Хематопоетични стволови клетки

Хематопоетични стволови клетки (HSCs) като мезенхимни прародителски клетки се характеризират с мултипотентност и да доведат до клетъчни линии, крайни елементи, които образуват кръвни клетки и някои специализирани тъканни клетки на имунната система.

Хипотезата за съществуването на общ прародител на всички кръвни клетки, както и терминът "стволови клетки", собственост на А. Максимов (1909) Потенциалният формирането на клетъчната маса от GSK огромен -. Костен мозък стволови клетки произвеждат 10-ия ден клетките, които изграждат кръвни телца на самия периферното устройство. Наличието на хематопоетични стволови клетки, е създадена през 1961 г. В експерименти върху възстановяването на хематопоезата на мишки, получаващи летална доза от излагане на радиация, който унищожава костния мозък стволови клетки. Поз т.е. Трансплантация на сингенни клетки от костен мозък, така смъртоносно облъчени животни дискретни огнища на хематопоезата са открити в далака на получателите чийто източник - единични клоногенни прогениторни клетки.

След това се демонстрира способността на хематопоетичните стволови клетки да се самоподдържат, което осигурява функцията на хематопоезата по време на онтогенезата. В процеса на ембрионално развитие, HSC се характеризират с висока миграционна активност, която е необходима за тяхната миграция към местата на хематопоетичните органи. Това свойство на HSC се запазва и в онтогенезата - поради постоянната им миграция се извършва постоянно обновяване на групата от имунокомпетентни клетки. Способността на GSK миграция, проникване през бариери кръвната тъкан, имплантиране в растежа на тъканите и клоногенен предвидено в основата на клетки за трансплантация на костен мозък в редица заболявания, свързани с нарушения на хемопоетичен система.

Подобно на всички ресурси на стволови клетки, хемопоетични стволови клетки присъстват във вашата ниша (на костния мозък) в много малки количества, което води до някои трудности в разпределението им. Имунофенотипни човешки HSCs се характеризират като CD34 + NK клетки, способни да мигрират в кръвния поток и колонизират органи на имунната система или да населят строма на костен мозък. Необходимо е ясно да се разбере, че GSK не е най-незрели клетки от костен мозък, и са получени от прекурсори, които включват dormantnye фибробластни SB34-отрицателни клетки. Установено е, че клетките с фенотипа на CD34 са в състояние да влезе в кръвния поток, където променят фенотип в CD34 +, но миграцията връщане в костния мозък под влиянието на микросредата отново стане CD34-отрицателни стволови клетки елементи. В покой, CD34-клетките не реагират на паракринни регулаторни стромални сигнали (растежни фактори, цитокини). Въпреки това, в ситуации, които изискват интензитет усилване хематопоетични стволови клетки с CD34 на фенотип отговори на диференциация сигнали образуват хематопоетични както и мезенхимни клетки предшественици. Хематопоеза се извършва чрез директен контакт с GSK клетъчни елементи на стромата на костен мозък представени сложна мрежа от макрофаги, ретикуларни ендотелни клетки, остеобласти, стромални фибробласти и извънклетъчна матрица. Костен мозък стромален рамка - не само матрица или "скелет" за хематопоетични тъкани, носи фино регулиране на хематопоезата поради паракринни регулаторни сигнали на растежни фактори, цитокини и хемокини, и също така осигурява адхезивни взаимодействия, необходими за образуването на кръвни клетки.

По този начин, основата на постоянно актуализираната система на хемопоеза е хемопоетична стволова клетка, която е способна на продължително самосъхранение. По време на процеса на извършване, HSC претърпят първична диференциация и образуват клонинги на клетки, които се различават по техните цитоморфологични и имунофенотипни характеристики. Последователното образуване на примитивни и ангажирани прогениторни клетки се допълва от формирането на морфологично идентифицируеми клетки на предшественици на различни хематопоетични линии. Резултатът от следващите етапи комплекс многостепенен процес е узряването на хематопоетични клетки и зрели добив на периферна кръв оформени елементи - еритроцити, левкоцити, лимфоцити и тромбоцити.

[1], [2], [3],

Източници на хематопоетични стволови клетки

Хематопоетични стволови клетки се считат за най проучен стволови източник, което се дължи главно на използването им в клиниката на трансплантация на костен мозък. На пръв поглед много се знае за тези клетки. До известна степен това е вярно, тъй като междинните и зрели потомци GSK - най-достъпни клетъчни елементи, всеки от които (еритроцити, левкоцити, лимфоцити, моноцити / макрофаги и тромбоцити) са напълно проучени на всички нива - от светлина за електронна микроскопия, от биохимични и имунофенотипни характеристики преди идентифициране чрез PCR анализ. Въпреки това, мониторинг, извършена от морфологични, ултраструктурната, биохимични, имунофенотипни и биофизични параметри на геномна GSK, не ни дава отговори на много проблемни въпроси, е необходимо за развитието на клетъчната трансплантация, чието решаване. Той все още не е установен механизми за стабилизиране на GSK в латентно състояние, те се активират, въведете етап на симетрична или асиметрична разделението и най-важното - на ангажимент към образованието като функционално различни кръвни клетки, еритроцити, левкоцити, лимфоцити и тромбоцити.

Наличието на клетки от костен мозък с фенотипа на CD34, които са предшественици на мезенхимни както и хематопоетични стволови клетки повдига въпроса за съществуването на най-ранния края на CD34-отрицателни клетки в диференциацията на стволови клетки и хематопоетични стромален линия. Продължителен метод култивиране се получава чрез така наречения дългосрочно култура "откриване" клетки (дългосрочно култура започване клетка - LTC-IC). Животът на такива прогениторни клетки в образуващи колония активност на костния мозък стромален базира на комбинация от растежни фактори е повече от 5 седмици, докато жизнеспособността на извършените образуващи колонии единици (CFU) в култура само три седмици. Понастоящем се смята, че LTC-IC - функционален аналог GCW като repopulyatsionnom при висок потенциал от около 20% LTC-IC се характеризират с фенотип CD34 + CD38- и имат висок капацитет за самообновяване. Такива клетки са намерени в човешки костен мозък с честотата на 1:50 000. Въпреки това, следва да бъдат признати limfoidoinitsiiruyuschie-миелоидни клетки най-близо до ХСК, които са получени при условия на дългосрочно (15 седмици) на културата. Такива клетки са означени като LTC, сред клетки от човешки костен мозък са открити в 10 пъти по-малко от LTC-IC, и е оформена като миелоидни клетъчни линии и лимфоидна хемопоетичен стебло.

Въпреки хематопоетични стволови клетки етикетиране с моноклонални антитела, последвано от определяне на имунофенотипни е основният метод за идентифициране и селективно сортиране на хематопоетични стволови клетки с потенциалната клинична използването на специален GSK така ограничен. Блокиране рецепторни антитела CD34 или други маркерни антигени при сортирането имунопозитивните неизбежно променя свойствата на клетки, изолирани с него. По-предпочитана е имуно-отрицателната секреция на HSC върху магнитни колони. Въпреки това, в този случай, за сортиране обикновено се използва моноклонални антитела, фиксирани върху метална подкрепа. Също така, важното е, че и двата метода за разпределение на GSK въз основа на фенотипните, отколкото функционални характеристики. Ето защо, много изследователи предпочитат да използват анализа на Клоногенните параметри GSK, което позволява на размера и състава на колониите, за да се определи степента на зрялост и посоката на диференциация на стволови клетки. Известно е, че в процеса на извършване на броя на клетките, както и броя на видовете в колониите се намалява. Хематопоетични стволови клетки и нейните дъщерни клетки рано, наречен "гранулоцит-еритроцитите моноцит-megakariotsitokolonieobrazuyuschaya единица" (ДЛ-GEMM), създаване на култура многопараметричен големи колонии, съдържащи, съответно, гранулоцити, еритроцити, моноцити и мегакариоцити. Разположена под устройството за линия гранулоцит-линия monotsitokolonieobrazuyuschaya ангажимент (ДЛ-GM) генерира колонии от гранулоцити и макрофаги, и гранулоцитни колонии образуващи единици (ДЛ-G) - само малки колонии от зрели гранулоцити. Ранно еритроцитите предшественик - burstoobrazuyuschaya единица на червените кръвни клетки (ДЛ-Е) - е източник на голям и по-зрели червени кръвни клетки колония единица образуваща (ДЛ-Е) - малки червени кръвни клетки колонии. В общата популация, с растежа на клетките в полутвърди носители могат да се идентифицират клетки, които са шест вида миелоидни колонии: ДЛ-GEMM, GM-ДЛ, ДЛ-G, М-ДЛ, ВСУ-Е и E-ДЛ).

Обаче в допълнение към хематопоетичните производни, всеки изходен материал за изолирането на HSC съдържа значителен брой съпътстващи клетки. В тази връзка е необходимо предварителното пречистване на трансплантанта, на първо място, на активните клетки на имунната система на донора. Обикновено за тази цел се използва имуносекция, основаваща се на лимфоцитна експресия на специфични антигени, което прави възможно изолирането и отстраняването им с използване на моноклонални антитела. В допълнение, техника immunorozetochnaya Т-лимфоцити обеднен трансплантация на костен мозък, което се основава на образуването на комплекси на CD4 + лимфоцити и специфични моноклонални антитела ефективно отстранява с помощта на афереза. Тази техника осигурява пречистен клетъчен материал с 40-60% хематопоетични стволови клетки.

Увеличаването на броя на прогениторни клетки поради отстраняването на зрели кръвни клетки от левкофереза продукт се постига чрез противоток центрофугиране, последвано от филтруване (в присъствието на хелатора - тринатриев цитрат) през колона, съдържаща найлонови влакна, покрити с човешки имуноглобулин. Последователното използване на тези две техники осигурява пълно почистване на присадката от тромбоцити от 89% - на еритроцитите и с 91% - от левкоцити. Поради значително намаляване на загубите от HSC, нивото на CD34 + клетките в общата клетъчна маса може да се увеличи до 50%.

За функционалните характеристики на изолираните хемопоетични стволови клетки се използва тяхната способност да създават колонии от зрели кръвни елементи в култура. Анализът на образуваните колонии прави възможно идентифицирането и количественото определяне на видовете прогениторни клетки, степента на тяхното извършване и установяването на посоката на тяхната диференциация. Клоногенната активност се определя в полутвърда среда върху метилцелулоза, агар, плазма или фибринов гел, което намалява миграционната активност на клетките, което предотвратява прикрепването им към повърхността на стъкло или пластмаса. При оптимални условия на култивиране, клонове от една клетка се развиват в рамките на 7-18 дни. Ако в клона има по-малко от 50 клетки, той се идентифицира като един клъстер, ако броят на клетките надвишава 50 - като колония. Броят клетки, способни да образуват колония (колонии, образуващи единици - CFU или клетки, образуващи колонии - COCs), се вземат под внимание. Трябва да се отбележи, че параметрите и CFU СОС не съответстват на броя на HSC в клетъчната суспензия, въпреки че корелира с това отново подчертава необходимостта от определяне на функционалната (образуващи колония) активност на HSCs ин витро.

Сред клетките на костния мозък, хематопоетичните стволови клетки имат най-голям пролиферативен потенциал, поради което се формират най-големите колонии в култура. Чрез броя на такива колонии се предлага индиректно да се определи броят на стволовите клетки. След образуването на колонии ин витро над 0,5 мм в диаметър и с броя на клетките, 1000, авторите са тествани стабилността на тези клетки да сублетални дози от 5-флуороурацил и изследват способността им да населят костния мозък смъртоносно облъчени животни. Според тези параметри, изолираните клетки не се различават много от HSC и получават символа за съкращение HPP-CFC - образуващи колонии клетки с висок пролиферативен потенциал.

Търсенето на възможност за по-качествен подбор на хематопоетични стволови клетки продължава. Въпреки това, хематопоетични стволови клетки са морфологично подобни на лимфоцити и са относително еднакво събиране на клетки с почти кръгли ядра, хроматин и slabobazofilnoy частици малко количество цитоплазмата. Точният брой също е трудно да се определи. Предполага се, че GSK в костния мозък на човек се появява с честота от 1 на 106 клетки, съдържащи ядро.

Идентификация на хематопоетични стволови клетки

За подобряване на идентифициране на хематопоетични стволови клетки се извършва последователно, или едновременно (на многоканална сорбитан Tere) изследвания membrannosvyazannyh спектър на антигени, в които GSK фенотип CD34 + CD38 трябва да се съчетае с липсата на маркери за диференциация линеен, по-специално антигени на имунокомпетентни клетки като CD4, и повърхностните имуноглобулини гликофорин.

Практически всички схеми на фенотипизиране на хематопоетични стволови клетки включват определяне на CD34 антиген. Това гликопротеин с молекулна маса от около 110 Ша, носещи няколко места на гликозилиране, експресирани на плазмена клетъчна мембрана след активиране на гена, локализиран на хромозома 1. CD34 молекули функционират свързани с L-selektinoposredovannym взаимодействие на ранните хематопоетични прогениторни клетки от строма на костен мозък основа. Въпреки това, трябва да се помни, че наличието на CD34 антиген на клетъчната повърхност позволява само направи предварителна оценка на съдържанието на GSK в клетъчната суспензия, тъй като тя се експресира, и други хематопоетични прогениторни клетки и костен мозък стромални клетки и ендотелни клетки.

По време на диференциацията на хемопоетичните прогениторни клетки експресията на CD34 е постоянно намалена. Еритроцитни, гранулоцитни и моноцитно свързани прогениторни клетки или слабо експресират CD34 антиген, или изобщо липсват на тяхната повърхност (фенотип CD34). На повърхностната мембрана на диференцирани клетки на костния мозък и зрелите кръвни клетки не се открива CD34 антиген.

Трябва да се отбележи, че в динамиката на диференциацията на хематопоетични прогениторни клетки не само намалява нивото на експресия на CD34, но успоредни постепенно повишена експресия на CD38 антиген - интегрален мембранен гликопротеин с молекулно тегло от 46 Ша като NAD-glikogidrolaznoy и АОР-рибозил циклазна активност, което предполага участието си в транспорта и синтеза на ADP-рибоза. По този начин съществува възможност за двоен контрол на степента на извършване на хемопоетичните прогениторни клетки. Популация от клетки с фенотип CD34 + CD38 +, 90-99% CD34-позитивни клетки от костен мозък се състои от прогениторни клетки с ограничено пролиферативен потенциал и диференциация, а с фенотип CD34 + CD38 клетки могат да претендират ролята GSK.

Наистина, популацията от клетки на костен мозък, описани с формула CD34 + CD38- съдържа относително голям брой примитивни стволови клетки, които могат да се диференцират в миелоидните и лимфоидните посоки. В контекста на дългосрочно култивиране с фенотипа на CD34 + CD38- клетки успяват да получите всички зрели кръвни клетки: неутрофили, еозинофили, базофили, моноцити, мегакариоцитите, еритроцитите и лимфоцити.

Сравнително наскоро открито, че CD34-позитивни клетки експресират още два маркер - АС 133 и CD90 (Thy-1), който също се използва за идентифициране на хематопоетични стволови клетки. Thy-1 антиген се ко-експресира с рецептора CD117 (с-кит) на CD34 + клетки от костен мозък, мозък и периферна кръв. Това fosfatidilinozitolsvyazyvayuschy повърхност гликопротеин с молекулно тегло от 25-35 Ша, който участва в клетъчната адхезия процеси. Някои автори вярват, че Thy-1 антиген е маркер на най-незрелите CD34-позитивни клетки. Възпроизвеждане клетки с фенотипа на CD34 + Thy-1 + водят до дългосрочни култивирани линии, за да образуват дъщерни клетки. Предполага се, че антигенът Thy-1 блокира регулаторните сигнали, които предизвикват спиране на клетъчното делене. Въпреки факта, че CD34 + Tu1 + клетки са способни да самообновяване и създаването на дългосрочни култивирани линии, тяхната фенотип не може да се отнася само до ХСК, както Thy-1 + съдържание на общото тегло на клетъчни елементи CD34-позитивни е около 50%, далеч над броя на хематопоетичните клетки.

По-обещаващо за идентифицирането на хемопоетичните стволови клетки е AC133, антигенен маркер на хемопоетични прогениторни клетки, чиято експресия първо беше открита върху ембрионални чернодробни клетки. AC133 е трансмембранен гликопротеин, който се появява на повърхността на клетъчната мембрана в най-ранните стадии на узряването на GSK - възможно е още по-рано от антигена CD34. В изследванията на А. Петренко и В. Гришченко (2003) беше установено, че AC133 експресира до 30% от CD34-позитивните клетки на ембрионалния черен дроб.

По този начин, идеалното фенотипна профил на хематопоетични стволови клетки от днешните понятия, сумата от клетка контур, във веригите, които трябва да присъстват CD34 антигени конфигурация, АС 133 и Thy-1, но няма място за молекулно издатини CD38, HLA-DR и маркери линеен диференциация GPA , CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

GSK фенотипна промяна портрет може да бъде комбинация от CD34 + CD45RalowCD71low, от свойствата на клетките, описани от тази формула не се различават от функционалните параметри на клетки с фенотипа CD34 + CD38. В допълнение, човешки HSC могат да бъдат идентифицирани от фенотипни признаци CD34 + Thy-л + CD38Iow / "с-кит / ниска - само 30 от тези клетки напълно възстановяване на хематопоезата на смъртоносно облъчени мишки.

От анализа на общите фенотипните характеристики на клетки от костен мозък всъщност започна 40-годишен интензивни изследвания GSK едновременно способен както самообновяване и диференциация на други клетъчни елементи, което позволява да се оправдае използването на трансплантация на костен мозък за лечение на различни заболявания на хемопоетични система. Наскоро откритите нови видове стволови клетки все още не са широко използвани в клиничната практика. Въпреки това, стволови клетки от пъпна връв (кабел) кръв и ембрионален черен дроб може значително да се разшири клетъчна трансплантация не само по хематология, но и в други области на медицината, като различни от HSC костен мозък като количествени характеристики и качествени характеристики.

Обем маса хематопоетични стволови клетки, необходими за трансплантация обикновено са получени от костен мозък, периферна кръв и мозък, както и ембрионален черен дроб. В допълнение, хематопоетични прогениторни клетки могат да бъдат получени чрез ин витро размножаване на ESC и последващото им диференциация на хематопоетични целеви клетъчни елементи. А. Петренко, В. Гришченко (2003) правилно сочат значителни разлики имунологични свойства и способността за възстановяване на кръвообразуването GSK различен произход, поради неравното съотношение се съдържа в техните източници на плурипотентни рано и по-късно ангажирани предшественици. Освен това, хематопоетични стволови клетки, получени от различни източници на стеблото, характеризиращ се количествено и качествено различни асоциации нехематопоетични клетки.

Традиционен източник на хемопоетични стволови клетки е костният мозък. Суспензия от клетки от костен мозък се получава от коремната кост или гръдната кост чрез излугване при локална анестезия. Така получената суспензия е хетерогенна и съдържа смес от HSC, стромални клетъчни елементи, ангажирани прогениторни клетки на миелоидните и лимфоидните линии, както и зрели кръвни елементи. Броят на клетките с фенотипове CD34 + и CD34 + CD38 сред мононуклеарни клетки на костен мозък е съответно 0.5 до 3.6 и 0 до 0.5%. Периферната кръв след G-CSF-индуцирана мобилизация на HSC съдържа 0.4-1.6% от CD34 + и 0-0.4% от CD34 + CD38.

По-висок процент от клетки с CD34 + CD38 имунофенотипа и кабел кръв CD34 + - и 0-0,6 OD-2,6%, а максималният им брой е открита между хематопоетични фетални чернодробни клетки - и 2,3 0,2-12,5 -35.8%, съответно.

Въпреки това, качеството на присадка материал зависи не само от количеството, съдържащо се в него на CD34 + клетки, но също така и върху тяхната функционална активност, която може да бъде определена от степента на образуване на колония ин виво (заселване мозък в смъртоносно облъчени животни) и ин витро - на растеж на колониите върху полутвърди носители , Установено е, че колония образуващи и пролиферативна активност на хемопоетични прогениторни клетки с фенотип CD34 + CD38 HLA-DR, изолиран от фетален черен дроб, ембрионален костен мозък и кръв от пъпна връв, и значително надвишава пролиферативен капацитет на хематопоетични колонии-формиращи клетки на костен мозък и периферна кръв на възрастен. Количествен и качествен анализ на GSK различен произход показа значителни разлики на относителната им съдържание в клетъчната суспензия и функционалност. Максималният брой CD34 + клетки (24,6%) е намерен в трансплантационния материал, получен от костен мозък на плода. Костният мозък на възрастен човек съдържа 2,1% от CD34-положителните клетъчни елементи. Сред мононуклеарни клетки от човешка периферна кръв възрастни само 0.5% имат фенотип CD34 +, докато кръв от пъпна връв тяхното количество достига 2%. Така колония образуващи способността на CD34 + клетки от плода на костен мозък от 2.7 пъти надхвърля капацитета на клонална растежа на хемопоетични костния мозък на възрастни човешки клетки и кръв от пъпна връв клетки образуват значително по-големи колонии от хематопоетични елементи, изолирани от периферната кръв на възрастни: 65.5 до 40 и , 8 колонии / 105 клетки, съответно.

Разликите в пролиферативна активност и способността на хемопоетични стволови клетки колонообразуващ са свързани не само с различна степен на зрялост, но и с естествената им микросреда. Известно е, че интензитетът на пролиферация и диференциране на стволови клетки скоростта, определени от неразделна регулиране влиянието на мулти-компонентна система от растежни фактори и цитокини, които са произведени от двете стволовите клетки и клетъчни елементи на матрично-стромален микросреда. Използване на пречистени клетъчни популации и свободна от серум среда с оглед на клетъчната култура дава характеризирани растежни фактори, които имат стимулиращ и инхибиторни ефекти върху стволови клетки на различни нива, прогениторни клетки и клетки на извършени в определена линейна посока. Резултатите от тези изследвания показват, че HSCs получени от източници с различни нива на онтогенетичната развитие, се различават фенотипно както и функционално. За GSK, пребиваващи на по-ранни стадии на онтогени, характеризиращи се с висок потенциал за самовъзпроизводство и висока пролиферативна активност. Такива клетки се отличават с по-дълга дължина на теломерите и се подлагат на образуване на всички хематопоетични клетъчни линии. Реакцията на имунната система към HSC ембрионален произход се забавя, тъй като такива клетки леко експресират HLA молекули. Съществува ясна градация на относителното съдържание на HSCs и способността им да самостоятелно подновяване и броя на редовете, те образуват видове ангажимент: CD34 + клетки от зародишна чернодробна> CD34 + клетки от кръв от пъпна връв> CD34 + клетки от костния мозък. Важно е, че тези разлики не са уникални за интра- и нео postanatalnomu ранен период от развитието, но също през онтогенията - пролиферативни и образуващи колония активност на HSCs получени от костен мозък или периферна кръв на възрастен, обратно пропорционално на възрастта на донора.