Хемопоетични стволови клетки на жълтъчната торбичка

Очевидно е, че различните пролиферативни и диференциращи потенциали на хематопоетичните стволови клетки се определят от особеностите на тяхното онтогенетично развитие, тъй като дори локализацията на основните области на хематопоезата се променя при хората по време на онтогенезата. Хематопоетичните прогениторни клетки на феталния жълтъчен сак са ангажирани с образуването на изключително еритропоетична клетъчна линия. След миграцията на първичните HSCs към черния дроб и далака, спектърът от линии на ангажираност се разширява в микросредата на тези органи. По-специално, хематопоетичните стволови клетки придобиват способността да генерират клетки от лимфоиден ред. В пренаталния период хематопоетичните прогениторни клетки достигат зоната на крайна локализация и заселват костния мозък. По време на вътрематочното развитие феталната кръв съдържа значителен брой хематопоетични стволови клетки. Например, в 13-та седмица от бременността нивото на HSCs достига 18% от общия брой мононуклеарни кръвни клетки. Впоследствие се наблюдава прогресивно намаляване на съдържанието им, но дори преди раждането количеството на HSCs в кръвта от пъпната връв се различава малко от количеството им в костния мозък.

Според класическите представи, естествената промяна в локализацията на хематопоезата по време на ембрионалното развитие на бозайниците се осъществява чрез миграция и въвеждане в нова микросреда на плурипотентни хематопоетични стволови клетки - от жълтъчния сак до черния дроб, далака и костния мозък. Тъй като в ранните етапи на ембрионалното развитие хематопоетичната тъкан съдържа голям брой стволови клетки, който намалява с узряването на плода, най-перспективна за получаване на хематопоетични стволови клетки се счита хематопоетичната тъкан на ембрионалния черен дроб, изолирана от абортиран материал на 5-8 гестационна седмица.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Въпроси относно произхода на хематопоетичните стволови клетки

Няма съмнение, че ембрионалното образуване на еритроцитите произхожда от кръвните островчета на жълтъчния сак. Потенциалът за диференциация in vitro на хематопоетичните клетки от жълтъчния сак обаче е много ограничен (те се диференцират предимно в еритроцити). Трябва да се отбележи, че трансплантацията на хематопоетични стволови клетки от жълтъчния сак не е в състояние да възстанови хематопоезата за дълго време. Оказа се, че тези клетки не са предшественици на възрастни HSCs. Истинските HSCs се появяват по-рано, на 3-5-та седмица от вътрематочното развитие, в зоната на образуване на стомашна тъкан и ендотел на кръвоносни съдове (парааортна спланхноплевра, P-SP), както и на мястото на аортата, гонадите и първичните бъбреци - в мезонефроса или т.нар. AGM регион. Доказано е, че клетките от AGM региона са източник не само на HSCs, но и на ендотелни клетки на кръвоносни съдове, както и на остеокласти, участващи в процесите на образуване на костна тъкан. На 6-та гестационна седмица ранните хематопоетични прогениторни клетки от AGM областта се преместват в черния дроб, който остава основният хематопоетичен орган на плода до раждането.

Тъй като този момент е изключително важен от гледна точка на клетъчната трансплантация, проблемът за произхода на ХСК в процеса на човешката ембриогенеза заслужава по-подробно представяне. Класическите идеи, че хематопоетичните стволови клетки на бозайници и птици произхождат от екстраембрионален източник, се основават на изследванията на Меткалф и Мур, които първи използват методи за клониране на ХСК и техните потомци, изолирани от жълтъчния сак. Резултатите от тяхната работа послужват за основа на теорията за миграцията, според която ХСК, появили се за първи път в жълтъчния сак, последователно заселват преходните и окончателните хематопоетични органи, тъй като в тях се формира съответната микросреда. Така се утвърждава гледната точка, че генерирането на ХСК, първоначално локализирани в жълтъчния сак, служи като клетъчна основа за окончателната хематопоеза.

Хематопоетичните прогениторни клетки от жълтъчния сак принадлежат към категорията на най-ранните хематопоетични прогениторни клетки. Техният фенотип се описва с формулата AA4.1+CD34+c-kit+. За разлика от зрелите HSCs от костен мозък, те не експресират Sca-1 антигени и MHC молекули. Изглежда, че появата на маркерни антигени върху повърхностните мембрани на HSCs от жълтъчния сак по време на култивиране съответства на тяхната диференциация по време на ембрионалното развитие с образуването на ангажирани хематопоетични линии: нивото на експресия на CD34 и Thy-1 антигени намалява, експресията на CD38 и CD45RA се увеличава и се появяват HLA-DR молекули. С последваща специализация in vitro, индуцирана от цитокини и растежни фактори, започва експресията на антигени, специфични за хематопоетичните прогениторни клетки от определена клетъчна линия. Резултатите от изследването на ембрионалната хематопоеза при представители на три класа гръбначни (земноводни, птици и бозайници) и по-специално анализът на произхода на HSCs, отговорни за окончателната хематопоеза в постнаталната онтогенеза, обаче противоречат на класическите концепции. Установено е, че при представители на всички разглеждани класове, по време на ембриогенезата се формират два независими региона, в които възникват HSC. Екстраембрионният „класически“ регион е представен от жълтъчния сак или неговите аналози, докато наскоро идентифицираната интраембрионна зона на локализация на HSC включва парааортния мезенхим и AGM региона. Днес може да се твърди, че при земноводните и птиците окончателните HSC произхождат от интраембрионални източници, докато при бозайниците и хората участието на HSC от жълтъчния сак в окончателната хематопоеза все още не може да бъде напълно изключено.

Ембрионалната хематопоеза в жълтъчния сак всъщност е първична еритропоеза, която се характеризира със запазване на ядрото на всички етапи от узряването на еритроцитите и синтеза на хемоглобин от фетален тип. Според най-новите данни вълната на първичната еритропоеза завършва в жълтъчния сак на 8-ия ден от ембрионалното развитие. Следва период на натрупване на дефинитивни еритроидни прогениторни клетки - BFU-E, които се образуват изключително в жълтъчния сак и се появяват за първи път на 9-ия ден от бременността. На следващия етап от ембриогенезата вече са образувани дефинитивни еритроидни прогениторни клетки - CFU-E, както и (!) мастоцити и CFU-GM. Това е основата на гледната точка, че дефинитивните прогениторни клетки възникват в жълтъчния сак, мигрират с кръвния поток, установяват се в черния дроб и бързо инициират първата фаза на интраембрионалната хематопоеза. Според тези концепции, жълтъчният сак може да се разглежда, от една страна, като място на първична еритропоеза, а от друга, като първи източник на окончателни хематопоетични прогениторни клетки в ембрионалното развитие.

Доказано е, че колони-образуващи клетки с висок пролиферативен потенциал могат да бъдат изолирани от жълтъчния сак още на 8-ия ден от бременността, т.е. много преди затварянето на съдовата система на ембриона и жълтъчния сак. Освен това, клетките с висок пролиферативен потенциал, получени от жълтъчния сак in vitro, образуват колонии, чийто размер и клетъчен състав не се различават от съответните параметри на културния растеж на стволови клетки от костен мозък. В същото време, при ретрансплантация на колони-образуващи клетки от жълтъчния сак с висок пролиферативен потенциал се образуват значително повече дъщерни колони-образуващи клетки и мултипотентни прогениторни клетки, отколкото при използване на костномозъчни прогениторни клетки на хематопоезата.

Окончателно заключение относно ролята на хематопоетичните стволови клетки от жълтъчния сак в окончателната хематопоеза може да се направи от резултатите от работата, в която авторите са получили линия от ендотелни клетки от жълтъчния сак (G166), която ефективно поддържа пролиферацията на своите клетки с фенотипните и функционални характеристики на HSCs (AA4.1+WGA+, ниска плътност и слаби адхезивни свойства). Съдържанието на последните се е увеличило повече от 100 пъти при култивиране върху захранващ слой от C166 клетки в продължение на 8 дни. Макрофаги, гранулоцити, мегакариоцити, бластни клетки и моноцити, както и B- и T-лимфоцитни прекурсорни клетки са идентифицирани в смесени колонии, отглеждани върху подслой от C166 клетки. Клетките от жълтъчния сак, растящи върху подслой от ендотелни клетки, са имали способността да се самовъзпроизвеждат и са издържали до три пасажа в експериментите на авторите. Възстановяването на хематопоезата с тяхна помощ при зрели мишки с тежък комбиниран имунодефицит (ТКИД) е съпроводено с образуването на всички видове левкоцити, както и на Т- и В-лимфоцити. Авторите обаче в своите изследвания са използвали клетки от жълтъчния сак на 10-дневен ембрион, при който екстра- и интраембрионалните съдови системи вече са затворени, което не ни позволява да изключим наличието на интраембрионални HSCs сред клетките на жълтъчния сак.

В същото време, анализът на диференциационния потенциал на хематопоетичните клетки в ранни стадии на развитие, изолирани преди обединението на съдовите системи на жълтъчния сак и ембриона (8-8,5 дни от бременността), разкри наличието на прекурсори на Т- и В-клетки в жълтъчния сак, но не и в тялото на ембриона. В in vitro системата, чрез метода на двустепенно култивиране върху монослой от епителни и субепителни клетки на тимуса, мононуклеарните клетки на жълтъчния сак се диференцират в пре-Т- и зрели Т-лимфоцити. При същите условия на култивиране, но върху монослой от стромални клетки на черния дроб и костния мозък, мононуклеарните клетки на жълтъчния сак се диференцират в пре-В-клетки и зрели IglVT-В-лимфоцити.

Резултатите от тези изследвания показват възможността за развитие на клетки на имунната система от екстраембрионална тъкан на жълтъчния сак, а образуването на първични Т- и В-клетъчни линии зависи от факторите на стромалната микросреда на ембрионалните хематопоетични органи.

Други автори също са показали, че жълтъчният сак съдържа клетки с потенциал за лимфоидна диференциация и получените лимфоцити не се различават по антигенни характеристики от тези при полово зрели животни. Установено е, че клетките на жълтъчния сак на 8-9-дневен ембрион са способни да възстановят лимфопоезата в атимоцитния тимус с появата на зрели CD3+CD4+- и CD3+CD8+-лимфоцити, притежаващи формиран репертоар от Т-клетъчни рецептори. По този начин, тимусът може да бъде населен от клетки с екстраембрионален произход, но е невъзможно да се изключи вероятната миграция на ранни Т-лимфоцитни прекурсорни клетки от интраембрионални източници на лимфопоеза в тимуса.

Същевременно, трансплантацията на хематопоетични клетки от жълтъчния сак на възрастни облъчени реципиенти не винаги води до дългосрочно повторно заселване на зони за локализация на изчерпана хематопоетична тъкан, а in vitro клетките от жълтъчния сак образуват значително по-малко слезкови колонии, отколкото клетките от AGM региона. В някои случаи, използвайки клетки от жълтъчния сак на 9-дневен ембрион, все още е възможно да се постигне дългосрочно (до 6 месеца) повторно заселване на хематопоетична тъкан при облъчени реципиенти. Авторите смятат, че клетките от жълтъчния сак с CD34+c-kit+ фенотип не само не се различават от тези от AGM региона по способността си да повторно заселват изчерпани хематопоетични органи, но и възстановяват хематопоезата по-ефективно, тъй като жълтъчният сак съдържа почти 37 пъти повече от тях.

Трябва да се отбележи, че в експериментите са използвани хематопоетични клетки от жълтъчния сак с маркерни антигени на хематопоетични стволови клетки (c-kit+ и/или CD34+ и CD38+), които са инжектирани директно в черния дроб или коремната вена на потомството на женски мишки, получили инжекция с бусулфан на 18-ия ден от бременността. При такива новородени животни собствената им миелопоеза е била рязко потисната поради елиминирането на хематопоетичните стволови клетки, причинено от бусулфан. След трансплантация на хематопоетични стволови клетки от жълтъчния сак, в периферната кръв на реципиентите в продължение на 11 месеца са открити образувани елементи, съдържащи донорния маркер - глицерофосфат дехидрогеназа. Установено е, че HSCs от жълтъчния сак възстановяват съдържанието на лимфоидни, миелоидни и еритроидни клетки в кръвта, тимуса, далака и костния мозък, като нивото на химеризъм е по-високо в случай на интрахепатално, а не на интравенозно приложение на клетки от жълтъчния сак. Авторите смятат, че HSCs на жълтъчния сак на ембриони в ранен стадий (до 10 дни) изискват предварително взаимодействие с хематопоетичната микросреда на черния дроб, за да се заселят успешно хематопоетичните органи на възрастни реципиенти. Възможно е да съществува уникален етап на развитие в ембриогенезата, когато клетките на жълтъчния сак, първоначално мигриращи към черния дроб, след това придобиват способността да заселват стромата на хематопоетичните органи на зрели реципиенти.

В тази връзка трябва да се отбележи, че химеризмът на клетките на имунната система се наблюдава доста често след трансплантация на клетки от костен мозък на облъчени зрели реципиенти - в кръвта на последните клетки от донорския фенотип се откриват в сравнително големи количества сред В-, Т-лимфоцитите и гранулоцитите на реципиента, което продължава поне 6 месеца.

Хематопоетичните клетки при бозайниците се откриват за първи път чрез морфологични методи на 7-ия ден от ембрионалното развитие и са представени от хематопоетични острови вътре в съдовете на жълтъчния сак. Естествената хематопоетична диференциация в жълтъчния сак обаче е ограничена до първични еритроцити, които задържат ядра и синтезират фетален хемоглобин. Въпреки това традиционно се е смятало, че жълтъчният сак служи като единствен източник на HSCs, мигриращи към хематопоетичните органи на развиващия се ембрион и осигуряващи окончателна хематопоеза при възрастни животни, тъй като появата на HSCs в тялото на ембриона съвпада със затварянето на съдовите системи на жълтъчния сак и ембриона. Тази гледна точка се подкрепя от данни, че клетките на жълтъчния сак, когато се клонират in vitro, дават началото на гранулоцити и макрофаги, а in vivo - на слезкови колонии. След това, в хода на трансплантационни експерименти, е установено, че хематопоетичните клетки на жълтъчния сак, които в самия жълтъчен сак са способни да се диференцират само в първични еритроцити, в микросредата на черния дроб на новородени и възрастни SCID мишки, изчерпаният тимус или стромалното захранващо отделение, придобиват способността да репопулират хематопоетични органи с възстановяване на всички хематопоетични линии дори при възрастни животни-реципиенти. По принцип това ни позволява да ги класифицираме като истински HSCs - като клетки, които функционират в постнаталния период. Предполага се, че жълтъчният сак, заедно с AGM областта, служи като източник на HSCs за окончателна хематопоеза при бозайниците, но техният принос за развитието на хематопоетичната система все още е неясен. Биологичният смисъл на съществуването на два хематопоетични органа със сходни функции в ранната ембриогенеза при бозайниците също е неясен.

Търсенето на отговори на тези въпроси продължава. In vivo беше възможно да се докаже наличието в жълтъчния сак на 8-8,5-дневни ембриони на клетки, които възстановяват лимфопоезата при сублетално облъчени SCID мишки с изразен дефицит на Т- и В-лимфоцити. Хематопоетични клетки от жълтъчния сак бяха инжектирани както интраперитонеално, така и директно в тъканта на далака и черния дроб. След 16 седмици в реципиентите бяха открити TCR/CD34 CD4+ и CD8+ Т-лимфоцити и B-220+IgM+ В-лимфоцити, маркирани с донорски MHC антргени. В същото време авторите не откриха стволови клетки, способни на такова възстановяване на имунната система, в организма на 8-8,5-дневни ембриони.

Хематопоетичните клетки от жълтъчния сак имат висок пролиферативен потенциал и са способни на продължително самовъзпроизвеждане in vitro. Някои автори идентифицират тези клетки като HSCs въз основа на продължителното (почти 7 месеца) генериране на еритроидни прогениторни клетки, които се различават от костномозъчните прогениторни клетки от еритроидния род по по-дълъг период на пасажиране, по-големи размери на колониите, повишена чувствителност към растежни фактори и по-дълга пролиферация. Освен това, при подходящи условия на култивиране на клетки от жълтъчния сак in vitro се образуват и лимфоидни прогениторни клетки.

Представените данни като цяло ни позволяват да разглеждаме жълтъчния сак като източник на ХСК, по-слабо ангажирани и следователно притежаващи по-голям пролиферативен потенциал от стволовите клетки от костен мозък. Въпреки факта, че жълтъчният сак съдържа плурипотентни хематопоетични прогениторни клетки, които поддържат различни линии на хематопоетична диференциация in vitro за дълго време, единственият критерий за пълнота на ХСК е способността им дългосрочно да репопулират хематопоетичните органи на реципиента, чиито хематопоетични клетки са унищожени или генетично дефектни. Следователно, ключовият въпрос е дали плурипотентните хематопоетични клетки на жълтъчния сак могат да мигрират и да заселват хематопоетичните органи и дали е препоръчително да се преразгледат известните трудове, които демонстрират способността им да репопулират хематопоетичните органи на зрели животни с формирането на основните хематопоетични линии. Интраембрионални източници на окончателни GSCs са идентифицирани в птичи ембриони още през 70-те години на миналия век, което още тогава хвърля съмнение върху установените представи за екстраембрионалния произход на GSCs, включително при представители на други класове гръбначни животни. През последните няколко години се появиха публикации за наличието на подобни интраембрионални области, съдържащи GSCs, при бозайници и хора.

Трябва да се отбележи още веднъж, че фундаменталните знания в тази област са изключително важни за практическата клетъчна трансплантология, тъй като ще помогнат не само да се определи предпочитаният източник на ХСК, но и да се установят особеностите на взаимодействието на първични хематопоетични клетки с генетично чужд организъм. Известно е, че въвеждането на хематопоетични стволови клетки от човешки фетален черен дроб в ембрион на овца на етапа на органогенезата води до раждането на химерни животни, в кръвта и костния мозък на които 3 до 5% от човешките хематопоетични клетки са стабилно определени. В същото време човешките ХСК не променят кариотипа си, поддържайки висока скорост на пролиферация и способност за диференциация. Освен това, трансплантираните ксеногенни ХСК не конфликтират с имунната система и фагоцитите на гостоприемния организъм и не се трансформират в туморни клетки, което е в основата на интензивното разработване на методи за вътрематочна корекция на наследствена генетична патология с помощта на ХСК или ЕМК, трансфектирани с дефицитни гени.

Но на кой етап от ембриогенезата е по-подходящо да се извърши подобна корекция? За първи път клетки, определени за хематопоеза, се появяват при бозайници веднага след имплантацията (6-ия ден от бременността), когато все още липсват морфологични признаци на хематопоетична диференциация и предполагаеми хематопоетични органи. На този етап диспергираните клетки на мишия ембрион са способни да репопулират хематопоетичните органи на облъчените реципиенти с образуването на еритроцити и лимфоцити, които се различават от клетките на гостоприемника съответно по вида на хемоглобина или глицерофосфат изомераза, както и допълнителен хромозомен маркер (Tb) на донорските клетки. При бозайниците, както и при птиците, едновременно с жълтъчния сак, преди затварянето на общото съдово легло, хематопоетичните клетки се появяват директно в тялото на ембриона в парааортната спланхноплевра. Хематопоетичните клетки с фенотип AA4.1+ бяха изолирани от AGM региона и характеризирани като мултипотентни хематопоетични клетки, които образуват Т- и В-лимфоцити, гранулоцити, мегакариоцити и макрофаги. Фенотипно тези мултипотентни прогениторни клетки са много близки до HSCs на костния мозък на възрастни животни (CD34+c-kit+). Броят на мултипотентните AA4.1+ клетки сред всички клетки на AGM региона е малък - те съставляват не повече от 1/12 от неговата част.

В човешкия ембрион е идентифицирана и интраембрионна област, съдържаща HSC, хомоложни на AGM областта на животните. Освен това, при хората повече от 80% от мултипотентните клетки с висок пролиферативен потенциал се съдържат в тялото на ембриона, въпреки че такива клетки присъстват и в жълтъчния сак. Подробен анализ на тяхната локализация показа, че стотици такива клетки са събрани в компактни групи, които са разположени в непосредствена близост до ендотела на вентралната стена на дорзалната аорта. Фенотипно те са CD34CD45+Lin клетки. Напротив, в жълтъчния сак, както и в други хематопоетични органи на ембриона (черен дроб, костен мозък), такива клетки са единични.

Следователно, в човешкия ембрион, AGM регионът съдържа клъстери от хематопоетични клетки, тясно свързани с вентралния ендотел на дорзалната аорта. Този контакт се проследява и на имунохимично ниво - както клетките на хематопоетичните клъстери, така и ендотелните клетки експресират съдовия ендотелен растежен фактор, Flt-3 лиганд, техните рецептори FLK-1 и STK-1, както и транскрипционния фактор на левкемичните стволови клетки. В AGM региона, мезенхимните производни са представени от плътна нишка от заоблени клетки, разположени по цялата дорзална аорта и експресиращи тенасцин C - гликопротеин на основното вещество, активно участващ в процесите на междуклетъчно взаимодействие и миграция.

Мултипотентните стволови клетки от AGM региона след трансплантация бързо възстановяват хематопоезата при зрели облъчени мишки и осигуряват ефективна хематопоеза за дълго време (до 8 месеца). Авторите не са открили клетки с такива свойства в жълтъчния сак. Резултатите от това проучване се потвърждават от данните на друга работа, която показва, че при ембриони в ранни стадии на развитие (10,5 дни), AGM регионът е единственият източник на клетки, които отговарят на определението за HSC, възстановявайки миелоидната и лимфоидната хематопоеза при зрели облъчени реципиенти.

Стромалната линия AGM-S3 е изолирана от AGM региона, чиито клетки поддържат генерирането на ангажирани прогениторни клетки CFU-GM, BFU-E, CFU-E и колониообразуващи единици от смесен тип в културата. Съдържанието на последните по време на култивиране върху захранващ подслой от клетки от линия AGM-S3 се увеличава от 10 до 80 пъти. По този начин, микросредата на AGM региона съдържа стромални базови клетки, които ефективно поддържат хематопоезата, така че самият AGM регион може да действа като ембрионален хематопоетичен орган - източник на дефинитивни HSC, т.е. HSC, които формират хематопоетичната тъкан на възрастно животно.

Разширеното имунофенотипизиране на клетъчния състав на AGM региона показа, че той съдържа не само мултипотентни хематопоетични клетки, но и клетки, ангажирани с миелоидна и лимфоидна (Т- и В-лимфоцити) диференциация. Молекулярният анализ на отделни CD34+c-kit+ клетки от AGM региона, използващ полимеразна верижна реакция, обаче разкри активиране само на бета-глобинови и миелопероксидазни гени, но не и на лимфоидни гени, кодиращи синтеза на CD34, Thy-1 и 15. Частичното активиране на специфични за линията гени е характерно за ранните онтогенетични етапи на генериране на HSCs и прогениторни клетки. Като се има предвид, че броят на ангажираните прогениторни клетки в AGM региона на 10-дневен ембрион е с 2-3 порядъка по-нисък, отколкото в черния дроб, може да се твърди, че на 10-ия ден от ембриогенезата хематопоезата в AGM региона едва започва, докато в основния хематопоетичен орган на плода през този период хематопоетичните линии вече са се развили.

Всъщност, за разлика от по-ранните (9-11 дни) хематопоетични стволови клетки от жълтъчния сак и AGM областта, които репопулират хематопоетичната микросреда на новороденото, но не и на възрастния организъм, хематопоетичните прогениторни клетки на 12-17-дневния ембрионален черен дроб вече не се нуждаят от ранна постнатална микросреда и населяват хематопоетичните органи на възрастно животно не по-лошо от новородено. След трансплантация на ембрионални чернодробни HSCs, хематопоезата при облъчени възрастни реципиентни мишки има поликлонален характер. Освен това, използвайки белязани колонии, беше показано, че функционирането на присадените клонове е изцяло подчинено на клоновата сукцесия, открита в костния мозък на възрастните. Следователно, ембрионалните чернодробни HSCs, белязани при най-щадящи условия, без предварителна стимулация с екзогенни цитокини, вече притежават основните атрибути на възрастните HSCs: те не се нуждаят от ранна постембрионална микросреда, влизат в състояние на дълбока латентност след трансплантацията и се мобилизират в клонова формация последователно в съответствие с модела на клоновата сукцесия.

Очевидно е необходимо да се спрем по-подробно на феномена клонална сукцесия. Еритропоезата се осъществява от хематопоетични стволови клетки, които имат висок пролиферативен потенциал и способност да се диференцират във всички линии на ангажирани прекурсорни клетки на кръвни клетки. При нормална интензивност на хематопоезата, повечето хематопоетични стволови клетки са в латентно състояние и са мобилизирани за пролиферация и диференциация, като последователно образуват клонове, които се заместват взаимно. Този процес се нарича клонална сукцесия. Експериментални доказателства за клонална сукцесия в хематопоетичната система са получени в изследвания с HSCs, маркирани с ретровирусен генен трансфер. При възрастни животни хематопоезата се поддържа от много едновременно функциониращи хематопоетични клонове, производни на HSCs. Въз основа на феномена клонална сукцесия е разработен подход за репопулация за идентифициране на HSCs. Според този принцип се прави разлика между дългосрочни хематопоетични стволови клетки (LT-HSC), които са способни да възстановяват хематопоетичната система през целия живот, и краткосрочни HSC, които изпълняват тази функция за ограничен период от време.

Ако разглеждаме хематопоетичните стволови клетки от гледна точка на подхода за репопулация, тогава особеността на хематопоетичните клетки на ембрионалния черен дроб е способността им да създават колонии, които са значително по-големи по размер от тези при растежа на HSCs от пъпна връв или костен мозък, и това се отнася за всички видове колонии. Само този факт показва по-висок пролиферативен потенциал на хематопоетичните клетки на ембрионалния черен дроб. Уникално свойство на хематопоетичните прогениторни клетки на ембрионалния черен дроб е по-краткият клетъчен цикъл в сравнение с други източници, което е от голямо значение от гледна точка на ефективността на репопулацията на хематопоетичните органи по време на трансплантация. Анализът на клетъчния състав на хематопоетичната суспензия, получена от източници на зрял организъм, показва, че на всички етапи от онтогенезата ядрените клетки са представени предимно от окончателно диференцирани клетки, чийто брой и фенотип зависят от онтогенетичната възраст на донора на хематопоетична тъкан. В частност, суспензиите от мононуклеарни клетки от костен мозък и кръв от пъпна връв се състоят от повече от 50% зрели клетки от лимфоидния ред, докато хематопоетичната тъкан на ембрионалния черен дроб съдържа по-малко от 10% лимфоцити. Освен това, клетките от миелоидния ред в ембрионалния и феталния черен дроб са представени главно от еритроидния ред, докато в кръвта от пъпна връв и костния мозък преобладават гранулоцитно-макрофагните елементи.

Важно е също така, че ембрионалният черен дроб съдържа пълен набор от най-ранните хематопоетични прекурсори. Сред последните трябва да се отбележат еритроидни, гранулопоетични, мегакариопоетични и многолинейни колониообразуващи клетки. Техните по-примитивни прекурсори - LTC-IC - са способни да пролиферират и диференцират in vitro в продължение на 5 седмици или повече, а също така запазват функционална активност след присаждане в тялото на реципиента по време на алогенна и дори ксеногенна трансплантация на имунодефицитни животни.

Биологичната целесъобразност на преобладаването на еритроидни клетки в ембрионалния черен дроб (до 90% от общия брой хематопоетични елементи) се дължи на необходимостта да се осигури бързо нарастващият кръвен обем на развиващия се плод с еритроцитна маса. В ембрионалния черен дроб еритропоезата е представена от ядрени еритроидни прекурсори с различна степен на зрялост, съдържащи фетален хемоглобин (a2u7), който поради по-високия си афинитет към кислорода осигурява ефективно усвояване на последния от майчината кръв. Интензификацията на еритропоезата в ембрионалния черен дроб е свързана с локално повишаване на синтеза на еритропоетин (EPO). Прави впечатление, че самото наличие на еритропоетин е достатъчно за реализиране на хематопоетичния потенциал на хематопоетичните клетки в ембрионалния черен дроб, докато за ангажирането на HSCs от костен мозък и пъпна връв към еритропоезата е необходима комбинация от цитокини и растежни фактори, състоящи се от EPO, SCF, GM-CSF и IL-3. В същото време, ранните хематопоетични прогениторни клетки, изолирани от ембрионалния черен дроб, които нямат рецептори за ЕПО, не реагират на екзогенен еритропоетин. За индуцирането на еритропоеза в суспензия от мононуклеарни клетки на ембрионалния черен дроб е необходимо наличието на по-напреднали еритропоетин-чувствителни клетки с CD34+CD38+ фенотип, които експресират ЕПО рецептора.

В литературата все още няма консенсус относно развитието на хематопоезата в ембрионалния период. Функционалното значение на съществуването на екстра- и интраембрионални източници на хематопоетични прогениторни клетки не е установено. Няма съмнение обаче, че в човешката ембриогенеза черният дроб е централният орган на хематопоезата и в 6-та до 12-та гестационна седмица служи като основен източник на хематопоетични стволови клетки, които населяват далака, тимуса и костния мозък. ГДР осигуряват изпълнението на съответните функции в пре- и постнаталния период на развитие.

Трябва да се отбележи още веднъж, че ембрионалният черен дроб, в сравнение с други източници, се характеризира с най-високо съдържание на HSCs. Приблизително 30% от CD344 клетките на ембрионалния черен дроб имат CD38 фенотип. В същото време броят на лимфоидните прогениторни клетки (CD45+) в ранните етапи на хематопоезата в черния дроб е не повече от 4%. Установено е, че с развитието на плода, от 7 до 17 гестационна седмица, броят на B-лимфоцитите прогресивно се увеличава с месечна „стъпка“ от 1,1%, докато нивото на HSCs трайно намалява.

Функционалната активност на хематопоетичните стволови клетки зависи и от периода на ембрионалното развитие на техния източник. Изследването на колониообразуващата активност на чернодробните клетки на човешки ембриони на 6-8 и 9-12 гестационна седмица по време на култивиране в полутечна среда в присъствието на SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6 и EPO показа, че общият брой колонии е 1,5 пъти по-висок при посяване на HSCs на ембрионален черен дроб в ранни стадии на развитие. В същото време, броят на миелопоетичните прогениторни клетки като CFU-GEMM в черния дроб на 6-8 гестационна седмица е повече от три пъти по-висок от броя им на 9-12 гестационна седмица. Като цяло, колониообразуващата активност на хематопоетичните чернодробни клетки на ембрионите през първия триместър на бременността е значително по-висока от тази на феталните чернодробни клетки през втория триместър на бременността.

Горните данни показват, че ембрионалният черен дроб в началото на ембриогенезата се отличава не само с повишено съдържание на ранни хематопоетични прогениторни клетки, но и неговите хематопоетични клетки се характеризират с по-широк спектър на диференциация в различни клетъчни линии. Тези характеристики на функционалната активност на хематопоетичните стволови клетки на ембрионалния черен дроб могат да имат определено клинично значение, тъй като техните качествени характеристики ни позволяват да очакваме изразен терапевтичен ефект при трансплантация дори на малък брой клетки, получени в ранните етапи на бременността.

Въпреки това, проблемът с количеството хематопоетични стволови клетки, необходими за ефективна трансплантация, остава отворен и актуален. Правят се опити за решаването му, използвайки високия потенциал за самовъзпроизвеждане на хематопоетичните клетки на ембрионалния черен дроб in vitro, когато са стимулирани от цитокини и растежни фактори. При постоянна перфузия на ранни ембрионални чернодробни HSCs в биореактор, след 2-3 дни е възможно да се получи количество хематопоетични стволови клетки на изход, което е 15 пъти по-високо от първоначалното им ниво. За сравнение, трябва да се отбележи, че са необходими поне две седмици, за да се постигне 20-кратно увеличение на добива на човешки HSCs от пъпна връв при същите условия.

По този начин, ембрионалният черен дроб се различава от други източници на хематопоетични стволови клетки по по-високо съдържание както на ангажирани, така и на ранни хематопоетични прогениторни клетки. В култура с растежни фактори, ембрионалните чернодробни клетки с фенотип CD34+CD45Ra1 CD71l0W образуват 30 пъти повече колонии от подобни клетки от пъпна кръв и 90 пъти повече от HSCs от костен мозък. Най-изразените разлики в посочените източници са в съдържанието на ранни хематопоетични прогениторни клетки, които образуват смесени колонии - количеството CFU-GEMM в ембрионалния черен дроб надвишава това в пъпната кръв и костния мозък съответно 60 и 250 пъти.

Важно е също, че до 18-та седмица от ембрионалното развитие (периодът на начало на хематопоезата в костния мозък), повече от 60% от чернодробните клетки участват в осъществяването на хематопоетичната функция. Тъй като човешкият плод няма тимус и съответно тимоцити до 13-та седмица от развитието, трансплантацията на хематопоетични клетки от ембрионален черен дроб на 6-12 гестационна седмица значително намалява риска от развитие на реакция „присадка срещу гостоприемник“ и не изисква избор на хистосъвместим донор, тъй като прави относително лесно постигането на хематопоетичен химеризъм.