани хепатоцити, недостатъчно ефективни методи за тяхното изолиране, липса на стандартизирани методи за запазване на чернодробни клетки, неясни представи за механизмите на растеж и регулация на пролиферацията на трансплантираните клетки, липса на адекватни методи за оценка на присаждането или отхвърлянето на алогенни хепатоцити. Това включва и наличието на трансплантационен имунитет при използване на алогенни и ксеногенни клетки, макар и по-малък, отколкото при ортотопична чернодробна трансплантация, но изискващ използването на имуносупресори, капсулиране на изолирани хепатоцити или специалното им третиране с ензими. Трансплантацията на хепатоцити често води до имунен конфликт между реципиента и донора под формата на реакция на отхвърляне, което изисква използването на цитостатици. Едно от решенията на този проблем може да бъде използването на полимерни микропорести носители за изолиране на чернодробни клетки, което ще подобри тяхното оцеляване, тъй като капсулната мембрана ефективно защитава хепатоцитите въпреки имунизацията на гостоприемника.

Въпреки това, при остра чернодробна недостатъчност, подобна трансплантация на хепатоцити е неефективна поради относително дългото време, необходимо на чернодробните клетки да се присадят в нова среда и да достигнат етапа на оптимално функциониране. Потенциално ограничение е секрецията на жлъчка по време на ектопична трансплантация на изолирани хепатоцити, а при използване на биореактори значителна физиологична бариера е видовото несъответствие между човешките протеини и протеините, произвеждани от ксеногенни хепатоцити.

В литературата има съобщения, че локалната трансплантация на стромални стволови клетки от костен мозък улеснява ефективната корекция на костните дефекти, а възстановяването на костната тъкан в този случай протича по-интензивно, отколкото при спонтанна репаративна регенерация. Няколко предклинични проучвания върху експериментални модели убедително демонстрират възможността за използване на трансплантации на стромални клетки от костен мозък в ортопедията, въпреки че е необходима допълнителна работа за оптимизиране на тези методи, дори в най-простите случаи. По-специално, все още не са открити оптимални условия за разширяване на остеогенни стромални клетки ex vivo, а структурата и съставът на техния идеален носител (матрица) остават неразвити. Минималният брой клетки, необходими за обемна костна регенерация, не е определен.

Доказано е, че мезенхимните стволови клетки проявяват трансгерминална пластичност, т.е. способността да се диференцират в клетъчни типове, фенотипно несвързани с клетките на оригиналната линия. При оптимални условия на култивиране, поликлоналните линии на стромални стволови клетки от костен мозък могат да издържат на повече от 50 деления in vitro, което прави възможно получаването на милиарди стромални клетки от 1 ml аспират от костен мозък. Популацията на мезенхимните стволови клетки обаче е хетерогенна, което се проявява както с вариабилност в размера на колониите, различна скорост на тяхното образуване, така и с морфологично разнообразие на клетъчните типове, от фибробластоподобни вретеновидни до големи плоски клетки. Фенотипна хетерогенност се наблюдава само след 3 седмици култивиране на стромални стволови клетки: някои колонии образуват нодули от костна тъкан, други образуват струпвания от адипоцити, а трети, по-рядко, образуват острови от хрущялна тъкан.

Трансплантацията на ембрионална нервна тъкан първоначално е била използвана за лечение на дегенеративни заболявания на централната нервна система. През последните години вместо ембрионална мозъчна тъкан са трансплантирани клетъчни елементи от невросфери, получени от невронни стволови клетки (Полтавцева, 2001). Невросферите съдържат ангажирани прекурсори на неврони и невроглия, което дава надежда за възстановяване на загубените мозъчни функции след трансплантацията им. След трансплантация на диспергирани невросферни клетки в стриатумната област на мозъка на плъхове е наблюдавана тяхната пролиферация и диференциация в допаминергични неврони, което елиминира двигателната асиметрия при плъхове с експериментален хемипаркинсонизъм. В някои случаи обаче от невросферни клетки се развиват тумори, което води до смърт на животните (Бьорклунд, 2002).

В клиниката, внимателни проучвания на две групи пациенти, при които нито пациентите, нито наблюдаващите ги лекари знаеха (двойно сляпо проучване), че на едната група пациенти е трансплантирана ембрионална тъкан с неврони, произвеждащи допамин, а на втората група пациенти е направена фалшива операция, дадоха неочаквани резултати. Пациентите, на които е трансплантирана ембрионална нервна тъкан, не се чувстваха по-добре от пациентите в контролната група. Освен това, 5 от 33 пациенти развиха персистираща дискинезия 2 години след трансплантация на ембрионална нервна тъкан, която не беше налице при пациентите в контролната група (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health. USA). Един от нерешените проблеми на клиничните изследвания на невронните стволови клетки на мозъка остава анализът на реалните перспективи и ограничения на трансплантацията на техни производни за коригиране на нарушения на ЦНС. Възможно е невроногенезата в хипокампуса, предизвикана от продължителна гърчова активност, водеща до нейната структурна и функционална реорганизация, да е фактор за прогресивното развитие на епилепсия. Това заключение заслужава специално внимание, тъй като посочва възможните негативни последици от генерирането на нови неврони в зрелия мозък и формирането на аберантни синаптични връзки от тяхна страна.

Не бива да се забравя, че култивирането в среди с цитокини (митогени) доближава характеристиките на стволовите клетки до тези на туморните клетки, тъй като в тях настъпват подобни промени в регулацията на клетъчните цикли, определящи способността за неограничено делене. Неразумно е да се трансплантират ранни производни на ембрионални стволови клетки в човек, тъй като в този случай заплахата от развитие на злокачествени новообразувания е много висока. Много по-безопасно е да се използва по-ангажираното им потомство, т.е. прекурсорни клетки от диференцирани линии. В момента обаче все още не е разработена надеждна техника за получаване на стабилни линии от човешки клетки, които се диференцират в желаната посока.

Използването на технологии на молекулярната биология за коригиране на наследствена патология и човешки заболявания чрез модифициране на стволови клетки представлява голям интерес за практическата медицина. Характеристиките на генома на стволовите клетки позволяват разработването на уникални схеми за трансплантация за коригиране на генетични заболявания. В тази област обаче съществуват редица ограничения, които трябва да бъдат преодолени преди практическото приложение на генното инженерство на стволови клетки. На първо място е необходимо да се оптимизира процесът на ex vivo модификация на генома на стволови клетки. Известно е, че дългосрочната (3-4 седмици) пролиферация на стволови клетки намалява тяхната трансфекция, така че са необходими няколко цикъла на трансфекция, за да се постигне високо ниво на тяхната генетична модификация. Основният проблем обаче е свързан с продължителността на терапевтичната генна експресия. Досега, в нито едно проучване, периодът на ефективна експресия след трансплантация на модифицирани клетки не е надвишавал четири месеца. В 100% от случаите, с течение на времето, експресията на трансфектираните гени намалява поради инактивиране на промотори и/или смърт на клетки с модифициран геном.

Важен въпрос е цената на използването на клетъчни технологии в медицината. Например, очакваната годишна нужда за финансиране само на медицинските разходи на отделение за трансплантация на костен мозък, предназначено за извършване на 50 трансплантации годишно, е около 900 000 щатски долара.

Развитието на клетъчните технологии в клиничната медицина е сложен и многоетапен процес, който включва конструктивно сътрудничество между мултидисциплинарни научни и клинични центрове и международната общност. Същевременно, въпросите на научната организация на изследванията в областта на клетъчната терапия изискват специално внимание. Най-важните от тях са разработването на протоколи за клинични изследвания, контролът върху надеждността на клиничните данни, формирането на национален регистър на изследванията, интегрирането в международни програми за многоцентрови клинични изследвания и внедряването на резултатите в клиничната практика.

В заключение на въведението към проблемите на клетъчната трансплантология, бих искал да изразя надеждата, че обединяването на усилията на водещи украински специалисти от различни области на науката ще осигури значителен напредък в експерименталните и клиничните изследвания и ще даде възможност през следващите години да се намерят ефективни начини за оказване на помощ на тежко болни хора, нуждаещи се от трансплантация на органи, тъкани и клетки.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]