Хемопоетични стволови клетки

Хематопоетичните стволови клетки (HSCs), подобно на мезенхимните прогениторни клетки, се характеризират с мултипотентност и дават началото на клетъчни линии, крайните елементи на които образуват образуваните елементи на кръвта, както и редица специализирани тъканни клетки на имунната система.

Хипотезата за съществуването на общ предшественик на всички кръвни клетки, както и самият термин „стволови клетки“, принадлежи на А. Максимов (1909). Потенциалът за образуване на клетъчна маса в HSC е огромен - стволовите клетки от костен мозък ежедневно произвеждат 10 клетки, които изграждат формираните елементи на периферната кръв. Самият факт за съществуването на хемопоетични стволови клетки е установен през 1961 г. в експерименти за възстановяване на хематопоезата при мишки, получили летална доза радиоактивно облъчване, което разрушава стволовите клетки от костен мозък. След трансплантация на сингенни клетки от костен мозък на такива летално облъчени животни, в далака на реципиентите са открити дискретни огнища на хематопоеза, чийто източник са единични клоногенни прекурсорни клетки.

Тогава беше доказана способността на хематопоетичните стволови клетки за самоподдържане, осигурявайки функцията на хематопоезата в процеса на онтогенезата. В процеса на ембрионално развитие, HSCs се отличават с висока миграционна активност, необходима за движението им към зоните на формиране на хематопоетичните органи. Това свойство на HSCs се запазва и в онтогенезата - благодарение на постоянната им миграция се осъществява постоянно обновяване на пула от имунокомпетентни клетки. Способността на HSCs да мигрират, да проникват през хистохематични бариери, да се имплантират в тъканите и да се развиват клоногенно, послужи като основа за трансплантация на клетки от костен мозък при редица заболявания, свързани с патологията на хематопоетичната система.

Както всички ресурси от стволови клетки, хематопоетичните стволови клетки присъстват в своята ниша (костен мозък) в много малки количества, което причинява определени трудности при тяхното изолиране. Имунофенотипно, човешките HSC се характеризират като CD34+NK клетки, способни да мигрират в кръвния поток и да заселват органите на имунната система или да репопулират стромата на костния мозък. Трябва ясно да се разбира, че HSC не са най-незрелите клетки на костния мозък, а произхождат от прекурсори, които включват латентни фибробластоподобни CD34-негативни клетки. Установено е, че клетките с CD34 фенотип са способни да навлязат в общия кръвен поток, където променят фенотипа си на CD34+, но при обратна миграция в костния мозък, под влияние на микросредата, те отново се превръщат в CD34-негативни елементи на стволови клетки. В състояние на покой, CD34~ клетките не реагират на паракринните регулаторни сигнали на стромата (растежни фактори, цитокини). Въпреки това, в ситуации, изискващи повишена интензивност на хематопоезата, стволовите клетки с CD34 фенотип реагират на сигналите за диференциация, като образуват както хематопоетични, така и мезенхимни прогениторни клетки. Хематопоезата се осъществява чрез директен контакт на HSCs с клетъчни елементи на стромата на костния мозък, представена от сложна мрежа от макрофаги, ретикуларни ендотелни клетки, остеобласти, стромални фибробласти и извънклетъчен матрикс. Стромалната основа на костния мозък не е просто матрица или „скелет“ за хематопоетичната тъкан; тя осъществява фина регулация на хематопоезата поради паракринни регулаторни сигнали на растежни фактори, цитокини и хемокини, а също така осигурява адхезивни взаимодействия, необходими за образуването на кръвни клетки.

По този начин, постоянно обновяващата се система на хематопоезата се основава на полипотентна (от гледна точка на хематопоезата) хематопоетична стволова клетка, способна на дългосрочно самоподдържане. В процеса на ангажиране, HSCs претърпяват първична диференциация и образуват клонове на клетки, които се различават по цитоморфологични и имунофенотипни характеристики. Последователното формиране на примитивни и ангажирани прогениторни клетки завършва с образуването на морфологично идентифицируеми прогениторни клетки от различни хематопоетични линии. Резултатът от последващите етапи на сложния многоетапен процес на хематопоезата е узряването на клетките и освобождаването на зрели образувани елементи в периферната кръв - еритроцити, левкоцити, лимфоцити и тромбоцити.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Източници на хематопоетични стволови клетки

Хематопоетичните стволови клетки се считат за най-изследвания източник на стволови клетки, което до голяма степен се дължи на клиничното им приложение при трансплантация на костен мозък. На пръв поглед за тези клетки се знае доста. До известна степен това е вярно, тъй като междинните и зрели потомци на HSCs са най-достъпните клетъчни елементи, всеки от които (еритроцити, левкоцити, лимфоцити, моноцити/макрофаги и тромбоцити) е внимателно проучен на всички нива - от светлинна до електронна микроскопия, от биохимични и имунофенотипни характеристики до идентифициране чрез PCR анализни методи. Въпреки това, мониторингът на морфологичните, ултраструктурните, биохимичните, имунофенотипните, биофизичните и геномните параметри на HSCs не е дал отговори на много проблемни въпроси, чието решаване е необходимо за развитието на клетъчната трансплантология. Механизмите за стабилизиране на хематопоетичните стволови клетки в латентно състояние, тяхното активиране, навлизане в етапа на симетрично или асиметрично делене и най-важното, ангажираност с образуването на такива функционално различни образувани елементи на кръвта като еритроцити, левкоцити, лимфоцити и тромбоцити, все още не са установени.

Наличието в костния мозък на клетки с CD34 фенотип, които са предшественици както на мезенхимни, така и на хематопоетични стволови клетки, повдигна въпроса за съществуването на най-ранните прекурсори на клетъчната диференциация в стромални и хематопоетични линии, близки до CD34-негативните клетки. Така наречените дългосрочни културно-иницииращи клетки (LTC-IC) бяха получени с помощта на метода на дългосрочно култивиране. Продължителността на живота на такива прекурсорни клетки с колониообразуваща активност върху стромалната основа на костния мозък с определена комбинация от растежни фактори надвишава 5 седмици, докато жизнеспособността на ангажираните колониообразуващи единици (CFU) в културата е само 3 седмици. В момента LTC-IC се счита за функционален аналог на HSCs, тъй като с висок потенциал за репопулация, около 20% от LTC-IC се характеризират с CD34+CD38- фенотип и проявяват висок капацитет за самообновяване. Такива клетки се срещат в човешкия костен мозък с честота 1:50 000. Въпреки това, миелоидно-лимфоидно-иницииращите клетки, получени при дългосрочни (15 седмици) условия на култивиране, трябва да бъдат признати за най-близки до HSCs. Такива клетки, обозначени като LTC, са сред клетките на костния мозък на човешкия мозък, срещат се 10 пъти по-рядко от LTC-IC и образуват клетъчни линии както от миелоидни, така и от лимфоидни хематопоетични линии.

Въпреки че маркирането на хематопоетични стволови клетки с моноклонални антитела, последвано от имунофенотипна идентификация, е основният метод за разпознаване и селективно сортиране на хематопоетични клетки със стволов потенциал, клиничното приложение на така изолираните HSC е ограничено. Блокирането на CD34 рецептора или други маркерни антигени с антитела по време на имунопозитивно сортиране неизбежно променя свойствата на клетката, изолирана с негова помощ. Имунонегативната изолация на HSC върху магнитни колони се счита за по-предпочитана. В този случай обаче за сортиране обикновено се използват моноклонални антитела, фиксирани върху метален носител. Освен това, което е важно, и двата метода за изолиране на HSC се основават на фенотипни, а не на функционални характеристики. Следователно, много изследователи предпочитат да използват анализ на клоногенните параметри на HSC, което позволява степента на зрялост и посоката на диференциация на прогениторните клетки да се определят от размера и състава на колониите. Известно е, че по време на процеса на ангажиране броят на клетките и техните видове в колонията намалява. Хемопоетичната стволова клетка и нейната ранна дъщерна клетка, наречена „гранулоцит-еритроцит-моноцитно-мегакариоцитна колони-образуваща единица“ (CFU-GEMM), създават големи многолинейни колонии в култура, съдържащи съответно гранулоцити, еритроцити, моноцити и мегакариоцити. Гранулоцит-моноцитна колони-образуваща единица (CFU-GM), разположена надолу по линията на ангажираност, образува колонии от гранулоцити и макрофаги, а гранулоцитната колони-образуваща единица (CFU-G) образува само малка колония от зрели гранулоцити. Ранният еритроцитен прекурсор, взривно-образуващата единица от еритроцити (CFU-E), е източникът на големи еритроцитни колонии, а по-зрялата колони-образуваща единица от еритроцити (CFU-E) е източникът на малки еритроцитни колонии. Като цяло, когато клетките растат върху полутвърда среда, могат да бъдат идентифицирани клетки, които образуват шест вида миелоидни колонии: CFU-GEMM, CFU-GM, CFU-G, CFU-M, BFU-E и CFU-E).

Въпреки това, освен хематопоетичните производни, всеки изходен материал за изолиране на HSCs съдържа значителен брой съпътстващи клетки. В тази връзка е необходимо предварително пречистване на трансплантата, на първо място, от активни клетки на имунната система на донора. Обикновено за тази цел се използва имуноселекция, базирана на експресията на специфични антигени от лимфоцити, което прави възможно изолирането и отстраняването им с помощта на моноклонални антитела. Освен това е разработен имунорозетен метод за изчерпване на Т-лимфоцитите от костномозъчен трансплантат, който се основава на образуването на комплекси от CD4+ лимфоцити и специфични моноклонални антитела, ефективно отстранени с помощта на афереза. Този метод осигурява производството на пречистен клетъчен материал с 40-60% съдържание на хематопоетични стволови клетки.

Увеличение на броя на прогениторните клетки, дължащо се на отстраняване на зрели образувани елементи на кръвта от продукта на левкоферезата, се постига чрез противотоково центрофугиране, последвано от филтрация (в присъствието на хелатор - тринатриев цитрат) през колони, съдържащи найлонови влакна, покрити с човешки имуноглобулин. Последователното използване на тези два метода осигурява пълно пречистване на трансплантата от тромбоцити, 89% от еритроцити и 91% от левкоцити. Поради значителното намаляване на загубата на HSCs, нивото на CD34+ клетки в общата клетъчна маса може да се увеличи до 50%.

Способността на изолираните хематопоетични стволови клетки да образуват колонии от зрели кръвни клетки в култура се използва за функционално характеризиране на клетките. Анализът на образуваните колонии позволява идентифициране и количествено определяне на видовете прогениторни клетки, степента на тяхното ангажиране и установяване на посоката на тяхната диференциация. Клоногенната активност се определя в полутвърди среди върху метилцелулоза, агар, плазма или фибринов гел, които намаляват миграционната активност на клетките, предотвратявайки прикрепването им към повърхността на стъкло или пластмаса. При оптимални условия на култивиране, клонингите се развиват от една клетка за 7-18 дни. Ако един клонинг съдържа по-малко от 50 клетки, той се идентифицира като единичен клъстер; ако броят на клетките надвишава 50, той се идентифицира като колония. Взема се предвид броят на клетките, способни да образуват колония (колониеобразуващи единици - CFU или колониеобразуващи клетки - COC). Трябва да се отбележи, че параметрите на CFU и COC не съответстват на броя на HSC в клетъчната суспензия, въпреки че корелират с него, което още веднъж подчертава необходимостта от определяне на функционалната (колониеобразуваща) активност на HSC in vitro.

Сред клетките от костен мозък, хематопоетичните стволови клетки имат най-висок пролиферативен потенциал, поради което образуват най-големите колонии в културата. Предполага се, че броят на тези колонии индиректно определя броя на стволовите клетки. След образуването in vitro на колонии с диаметър над 0,5 mm и с брой клетки над 1000, авторите тестват такива клетки за резистентност към сублетални дози 5-флуороурацил и изследват способността им да репопулират костния мозък на летално облъчени животни. Според посочените параметри, изолираните клетки са почти неразличими от HSCs и получават съкращението HPP-CFC - колони-образуващи клетки с висок пролиферативен потенциал.

Търсенето на по-качествена изолация на хематопоетични стволови клетки продължава. Хематопоетичните стволови клетки обаче са морфологично подобни на лимфоцитите и представляват относително хомогенен набор от клетки с почти кръгли ядра, фино диспергиран хроматин и малко количество слабо базофилна цитоплазма. Точният им брой също е труден за определяне. Предполага се, че HSCs в човешкия костен мозък се срещат с честота 1 на 106 ядрени клетки.

Идентифициране на хематопоетични стволови клетки

За подобряване на качеството на идентификация на хемопоетичните стволови клетки се провежда последователно или едновременно (на многоканален сортировъчен апарат) изследване на спектъра от мембранно-свързани антигени, като при HSC фенотипът CD34+CD38 трябва да се комбинира с отсъствието на маркери за линейна диференциация, особено антигени на имунокомпетентни клетки, като CD4, повърхностни имуноглобулини и гликофорин.

Почти всички схеми за фенотипизиране на хематопоетични стволови клетки включват определяне на CD34 антигена. Този гликопротеин с молекулно тегло около 110 kDa, носещ няколко места за гликозилиране, се експресира върху плазмоклетъчната мембрана след активиране на съответния ген, локализиран на хромозома 1. Функцията на CD34 молекулата е свързана с L-селектин-медиирано взаимодействие на ранните хематопоетични прогениторни клетки със стромалната основа на костния мозък. Трябва обаче да се помни, че наличието на CD34 антигена върху клетъчната повърхност позволява само предварителна оценка на съдържанието на HSC в клетъчната суспензия, тъй като той се експресира и от други хематопоетични прогениторни клетки, както и от стромални клетки на костния мозък и ендотелни клетки.

По време на диференциацията на хематопоетичните прогениторни клетки, експресията на CD34 е трайно намалена. Еритроцитните, гранулоцитните и моноцитните ангажирани прогениторни клетки или слабо експресират CD34 антигена, или изобщо не го експресират на повърхността си (CD34 фенотип). CD34 антигенът не се открива върху повърхностната мембрана на диференцираните клетки от костен мозък и зрелите кръвни клетки.

Трябва да се отбележи, че в динамиката на диференциацията на хематопоетичните прогениторни клетки не само нивото на експресия на CD34 намалява, но и прогресивно се увеличава експресията на антигена CD38, интегрален мембранен гликопротеин с молекулно тегло 46 kDa, който притежава NAD-гликохидролазна и ADP-рибозил циклазна активност, което предполага участието му в транспорта и синтеза на ADP-рибоза. По този начин се появява възможността за двоен контрол на степента на ангажираност на хематопоетичните прогениторни клетки. Популацията от клетки с CD34+CD38+ фенотип, която съставлява от 90 до 99% от CD34-позитивните клетки на костния мозък, съдържа прогениторни клетки с ограничен пролиферативен и диференциращ потенциал, докато клетките с CD34+CD38 фенотип могат да претендират за ролята на HSC.

Всъщност, популацията от клетки от костен мозък, описана с формула CD34+CD38-, съдържа относително голям брой примитивни стволови клетки, способни да се диференцират в миелоидна и лимфоидна посока. При условия на дългосрочно култивиране на клетки с фенотип CD34+CD38- е възможно да се получат всички зрели образувани елементи на кръвта: неутрофили, еозинофили, базофили, моноцити, мегакариоцити, еритроцити и лимфоцити.

Сравнително наскоро беше установено, че CD34-позитивните клетки експресират още два маркера, AC133 и CD90 (Thy-1), които също се използват за идентифициране на хематопоетични стволови клетки. Thy-1 антигенът се коекспресира с CD117 рецептора (c-kit) върху CD34+ клетки на костния мозък, пъпната връв и периферната кръв. Той представлява повърхностен фосфатидилинозитол-свързващ гликопротеин с молекулно тегло 25-35 kDa, който участва в процесите на клетъчна адхезия. Някои автори смятат, че Thy-1 антигенът е маркер на най-незрелите CD34-позитивни клетки. Самовъзпроизвеждащите се клетки с CD34+Thy-1+ фенотип дават началото на дългосрочно култивирани линии с образуването на дъщерни клетки. Предполага се, че Thy-1 антигенът блокира регулаторните сигнали, които причиняват спиране на клетъчното делене. Въпреки факта, че CD34+Thy1+ клетките са способни на самовъзпроизвеждане и създаване на дългосрочно култивирани линии, техният фенотип не може да се отдаде изключително на HSCs, тъй като съдържанието на Thy-1+ в общата маса на CD34-позитивните клетъчни елементи е около 50%, което значително надвишава броя на хематопоетичните клетки.

По-обещаващ за идентифициране на хематопоетични стволови клетки трябва да бъде AC133 - антигенен маркер на хематопоетични прогениторни клетки, чиято експресия е открита за първи път върху ембрионални чернодробни клетки. AC133 е трансмембранен гликопротеин, който се появява на повърхността на клетъчната мембрана в най-ранните етапи на съзряване на HSC - възможно е дори по-рано от антигена CD34. В изследванията на А. Петренко, В. Гришченко (2003) е установено, че AC133 се експресира от до 30% от CD34-позитивните ембрионални чернодробни клетки.

По този начин, идеалният фенотипен профил на хематопоетичните стволови клетки, според съвременните концепции, се състои от клетъчен контур, чиито контури би трябвало да включват конфигурации на антигените CD34, AC133 и Thy-1, но няма място за молекулярните проекции на CD38, HLA-DR и маркерите за линейна диференциация GPA, CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

Вариация на фенотипния портрет на HSC може да бъде комбинацията CD34+CD45RalowCD71low, тъй като свойствата на клетките, описани от тази формула, не се различават от функционалните параметри на клетки с CD34+CD38 фенотип. Освен това, човешките HSC могат да бъдат идентифицирани по фенотипните характеристики CD34+Thy-l+CD38Iow/'c-kit/low - само 30 такива клетки напълно възстановяват хематопоезата при летално облъчени мишки.

40-годишният период на интензивни изследвания на ХСК, които са способни както на самовъзпроизвеждане, така и на диференциация в други клетъчни елементи, започна с анализ на общите фенотипни характеристики на клетките от костен мозък, което позволи да се обоснове използването на трансплантация на костен мозък за лечение на различни патологии на хематопоетичната система. Новите видове стволови клетки, открити по-късно, все още не са намерили широко приложение в клиничната практика. В същото време, стволовите клетки от кръв от пъпна връв и ембрионален черен дроб са способни значително да разширят мащаба на клетъчната трансплантация не само в хематологията, но и в други области на медицината, тъй като се различават от ХСК от костен мозък както по количествени, така и по качествени характеристики.

Обемът на масата на хематопоетичните стволови клетки, необходим за трансплантация, обикновено се получава от костен мозък, периферна и пъпна кръв, както и от ембрионален черен дроб. Освен това, хематопоетичните прогениторни клетки могат да бъдат получени in vitro чрез размножаване на ембрионални стволови клетки (ESC) с последващата им насочена диференциация в хематопоетични клетъчни елементи. А. Петренко, В. Гришченко (2003) правилно отбелязват значителни разлики в имунологичните свойства и способността за възстановяване на хематопоезата на HSCs с различен произход, което се дължи на неравномерното съотношение на ранните плурипотентни и късно ангажираните прогениторни клетки, съдържащи се в техните източници. Освен това, хематопоетичните стволови клетки, получени от различни стволови източници, се характеризират с количествено и качествено напълно различни асоциации на нехематопоетични клетки.

Костният мозък вече се е превърнал в традиционен източник на хемопоетични стволови клетки. Суспензия от костномозъчни клетки се получава от илиума или гръдната кост чрез промиване под локална анестезия. Получената по този начин суспензия е хетерогенна и съдържа смес от HSCs, стромални клетъчни елементи, ангажирани прогениторни клетки от миелоидни и лимфоидни линии, както и зрели образувани елементи на кръвта. Броят на клетките с CD34+ и CD34+CD38 фенотипове сред мононуклеарните клетки от костен мозък е съответно 0,5-3,6 и 0-0,5%. Периферната кръв след G-CSF-индуцирана мобилизация на HSCs съдържа 0,4-1,6% CD34+ и 0-0,4% CD34+CD38.

Процентът на клетки с имунофенотиповете CD34+CD38 и CD34+ е по-висок в кръвта от пъпна връв - 0-0,6 и 1-2,6%, като максималният им брой се открива сред хематопоетичните клетки на ембрионалния черен дроб - съответно 0,2-12,5 и 2,3-35,8%.

Качеството на трансплантирания материал обаче зависи не само от броя на CD34+ клетките, които съдържа, но и от тяхната функционална активност, която може да се оцени чрез нивото на образуване на колонии in vivo (репопулация на костен мозък при летално облъчени животни) и in vitro - чрез растеж на колонии върху полутечни среди. Оказа се, че колониообразуващата и пролиферативната активност на хематопоетичните прогениторни клетки с CD34+CD38 HLA-DR фенотип, изолирани от ембрионалния черен дроб, феталния костен мозък и кръвта от пъпна връв, значително надвишава пролиферативния и колониообразуващия потенциал на хематопоетичните клетки от костния мозък и периферната кръв на възрастен. Количественият и качествен анализ на HSCs с различен произход разкри значителни разлики както в относителното им съдържание в клетъчната суспензия, така и във функционалните им възможности. Максималният брой CD34+ клетки (24,6%) е установен в трансплантирания материал, получен от фетален костен мозък. Костният мозък на възрастен съдържа 2,1% CD34-позитивни клетъчни елементи. Сред мононуклеарните клетки в периферната кръв на възрастен, само 0,5% имат CD34+ фенотип, докато в кръвта от пъпна връв броят им достига 2%. В същото време, капацитетът за образуване на колонии на CD34+ клетките на феталния костен мозък е 2,7 пъти по-висок от клоналния растежен капацитет на хематопоетичните клетки от костния мозък на възрастен, а клетките от пъпна кръв образуват значително повече колонии от хематопоетичните елементи, изолирани от периферната кръв на възрастни: съответно 65,5 и 40,8 колонии/105 клетки.

Разликите в пролиферативната активност и способността за образуване на колонии на хематопоетичните стволови клетки са свързани не само с различната степен на тяхната зрялост, но и с естествената им микросреда. Известно е, че интензивността на пролиферацията и скоростта на диференциация на стволовите клетки се определят от интегралния регулаторен ефект на многокомпонентна система от растежни фактори и цитокини, които се произвеждат както от самите стволови клетки, така и от клетъчните елементи на тяхната матрично-стромална микросреда. Използването на пречистени клетъчни популации и безсерумни среди за клетъчно култивиране направи възможно характеризирането на растежни фактори, които имат стимулиращ и инхибиращ ефект върху стволови клетки на различни нива, прогениторни клетки и клетки, ангажирани в една или друга линейна посока. Резултатите от изследванията убедително показват, че HSC, получени от източници с различни нива на онтогенетично развитие, се различават както фенотипно, така и функционално. HSC в по-ранни етапи на онтогенезата се характеризират с висок потенциал за самовъзпроизвеждане и висока пролиферативна активност. Такива клетки се отличават с по-дълги теломери и претърпяват ангажираност, за да формират всички хематопоетични клетъчни линии. Отговорът на имунната система към HSCs с ембрионален произход е забавен, тъй като тези клетки слабо експресират HLA молекули. Съществува ясна градация на относителното съдържание на HSCs, способността им за самообновяване и броя на видовете линии на ангажираност, които образуват: CD34+ клетки на ембрионален черен дроб > CD34+ клетки на кръв от пъпна връв > CD34+ клетки на костен мозък. Важно е, че тези разлики са присъщи не само на интра-, нео- и ранния постнатален период на човешкото развитие, но и на цялата онтогенеза - пролиферативната и колониообразуваща активност на HSCs, получени от костния мозък или периферната кръв на възрастен, е обратно пропорционална на възрастта на донора.