Corynebacterium

Дифтерията е остро инфекциозно заболяване, засягащо предимно деца, което се проявява като дълбока интоксикация на организма с дифтериен токсин и характерно фибринозно възпаление на мястото на локализация на патогена. Името на заболяването произлиза от гръцката дума diphthera - кожа, филм, тъй като на мястото на размножаване на патогена се образува плътен, сивкаво-бял филм.

Причинителят на дифтерията - Corynebacterium diphtheriae - е открит за първи път през 1883 г. от Е. Клебс в срези от филм, а в чиста култура е получен през 1884 г. от Ф. Лефлер. През 1888 г. Е. Ру и А. Йерсин откриват способността му да произвежда екзотоксин, който играе основна роля в етиологията и патогенезата на дифтерията. Производството на антитоксичен серум от Е. Беринг през 1892 г. и използването му от 1894 г. за лечение на дифтерия позволява значително намаляване на смъртността. Успешна атака срещу това заболяване започва след 1923 г. във връзка с разработването на метод за получаване на дифтериен анатоксин от Г. Район.

Причинителят на дифтерията принадлежи към рода Corynebacterium (клас Actinobacteria). Морфологично се характеризира с това, че клетките са с форма на клубак и удебелени в краищата (гръцки coryne - клубак), образуват разклонения, особено в старите култури, и съдържат гранулирани включвания.

Родът Corynebacterium включва голям брой видове, които са разделени на три групи.

• Коринебактериите са паразити на хора и животни и са патогенни за тях.
• Коринебактерии, патогенни за растенията.
• Непатогенни коринебактерии. Много видове коринебактерии са нормални обитатели на кожата, лигавиците на фаринкса, назофаринкса, очите, дихателните пътища, уретрата и гениталиите.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ]

Морфология на коринебактериите

C. diphtheriae са прави или леко извити неподвижни пръчици с дължина 1,0-8,0 μm и диаметър 0,3-0,8 μm; не образуват спори или капсули. Често имат подутини в единия или двата края и често съдържат метахроматични гранули - волютинови зърна (полиметафосфати), които придобиват синкаво-лилав цвят при оцветяване с метиленово синьо. За тяхното откриване е предложен специален метод за оцветяване по Neisser. В този случай пръчиците се оцветяват в сламеножълто, а волютиновите зърна са тъмнокафяви и обикновено са разположени на полюсите. Corynebacterium diphtheriae се оцветява добре с анилинови багрила, грам-положителна е, но в стари култури често се обезцветява и има отрицателно оцветяване по Грам. Характеризира се с изразен полиморфизъм, особено в стари култури и под влияние на антибиотици. Съдържанието на G + C в ДНК е около 60 mol %.

Биохимични свойства на коринебактериите

Дифтерийният бацил е аероб или факултативен анаероб, температурният оптимум за растеж е 35-37 °C (границите на растеж са 15-40 °C), оптималното pH е 7,6-7,8. Не е много взискателен към хранителни среди, но расте по-добре върху среди, съдържащи серум или кръв. Средите на Ру или Льофлер със сиренен серум са селективни за дифтерийните бактерии, растежът върху тях се появява след 8-12 часа под формата на изпъкнали колонии с размер на глава на карфица, сиво-бели или жълтеникаво-кремави на цвят. Повърхността им е гладка или леко зърнеста, по периферията колониите са малко по-прозрачни, отколкото в центъра. Колониите не се сливат, в резултат на което културата придобива вид на шагренова кожа. Върху бульона растежът се проявява като равномерна мътност или бульонът остава прозрачен, а върху повърхността му се образува нежен филм, който постепенно се сгъстява, рони се и се утаява на люспи на дъното.

Характерна особеност на дифтерийните бактерии е добрият им растеж върху кръвни и серумни среди, съдържащи такива концентрации на калиев телурит, че потискат растежа на други видове бактерии. Това се дължи на факта, че C. diphtheriae редуцират калиевия телурит до метален телур, който, отложен в микробните клетки, придава на колониите характерен тъмносив или черен цвят. Използването на такива среди увеличава процента на посяване на дифтерийните бактерии.

Corynebacterium diphtheriae ферментират глюкоза, малтоза, галактоза с образуване на киселина без газ, но не ферментират (като правило) захароза, имат цистиназа, нямат уреаза и не образуват индол. По тези характеристики те се различават от онези коринеформни бактерии (дифтероиди), които най-често се срещат по лигавицата на окото (Corynebacterium xerosus) и назофаринкса (Corynebacterium pseiidodiphtheriticum) и от други дифтероиди.

В природата съществуват три основни варианта (биотипа) на дифтерийния бацил: гравис, интермедин и митис. Те се различават по морфологични, културни, биохимични и други свойства.

Разделянето на дифтерийните бактерии на биотипове е направено, като се вземат предвид формите на дифтерия, при които те се изолират с най-голяма честота. Типът gravis се изолира най-често от пациенти с тежка форма на дифтерия и причинява групови огнища. Типът mitis причинява по-леки и спорадични случаи на заболяването, а типът intermedius заема междинно положение между тях. Corynebacterium belfanti, приписван преди на mitis биотипа, е изолиран като самостоятелен, четвърти биотип. Основната му разлика от gravis и mitis биотиповете е способността да редуцира нитратите до нитрити. Щамовете Corynebacterium belfanti имат изразени адхезивни свойства, като сред тях се откриват както токсигенни, така и нетоксигенни варианти.

[ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Антигенна структура на коринебактериите

Коринебактериите са много хетерогенни и мозаични. И в трите вида дифтерийни патогени са открити няколко десетки соматични антигена, според които те са разделени на серотипове. В Русия е приета серологична класификация, според която се разграничават 11 серотипа на дифтерийни бактерии, от които 7 са основни (1-7) и 4 са допълнителни, рядко срещани серотипове (8-11). Шест серотипа (1, 2, 3, 4, 5, 7) принадлежат към типа gravis, а пет (6, 8, 9, 10, 11) принадлежат към типа mitis. Недостатък на метода за серотипизиране е, че много щамове, особено нетоксигенните, имат спонтанна аглутинация или полиаглутинируемост.

[ 11 ]

Фаготипизиране на Corynebacterium diphtheriae

За диференциране на дифтерийните бактерии са предложени различни схеми за фаготипизиране. Според схемата на М. Д. Крилова, използвайки набор от 9 фага (A, B, C, D, F, G, H, I, K), е възможно да се типизират повечето токсигенни и нетоксигенни щамове от типа gravis. Вземайки предвид чувствителността към посочените фаги, както и културните, антигенни свойства и способността за синтезиране на корицини (бактерицидни протеини), М. Д. Крилова идентифицира 3 независими групи коринебактерии от типа gravis (I-III). Всяка от тях съдържа подгрупи от токсигенни и техните нетоксигенни аналози на дифтерийни патогени.

Резистентност към коринебактерии

Corynebacterium diphtheriae проявява висока устойчивост на ниски температури, но бързо умира при високи температури: при 60°C - в рамките на 15-20 минути, при кипене - след 2-3 минути. Всички дезинфектанти (лизол, фенол, хлорамин и др.) в обичайно използваната концентрация го унищожават за 5-10 минути. Въпреки това, дифтерийният патоген понася добре сушенето и може да остане жизнеспособен дълго време в изсушена слуз, слюнка и прахови частици. Във фин аерозол дифтерийните бактерии остават жизнеспособни в продължение на 24-48 часа.

Фактори на патогенност на коринебактериите

Патогенността на Corynebacterium diphtheriae се определя от наличието на редица фактори.

Фактори на адхезия, колонизация и инвазия

Структурите, отговорни за адхезията, не са идентифицирани, но без тях дифтерийният бацил не би могъл да колонизира клетките. Тяхната роля се изпълнява от някои компоненти на клетъчната стена на патогена. Инвазивните свойства на патогена са свързани с хиалуронидаза, невраминидаза и протеаза.

Токсичен гликолипид, съдържащ се в клетъчната стена на патогена. Той е 6,6'-диестер на трехалоза, съдържащ коринемилонова киселина (C32H64O3) и коринемилонова киселина (C32H62O3) в еквимоларни съотношения (трехалоза-6,6'-дикоринемикола). Гликолипидът има разрушителен ефект върху тъканните клетки на мястото на размножаване на патогена.

Екзотоксин, който определя патогенността на патогена и естеството на патогенезата на заболяването. Нетоксигенните варианти на C. diphtheriae не причиняват дифтерия.

Екзотоксинът се синтезира като неактивен прекурсор - единична полипептидна верига с молекулно тегло 61 kD. Активира се от самата бактериална протеаза, която разрязва полипептида на два пептида, свързани чрез дисулфидни връзки: A (mw 21 kD) и B (mw 39 kD). Пептид B изпълнява акцепторна функция - разпознава рецептора, свързва се с него и образува интрамембранен канал, през който пептид A прониква в клетката и осъществява биологичната активност на токсина. Пептид A е ADP-рибозилтрансферазен ензим, който осигурява прехвърлянето на аденозин дифосфат рибоза от NAD към един от аминокиселинните остатъци (хистидин) на протеиновия елонгиращ фактор EF-2. В резултат на модификацията EF-2 губи своята активност и това води до потискане на протеиновия синтез от рибозомите на етапа на транслокация. Токсинът се синтезира само от онези C. diphtheriae, които носят гените на умерено конвертиращия профаг в своята хромозома. Оперонът, кодиращ синтеза на токсина, е моноцистронен, състои се от 1,9 хиляди нуклеотидни двойки и има toxP промотор и 3 региона: toxS, toxA и toxB. ToxS регионът кодира 25 аминокиселинни остатъка от сигналния пептид (той осигурява освобождаването на токсина през мембраната в периплазменото пространство на бактериалната клетка), toxA - 193 аминокиселинни остатъка от пептид А, а toxB - 342 аминокиселинни остатъка от пептид В на токсина. Загубата на профага от клетката или мутациите в tox оперона правят клетката леко токсигенна. Напротив, лизогенизацията на нетоксигенните C. diphtheriae от конвертиращия фаг ги превръща в токсигенни бактерии. Това е доказано недвусмислено: токсигенността на дифтерийните бактерии зависи от тяхната лизогенизация от токс-конвертиращи коринефаги. Коринефагите се интегрират в хромозомата на коринебактериите, използвайки механизма на сайт-специфична рекомбинация, а щамовете на дифтерийните бактерии могат да съдържат 2 сайта за рекомбинация (attB) в своите хромозоми, като коринефагите се интегрират във всеки от тях с еднаква честота.

Генетичният анализ на редица нетоксигенни щамове на дифтерийни бактерии, проведен с помощта на маркирани ДНК сонди, носещи фрагменти от коринефагния tox оперон, показа, че техните хромозоми съдържат ДНК последователности, хомоложни на коринефагния tox оперон, но те или кодират неактивни полипептиди, или са в „тихо“ състояние, т.е. неактивни. В тази връзка възниква много важен епидемиологичен въпрос: могат ли нетоксигенните дифтерийни бактерии да се трансформират в токсигенни при естествени условия (в човешкото тяло), подобно на това, което се случва in vitro? Възможността за подобна трансформация на нетоксигенни култури от коринебактерии в токсигенни с помощта на фагова конверсия е демонстрирана в експерименти върху морски свинчета, пилешки ембриони и бели мишки. Дали обаче това се случва по време на естествения епидемичен процес (и ако да, колко често) все още не е установено.

Поради факта, че дифтерийният токсин в организма на пациентите има селективен и специфичен ефект върху определени системи (засегнати са предимно симпатико-надбъбречната система, сърцето, кръвоносните съдове и периферните нерви), очевидно е, че той не само инхибира биосинтеза на протеини в клетките, но и причинява други нарушения в техния метаболизъм.

Следните методи могат да се използват за откриване на токсичността на дифтерийните бактерии:

• Биологични тестове върху животни. Интрадермалната инфекция на морски свинчета с филтрат от бульонна култура от дифтерийни бактерии причинява некроза на мястото на инжектиране. Една минимална летална доза токсин (20-30 ng) убива морско свинче с тегло 250 g при подкожно инжектиране на 4-5-ия ден. Най-характерната проява на действието на токсина е увреждането на надбъбречните жлези, които са уголемени и рязко хиперемирани.
• Инфекция на пилешки ембриони. Дифтерийният токсин причинява тяхната смърт.
• Инфекция на клетъчни култури. Дифтерийният токсин причинява отчетлив цитопатичен ефект.
• Твърдофазен ензимно-свързан имуносорбентен анализ с използване на белязани с пероксидаза антитоксини.
• Използване на ДНК сонда за директно откриване на tox оперона в хромозомата на дифтерийни бактерии.

Най-простият и най-разпространен метод за определяне на токсичността на дифтерийните бактерии обаче е серологичният - методът на гел-утаяване. Същността му е следната. Лента от стерилна филтърна хартия с размери 1,5 х 8 см се навлажнява с антитоксичен антидифтериен серум, съдържащ 500 АЕ в 1 мл, и се нанася върху повърхността на хранителната среда в петриева паничка. Паничката се суши в термостат в продължение на 15-20 минути. Тестваните култури се посяват с плаки от двете страни на хартията. Върху една паничка се посяват няколко щама, единият от които, очевидно токсичен, служи като контрола. Паничките с културите се инкубират при 37°C, резултатите се отчитат след 24-48 часа. Поради контрадифузията на антитоксина и токсина в гела, на мястото на тяхното взаимодействие се образува ясна линия на утаяване, която се слива с линията на утаяване на контролния токсигенен щам. Неспецифичните преципитационни ленти (те се образуват, ако освен антитоксина в серума присъстват и други антимикробни антитела в малки количества) се появяват късно, слабо се експресират и никога не се сливат с преципитационната лента на контролния щам.

Постинфекциозен имунитет

Силни, персистиращи, практически доживотни, повтарящи се случаи на заболяването се наблюдават рядко - при 5-7% от преболедувалите. Имунитетът е предимно антитоксичен по природа, антимикробните антитела са от по-малко значение.

Шик тестът е бил широко използван преди това за оценка на нивото на антидифтериен имунитет. За тази цел на деца е инжектирана интрадермално 1/40 от токсина на морско свинче в обем от 0,2 ml. При липса на антитоксичен имунитет, на мястото на инжектиране след 24-48 часа се появяват зачервяване и подуване с диаметър повече от 1 cm. Такава положителна Шик реакция показва или пълна липса на антитоксин, или че съдържанието му е по-малко от 0,001 AE/ml кръв. Отрицателна Шик реакция се наблюдава, когато съдържанието на антитоксин в кръвта е по-високо от 0,03 AE/ml. Ако съдържанието на антитоксин е по-ниско от 0,03 AE/ml, но по-високо от 0,001 AE/ml, Шик реакцията може да бъде както положителна, така и понякога отрицателна. Освен това самият токсин има изразено алергенно свойство. Следователно, за да се определи нивото на антидифтериен имунитет (количествено съдържание на антитоксин), е по-добре да се използва RPGA с еритроцитен диагностикум, сенсибилизиран с дифтериен токсоид.

Епидемиология на дифтерията

Единственият източник на инфекция е човек - болен, възстановяващ се или здрав носител на бактериите. Заразяването става чрез въздушно-капковидни капчици, въздушно-капков прах, както и чрез различни предмети, използвани от болни или здрави носители: чинии, книги, спално бельо, играчки и др. В случай на замърсяване на хранителни продукти (мляко, кремове и др.), инфекцията е възможна по хранителен път. Най-масово отделяне на патогена се случва при острата форма на заболяването. Въпреки това, хората с латентни, атипични форми на заболяването са от най-голямо епидемиологично значение, тъй като те често не се хоспитализират и не се откриват веднага. Пациент с дифтерия е заразен през целия период на заболяването и част от периода на възстановяване. Средният период на носителство на бактерии при възстановяващи се варира от 2 до 7 седмици, но може да продължи до 3 месеца.

Здравите носители играят специална роля в епидемиологията на дифтерията. В условия на спорадична заболеваемост те са основните разпространители на дифтерия, допринасяйки за запазването на патогена в природата. Средната продължителност на носителството на токсигенни щамове е малко по-кратка (около 2 месеца) от нетоксигенните (около 2-3 месеца).

Причината за формирането на здравословно носителство на токсигенни и нетоксигенни дифтерийни бактерии не е напълно разкрита, тъй като дори високото ниво на антитоксичен имунитет не винаги осигурява пълно освобождаване на организма от патогена. Вероятно нивото на антибактериален имунитет има определено значение. От първостепенно епидемиологично значение е носителството на токсигенни щамове на дифтерийни бактерии.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Симптоми на дифтерия

Хора от всяка възраст са податливи на дифтерия. Патогенът може да проникне в човешкото тяло през лигавиците на различни органи или през увредена кожа. В зависимост от локализацията на процеса се разграничават дифтерия на фаринкса, носа, ларинкса, ухото, окото, гениталиите и кожата. Възможни са смесени форми, например дифтерия на фаринкса и кожата и др. Инкубационният период е 2-10 дни. При клинично изразената форма на дифтерия на мястото на локализация на патогена се развива характерно фибринозно възпаление на лигавицата. Токсинът, произвеждан от патогена, първо засяга епителните клетки, а след това и близките кръвоносни съдове, увеличавайки тяхната пропускливост. Изходящият ексудат съдържа фибриноген, чиято коагулация води до образуването на сиво-бяло филмово покритие върху повърхността на лигавицата, което е плътно сраснато с подлежащата тъкан и при откъсване причинява кървене. Последицата от увреждането на кръвоносните съдове може да бъде развитието на локален оток. Дифтерията на фаринкса е особено опасна, тъй като може да причини дифтериен круп поради оток на лигавицата на ларинкса и гласните струни, от който 50-60% от децата с дифтерия са умирали в резултат на асфиксия. Дифтерийният токсин, попадайки в кръвта, причинява обща дълбока интоксикация. Той засяга главно сърдечно-съдовата, симпатико-надбъбречната системи и периферните нерви. По този начин симптомите на дифтерия се състоят от комбинация от локални признаци, зависещи от локализацията на входната врата, и общи симптоми, причинени от отравяне с токсина и проявяващи се под формата на адинамия, летаргия, бледа кожа, ниско кръвно налягане, миокардит, парализа на периферните нерви и други нарушения. Дифтерията при ваксинирани деца, ако се наблюдава, обикновено протича в лека форма и без усложнения. Смъртността в периода преди прилагането на серотерапия и антибиотици е била 50-60%, сега е 3-6%.

Лабораторна диагностика на дифтерия

Единственият метод за микробиологична диагностика на дифтерия е бактериологичният, със задължително изследване на изолираната култура от коринебактерии за токсичност. Бактериологични изследвания за дифтерия се провеждат в три случая:

• за диагностициране на дифтерия при деца и възрастни с остри възпалителни процеси във фаринкса, носа и назофаринкса;
• според епидемиологични показания на лица, които са били в контакт с източника на дифтериен патоген;
• лица, новоприети в домове за сираци, детски ясли, интернати и други специални институции за деца и възрастни, с цел идентифициране на евентуални носители на дифтериен бацил сред тях.

Материалът за изследването е слуз от фаринкса и носа, филм от сливиците или други лигавици, които са входна точка за патогена. Посяването се извършва върху телуритен серум или кръвна среда и едновременно върху коагулиран серум на Roux (коагулиран конски серум) или Loeffler (3 части говежди серум + 1 част захарен бульон), върху които растежът на коринебактериите се появява след 8-12 часа. Изолираната култура се идентифицира чрез комбинация от морфологични, културални и биохимични свойства, като се използват методи за серо- и фаготипизиране, когато е възможно. Във всички случаи е задължителен тест за токсичност, използващ един от горните методи. Морфологичните характеристики на коринебактериите се изучават най-добре, като се използват три метода за оцветяване на натривка: Грам, Найсер и метиленово синьо (или толуидиново синьо).

Лечение на дифтерия

Специфично лечение за дифтерия е използването на антидифтериен антитоксичен серум, съдържащ най-малко 2000 IU на 1 ml. Серумът се прилага интрамускулно в дози от 10 000 до 400 000 IU в зависимост от тежестта на заболяването. Ефективен метод на лечение е употребата на антибиотици (пеницилини, тетрациклини, еритромицин и др.) и сулфонамиди. За стимулиране на производството на собствени антитоксини може да се използва анатоксин. За елиминиране на бактериалния носител трябва да се използват антибиотици, към които даден щам коринебактерии е силно чувствителен.

Специфична профилактика на дифтерия

Основният метод за борба с дифтерията е масовата планова ваксинация на населението. За тази цел се използват различни варианти на ваксини, включително комбинирани, т.е. насочени към едновременно създаване на имунитет срещу няколко патогена. Най-разпространената ваксина в Русия е DPT. Тя представлява суспензия от бактерии на магарешка кашлица, адсорбирани върху алуминиев хидроксид, убити от формалин или тимерозал (20 милиарда в 1 ml), и съдържа дифтериен токсоид в доза от 30 флокулиращи единици и 10 единици свързващ тетаничен токсоид в 1 ml. Децата се ваксинират от 3-месечна възраст, след което се извършват реваксинации: първата след 1,5-2 години, следващите на 9 и 16 години и след това на всеки 10 години.

Благодарение на масовата ваксинация, започнала в СССР през 1959 г., заболеваемостта от дифтерия в страната до 1966 г., в сравнение с 1958 г., е намалена 45 пъти, а показателят ѝ през 1969 г. е 0,7 на 100 000 души население. Последвалото намаляване на обема на ваксинациите през 80-те години на миналия век води до сериозни последици. През 1993-1996 г. Русия е обхваната от епидемия от дифтерия. Заболяват възрастни, главно неваксинирани, и деца. През 1994 г. са регистрирани почти 40 хиляди пациенти. Във връзка с това е възобновена масовата ваксинация. През този период са ваксинирани 132 милиона души, включително 92 милиона възрастни. През 2000-2001 г. обхватът на децата с ваксинации в установения срок е 96%, а с реваксинация - 94%. Поради това, заболеваемостта от дифтерия през 2001 г. е намаляла 15 пъти в сравнение с 1996 г. Въпреки това, за да се намали заболеваемостта до изолирани случаи, е необходимо да се ваксинират поне 97-98% от децата през първата им година от живота и да се осигури масова реваксинация през следващите години. Малко вероятно е дифтерията да бъде напълно елиминирана през следващите години поради широко разпространеното носителство на токсигенни и нетоксигенни дифтерийни бактерии. Ще е необходимо и известно време, за да се реши този проблем.