Имунофенотипизиране на хемобластози

Значителният напредък в хематологичните изследвания през последните години е свързан с използването на съвременни имунологични методи и автоматизирани средства за анализ и сортиране на клетки от периферна кръв и костен мозък - флоуцитометри. Традиционните морфологични и цитохимични изследвания на болестните субстратни клетки (кръв, червен костен мозък, лимфни възли, далак и др.) в много случаи, особено при лимфопролиферативни заболявания, не позволяват да се идентифицира пълното разнообразие от варианти сред морфологично подобни форми и да се установи източникът на произход на патологичния клон. Тези проблеми могат да бъдат решени само чрез изучаване на имунологичните характеристики на клетките. Всеки етап на диференциация на хематологичните клетки съответства на собствен набор от антигени, които според международната класификация се наричат диференциация и се разделят на диференциационни клъстери, обозначени като CD.

При неопластични промени, блокаж на диференциацията може да възникне на всеки етап от нормалното клетъчно развитие, което води до образуването на клон от патологични клетки, които определят болестния субстрат и имат същите имунологични (или фенотипни) характеристики. Чрез провеждане на изследвания на тези маркери върху клетките е възможно да се определи на коя форма и вариант на заболяването съответстват, т.е. въз основа на имунологичния фенотип на клетките, да се проведе диференциална диагностика, която е най-трудна при лимфопролиферативните заболявания, тъй като основната клетка на патологичния субстрат на заболяването са морфологично почти идентични клетки.

Фенотипизирането позволява използването на моноклонални антитела за типизиране на бластни и зрели кръвни клетки от миело-, моно-, лимфоцитни серии чрез наличието на диференциращи антигени (рецептори) в клетъчната стена. Разделът „Оценка на имунния статус на организма“ частично описва характеристиките и диагностичната стойност на изследването на клетъчните маркери; по-долу е дадено кратко описание на антигенните маркери на клетките във връзка с диагностицирането на хемобластози. Следните антигени (маркери) могат да бъдат открити върху мембраните на кръвните клетки и червения костен мозък.

• CD2 е мономерен трансмембранен гликопротеин. Той присъства на повърхността на всички Т-лимфоцити, циркулиращи в кръвта, и върху някои NK-лимфоцити. CD2 участва в процеса на алтернативно активиране на Т-лимфоцитите. Откриването на CD2 с помощта на моноклонални антитела в клиничната практика се използва за фенотипизиране на остра Т-клетъчна левкемия, лимфоми, хронични възпалителни и имунодефицитни състояния.
• CD3 е протеинов комплекс, свързан с антиген-специфичния Т-клетъчен рецептор, той е основният функционален маркер на Т-лимфоцитите. Той улеснява прехвърлянето на активиращия сигнал от мембраната към клетъчната цитоплазма. Определянето на CD3 е показано за диагностициране на остра Т-клетъчна левкемия, лимфоми (CD3 не се експресира в не-Т-клетъчни лимфоидни неоплазми) и имунодефицитни заболявания.
• CD4 е трансмембранен гликопротеин, експресиран от субпопулация от Т-хелпери (индуктори), които съставляват 45% от лимфоцитите в периферната кръв. В ранните етапи на развитие на лимфоцитите в тимуса, CD4 антигените, както и CD8, се експресират от всички кортикални лимфоцити. Медуларните тимоцити, чийто фенотип е подобен на зрелите CD4+ Т-клетки в периферната кръв (Т-хелпери), вече експресират или CD4, или CD8 рецептори. В периферната кръв до 5% от клетките носят както CD4, така и CD8 маркери. Незначителна експресия на CD4 е възможна върху някои клетки от моноцитната серия. CD4 се експресира в повечето случаи на Т-клетъчни лимфоми, включително микозис фунгоидес, както и при HTLV-асоциирана Т-клетъчна левкемия (HTLV - човешки Т-лимфотропен вирус).
• CD5 е едноверижен гликопротеин, присъстващ във всички зрели Т-лимфоцити и повечето тимоцити, и е слабо експресиран от В-лимфоцитите. CD5 се открива върху неопластични клетки на В-клетъчна хронична лимфоцитна левкемия и центроцитен лимфом. При други видове злокачествени лимфоидни заболявания - фоликуларен лимфом, косматоклетъчна левкемия, едроклетъчен лимфом - CD5 не се експресира.
• CD7 е едноверижен протеин, най-ранният маркер на Т-клетъчната диференциация. Той се експресира от про-Т-лимфоцитите още преди миграцията им към тимуса. CD7 се открива върху повечето NK клетки, слаба експресия се наблюдава върху моноцитите. В-лимфоцитите и гранулоцитите не съдържат този антиген. Определянето на CD7 се използва за диагностициране на лимфоми, детска Т-клетъчна лимфобластна левкемия.
• CD8 е протеин, състоящ се от две полипептидни вериги, свързани чрез дисулфидни мостове. Той се експресира от субпопулация от цитотоксични и супресорни Т-лимфоцити, които съставляват 20-35% от лимфоцитите в периферната кръв. Този антиген се експресира също от NK лимфоцити, кортикални тимоцити, 30% от медуларните тимоцити и субпопулация от клетки от червен костен мозък. CD8 се изследва за количествено определяне на съдържанието на Т-супресори (вижте раздела „Супресорни Т-лимфоцити в кръвта“ по-горе).

• CD10 е ендопептидаза, свързана с клетъчната мембрана. CD10 се експресира от млади форми на В лимфоцити и субпопулация от кортикални лимфоцити. CD10 се експресира от всички ALL клетки.
• CD11c се експресира върху клетъчната мембрана от макрофаги, моноцити, гранулоцити, NK клетки и клетки на косматоклетъчна левкемия.
• CD13 е гликопротеин, експресиран от клетки от миеломоноцитния род (прогениторни клетки, неутрофили, базофили, еозинофили, моноцити и миелоидни левкемични клетки). Той отсъства от Т- и В-лимфоцитите, еритроцитите и тромбоцитите.
• CD14 е повърхностно-мембранен гликопротеин. Експресира се главно от моноцити и макрофаги. CD14 се открива върху повече от 95% от моноцитите в периферната кръв и костния мозък. Силна експресия на CD14 се наблюдава при остра миелобластна левкемия. Този антиген не се експресира при остра и хронична лимфобластна левкемия.
• CD15 е олигозахарид. Той участва във фагоцитозата и хемотаксиса. Този антиген присъства на повърхността на зрелите гранулоцити и клетките на Березовски-Щернберг. Експресията на CD15 антигена се открива при болестта на Ходжкин. При неходжкинови лимфоми CD15 не се открива в повечето случаи.
• CD16 се експресира на повърхността на гранулоцити, моноцити, макрофаги и NK клетки. Всички лимфоцити, експресиращи този антиген, имат способността за антитяло-зависима клетъчна цитотоксичност. CD16 се определя по време на типизиране на хронични миелоцитни левкемии, за да се характеризират NK клетките.
• CD19 е гликопротеин, присъстващ във всички периферни В-лимфоцити и всички В-клетъчни прекурсори. Липсва в плазмените клетки. Той е най-ранният маркер на В-клетките и играе важна роля в регулирането на активирането и пролиферацията на В-клетките. CD19 се експресира във всички неопластични клетки на остра левкемия от В-клетъчен произход и присъства също в някои форми на остра монобластна левкемия.
• CD20 е негликозилиран протеин. В онтогенезата на B-лимфоцитите, CD20 антигенът се появява след CD19 на етапа на пре-B-клетъчната диференциация на лимфоцитите. Той отсъства от плазмената мембрана на плазмените клетки. Експресира се при ALL, B-клетъчна хронична лимфоцитна левкемия, косматоклетъчна левкемия, лимфом на Бъркит и много рядко при остра монобластна левкемия.
• CD21 е гликопротеин, присъстващ в значителни количества върху B-лимфоцитите в лимфоидните органи и в малки количества върху B-клетките в периферната кръв. CD21 е рецептор за вируса на Епщайн-Бар.
• CD22 е протеин, състоящ се от две полипептидни вериги. Той се експресира върху мембраната на повечето В лимфоцити, включително прекурсорни клетки (пролимфоцити). Антигенът не се експресира върху В лимфоцитите (плазмените клетки) след тяхното активиране. Най-изразена експресия на CD22 се открива върху клетките при косматоклетъчна левкемия, слаба - при миелоидна левкемия и не-Т-клетъчна ALL.
• CD23 е гликопротеин, експресиран в много по-висока степен от активирани периферни кръвни B лимфоцити. CD23 медиира IgE-зависимата цитотоксичност и фагоцитоза от макрофаги и еозинофили.
• CD25 е едноверижен гликопротеин, идентифициран като нискоафинитетен рецептор за IL-2. Този рецептор се експресира върху активирани Т-лимфоцити и, в по-малка плътност, върху активирани В-клетки. В периферната кръв на здрави индивиди антигенът присъства върху повече от 5% от лимфоидните клетки.
• CD29 е фибронектинов рецептор. Той е широко разпространен в тъканите и се експресира от левкоцити. Откриването на CD29 върху периферни кръвни клетки се използва за типизиране на субпопулация от Т-клетки с CD4+CD29+ фенотип, които се наричат тип 2 хелпери (Th2). Тези клетки участват в хуморалния имунен отговор чрез продуциране на лимфокини.
• CD33 е трансмембранен гликопротеин. Той присъства на повърхността на клетки от миелоидния и моноцитния ред. Намира се на повърхността на моноцитите и в по-малка степен на гранулоцитите в периферната кръв. Приблизително 30% от клетките на червения костен мозък експресират CD33, включително миелобласти, промиелоцити и миелоцити. Антигенът липсва от мембраните на плурипотентните стволови клетки. Определянето на CD33 се използва за характеризиране на клетки при левкемии с миелоиден произход. Левкемичните клетки с лимфоиден и еритроиден произход не експресират CD33.
• CD34 е фосфогликопротеин, експресиран от хематопоетични прогениторни клетки, включително монопотентни стволови клетки. Най-изразената експресия на Ag се наблюдава в ранните прогениторни клетки; с узряването на клетките, експресията на маркера намалява. CD34 се открива и върху ендотелни клетки. Определянето на CD34 се използва за характеризиране на клетки при остра миелобластна и лимфобластна левкемия. При хронични лимфоцитни левкемии и лимфоми, експресията на CD34 антиген не се открива.

• CD41a се експресира от тромбоцити и мегакариоцити. Моноклонални антитела за откриване на CD41a се използват за диагностициране на мегакариобластна левкемия. При тромбастенията на Гланцман експресията на този антиген липсва или е значително потисната.
• CD42b е мембранен гликопротеин, състоящ се от две полипептидни вериги. Маркерът се открива на повърхността на тромбоцитите и мегакариоцитите. В клиничната практика откриването на CD42b се използва за диагностициране на тромбоцитопатия - синдром на Бернар-Сулие.
• CD45RA принадлежи към класа на трансмембранните гликопротеини. Той е често срещан левкоцитен антиген. Експресира се върху клетъчната мембрана на В-лимфоцитите, в по-малка степен на Т-лимфоцитите и върху зрелите медуларни тимоцити. Маркерът не се експресира от гранулоцитите.
• CD45RO е нискомолекулна изоформа на CD45RA, често срещан левкоцитен антиген. Той се открива върху Т-клетки (паметни Т-лимфоцити), субпопулация от В-лимфоцити, моноцити и макрофаги. Моноклоналните антитела към CD45RO взаимодействат с повечето тимоцити, субпопулация от почиващи CD4+ и CD8+ Т-лимфоцити и зрели активирани Т-клетки. Клетки с миеломоноцитен произход, гранулоцити и моноцити също носят този антиген. Той се открива при центробластични и имунобластични лимфоми.
• CD46 е О-гликозилиран димер. Той е широко разпространен в тъканите и се експресира от Т- и В-лимфоцити, моноцити, гранулоцити, NK клетки, тромбоцити, ендотелни клетки, фибробласти, но липсва от повърхността на червените кръвни клетки. CD46 осигурява тъканна защита от комплемента.
• CD61 е тромбоцитен антиген. Той се експресира върху тромбоцитите на периферната кръв и червения костен мозък, както и върху мегакариоцитите и мегакариобластите. Определянето му се използва като маркер при остра мегакариобластна левкемия. Експресията на антиген липсва или е потисната при пациенти с тромбастения на Гланцман.
• CD95, наричан още Fas или APO-1, е трансмембранен гликопротеин, член на семейството на рецепторите на тумор некрозис фактора. Той се експресира в значителни количества върху Т-лимфоцитите (CD4+ и CD8+) в периферната кръв и в по-малка степен върху В-лимфоцитите и NK клетките. Този антиген се експресира също върху гранулоцити, моноцити, тъканни клетки и неопластични клетки. Свързването на CD95 с Fas лиганд (CD95L) индуцира апоптоза в клетките.
• CD95L, или Fas лиганд, е мембранен протеин, принадлежащ към семейството на рецепторите на тумор некрозис фактора. Този антиген се експресира от цитотоксични Т-лимфоцити, NK клетки и много често туморни клетки; той е основният индуктор на апоптоза в клетките.
• HLA-DR е мономорфен детерминант на молекули от клас II на човешкия главен комплекс за хистосъвместимост (HLA). Маркерът се експресира върху Лангерхансови клетки, дендритни клетки на лимфоидни органи, някои видове макрофаги, В-лимфоцити, активирани Т-клетки и тимусни епителни клетки. Изследването на този маркер се използва за количествено определяне на активирани Т-лимфоцити с CD3+ HLA-DR+ фенотип.

Използвайки различен подбор от моноклонални антитела към маркери, е възможно да се създаде фенотипен портрет на клетки, характерни за дадена форма на левкемия.

В допълнение към използването на имунофенотипизиращи методи за диагностика и диференциална диагностика на хемобластози, особено важно се оказа тяхното използване в лечебния процес за оценка на състоянието на ремисия и остатъчната популация от левкемични клетки. Познавайки фенотипния „портрет“ на бластните клетки през периода на диагнозата, тези маркери позволяват откриването на клетки от левкемичния клон по време на периода на ремисия, а чрез увеличаването на броя им - прогнозирането на развитието на рецидив много преди (1-4 месеца) появата на неговите клинични и морфологични признаци.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]