Лабораторна диагностика на туберкулоза

Туберкулозата е заболяване, което е лесно да се диагностицира в съвременните условия и научните постижения. Лабораторната диагностика на туберкулозата е от основно значение за други диагностични методи, второ само за рентгенови методи на изследване.

[1], [2], [3], [4],

Клиничен кръвен тест

Пациенти с туберкулоза промени в общия анализ на кръв не е патогномонични. С ограничени и неактивни форми на туберкулоза хипохро характеристика на еритроцити в обичайно количество. Когато масивни инфилтрати или случаен пневмония, докато разпространението на случаен лимфаденит, специфични чревни лезии, както и за голям белодробна или постоперативно кървене и бележка erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Макроцитозата, а още по-рядко пойкилоцитоза, обикновено с тежка анемия. Брой на ретикулоцитите в стъпка туберкулоза компенсира варира от 0.1 до 0.6%, с subcompensated - от 0.6 до 1.0% и 1% се характеризира с декомпенсирана ретикулоцити.

Когато туберкулоза в някои случаи може да има умерено левкоцитоза (до 15 хиляди от левкоцити.), По-малко радиация, които се срещат в 2-7% от пациентите с ограничени и лесен процес срещащи се форми и в 12.5% - от деструктивни и прогресивно белодробна туберкулоза ,

Най-честите промени се появяват в левкоцитната формула. Маркирайте както относителната, така и абсолютната неутрофилия, умерено изместване на левкоцитната формула вляво преди промиелоцитите. Миелоцитите са много редки в случай на безплодна туберкулоза. Увеличаването на броя на неутрофилите с патологичен гранулат в хемограма на пациент с туберкулоза винаги показва продължителността на процеса: при пациенти с тежка туберкулоза почти всички неутрофили съдържат патологична зрялост. Когато туберкуларната епидемия престане, ядреното преместване сравнително бързо се доближава до нормалното. Патологичната зрялост на неутрофилите обикновено продължава по-дълго от другите промени в хемограмата.

Съдържанието на еозинофили в периферната кръв също варира в зависимост от фазата на процеса и алергичното състояние на организма. Техният брой намалява до aneozinofiliya в тежка и продължителна огнище на заболяване и, обратно, се увеличава инфилтрати на резорбция и плеврален излив, както ранните форми на първична туберкулоза.

Повечето форми на първична туберкулоза се съпровождат от лимфопения, която понякога се наблюдава от няколко години, дори след белези на специфични промени. Вторичната туберкулоза във фазата на обостряне в зависимост от тежестта на процеса може да бъде придружена или от нормален брой лимфоцити, или от лимфопения.

Той заема специално място определяне на еритроцитите процент утаяване Допълнителни тестове за оценка на туберкулозен процес (ESR) със стойност на оценката на процеса на туберкулоза поток и идентифициране на неговите активни форми. Увеличение на ESR показва наличието на патологичния процес (инфекциозно-възпалителни, гнойни септичен, хемобластоза, лимфом и др.) И е показателно за неговата тежест, но нормални нива не ESR винаги означава липса на патология. Ускоряване на утаяване на еритроцитите допринасят за увеличаване на нивата на глобулини, фибриноген, холестерол в кръвта, и да се намали вискозитета на кръвта. Забавянето на седиментацията на еритроцитите е характерно за състояния, придружени от хемоконцентрация, повишаване на съдържанието на албумини и жлъчни киселини.

Хемограмата при пациенти с туберкулоза се променя по време на лечението. Хематологичните смени изчезват по-бързо, толкова по-успешно е терапевтичната намеса. Все пак, трябва да се има предвид ефектът върху хемопоезата на различни антибактериални лекарства. Те често причиняват еозинофилия, в някои случаи - левкоцитоза и по-често левкопения до агранулоцитоза и лимфоидно-ретикуларна реакция. Систематичният хематологичен контрол и правилният анализ на получените данни са от съществено значение за оценяване на клиничното състояние на пациента, динамиката на процеса и ефективността на използваното лечение.

[5], [6], [7], [8], [9],

Клиничен анализ на урината

При туберкулозата на пикочната система анализът на урината е основният лабораторен диагностичен метод. Можете да наблюдавате левкоцитурия, еритроцитурия, протеинурия, хипоизостенурия, туберкулоза микобактериум, неспецифична бактериурия.

Левкоцитурия - най-честият симптом на туберкулоза на отделителната система преди химиотерапия и не е специфично само в изключителни случаи, като например пълен заличаване на лумена на уретера. Тест Nechyporenko (определяне на броя на левкоцитите в 1 мл урина) спомага за по-обективна оценка степен левкоцитурия nefrotuberkuloze на с, и в някои случаи да се идентифицира при нормално урината. Въпреки това, трябва да се има предвид, че левкоцитурия може да се появи при остър и хроничен пиелонефрит, цистит, уретрит, бъбречни и уретерни камъни.

Eritrotsiturii. Както и левкоцитурия. Се считат за един от най-честите лабораторни признаци на туберкулоза на пикочно-половата система. Честотата на хематурията зависи от разпространението на процеса, той се увеличава, тъй като деструктивният туберкулозен процес се развива в бъбреците. Еритроцитурия без левкоцитурия е по-характерна за ранните стадии на бъбречна туберкулоза. Хематурия, която преобладава над левкоцитурия, е важен аргумент в полза на туберкулозата на бъбреците при диференциацията му с неспецифичен пиелонефрит.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Биохимичен кръвен тест

При туберкулозата промените в някои биохимични параметри зависят главно от фазата на процеса, усложненията и различните съпътстващи заболявания. При пациенти с неактивна туберкулоза на белите дробове и други органи, общите протеинови и протеинови фракции на кръвния серум са непроменени и определят тяхното нормално съдържание.

При остри форми на заболяването, както и при обостряне и прогресиране на хроничните форми на туберкулоза, коефициентът на албумин-глобулин намалява.

Съществено при оценката на функционалното състояние на органичен увреждане на черния дроб и в туберкулоза и неговите усложнения е определянето на серумния общ и директен билирубин, AST (ACT), аланин аминотрансфераза (ALT). Динамично определяне на нивото на аминотрансферазите. Билирубин при лечението на туберкулозни пациенти, особено в тежки форми, е задължителен компонент на биохимичното изследване на туберкулозни пациенти и се извършва ежемесечно.

Оценката на функционалното състояние на бъбреците включва определянето на серумния креатинин и изчисляването на скоростта на гломерулна филтрация съгласно формулата Cockcroft-Gault. Изчисляването на скоростта на гломерулна филтрация, използвайки пробата на Reberg, дава по-малко точни резултати.

Основната цел на динамичните биохимични изследвания на пациентите с туберкулоза е да се проследи хода на процеса, навременното откриване на страничните ефекти на лекарствата и адекватната корекция на произтичащите хомеостатични разстройства.

[17], [18], [19]

Прилагане на биохимични методи за изследване при екстрапулмонарна туберкулоза

Най-информативен индикатор е съдържанието на туберкулостеаринова киселина в биологичните течности, но определението му е свързано с технически трудности (необходимостта от газова хроматография и масспектрометрия).

Перспективно измерване на активността на аденозин деаминаза - ензим, определен в течности: синовиална, перикардна, асцитна или спинална. Основните производители на аденозин деаминаза са лимфоцити и моноцити. Определянето на активността на аденозин деаминаза в биологичните флуиди улеснява диагностицирането на туберкулозен синовит, туберкулоза на лимфни възли, туберкулозен менингит, туберкулозен серозит.

Някои биохимични показатели, дължащи се на тяхната неспецифичност, се определят само в биологични течности, близки до фокуса на лезиите. Измерете нивото на показателите в отговор на подкожно или интрадермално инжектиране на туберкулин (обикновено преди и 48 и 72 часа след това). След това, степента на нарастване на нивото на маркера (в%) се изчислява спрямо първоначалното ниво.

Оптимално определяне в урината на активността на органоспецифичен ензим трансманидаза, чийто външен вид се забелязва, когато са засегнати бъбреците от различен характер. Проучването на трансамидиназата е оправдано само при условия на подкожно инжектиране на туберкулин, за да се изостри локалното възпалително процеси. Определете първоначално активността на трансамидина в урината и 24-72 часа след въвеждането на 50 ТЕ туберкулин. Разширяването на ферментацията в два пъти и повече позволява в 82% от случаите да се разграничи активната туберкулоза на бъбреците от обостряне на хроничен пиелонефрит.

При туберкулоза на женски полови органи, концентрациите на хаптоглобин и малонен диадехид в кръвта се определят при условия на провокативен туберкулинов тест. Подкожно инжектираният туберкулин в доза от 50 TE и 72 часа по-късно извърши второ биохимично изследване. В случай на етиология на туберкулозата, степента на повишаване на нивото на хаптоглобин е не по-малко от 28%, а нивото на малондиалдехид е 39% или повече. Определя се също така активността на аденозин деаминаза в перитонеална течност, получена от пространството на Дъглас. Препаратът се преразглежда 72 часа след интрадермалното инжектиране на туберкулин в дози от 0,1 TE и 0,01 TE в прожекцията на вътрешните генитални органи в предната коремна стена. В полза на туберкулозния процес увеличаването на активността на аденозин деаминазата е 10% или повече в сравнение с първоначалната.

Когато се засяга окото, се изследва фокалната реакция, която се появява в окото в отговор на антигенната стимулация. Не е желателно да се развие изразен отговор, придружен от намаляване на зрителните функции. Тъй като оценката на минималното фокусно реакции често са трудно да се препоръча сключването на обективиране е ориентирана успоредно, и от степента на повишение на серумния хаптоглобин, или аденозиндеаминаза.

Всички биохимични изследвания трябва да се извършват заедно с други методи.

[20], [21], [22], [23],

Изследване на системата за коагулация на кръвта

Значение на състоянието на изследвания на системата за съсирване на кръвта на туберкулоза се дължи на присъствието на брой пациенти с белодробна туберкулоза хемоптиза или белодробна хеморагия, както и кръвосъсирване усложнения в хирургичното лечение на туберкулоза. В допълнение, латентният поток на интраваскуларна хемокоагулация, който естествено придружава туберкулозата, засяга хода на заболяването и ефективността на химиотерапията.

При пациенти с белодробна туберкулоза разпространение на ексудативна възпаление компонент на наблюдавания спад на кръвното антикоагулантна активност. При пациенти със слабо разпространение на специфична лезия в белите дробове с преобладаване на продуктивен кръвосъсирване интраваскуларна възпалителен компонент изрази леко. При пациенти с белодробна туберкулоза с хемоптиза и белодробна система кръвоизлив състояние съсирването на кръвта е различна: при пациенти с ниска загуба на кръв при gemoptoe на височина или веднага след прекратяването му има рязко покачване на кръвосъсирването способност поради тежка интензификация на trombinoobrazovaniya като същевременно се поддържа повишено "структурни" съсирване. При пациенти с масивна загуба на кръв наблюдава потенциал намаляване на кръвосъсирването за сметка на намаляване на концентрацията на фибриноген. Действие на фактор XIII, брой на тромбоцитите. В етапа на хирургично лечение при пациенти с ограничени форми на белодробна туберкулоза със значителни нарушения настъпва система хомеостаза. Пациенти с масов процес при изпълнение на pnevmon- или plevropnevmonektomii често развиват DIC, което може да бъде под формата на "втори болестта."

За да се следи състоянието на кръвосъсирването при пациенти с белодробна туберкулоза трябва да се извърши определяне на активираното парциално тромбопластиново време (аРТТ), фибриноген, време на тромбин, протромбиновото индекс и времето на кървене и време на съсирване.

[24], [25], [26], [27], [28]

Хормонални изследвания

Съвременните експериментални и клинични наблюдения показват наличието на промени в хормоналния статус при специфично туберкулозно белодробно възпаление. Доказано е, че коригирането на дисфункция на хипофизата, на надбъбречните жлези, хипофизата, щитовидната системи и панкреаса функция във връзка с терапия анти-TB допринесе за активирането на фиброгенеза и ремонт на специфично възпаление локус.

Функционалното състояние на хипофизата-щитовидната система се съди по съдържанието в кръвния серум на трийодотиронин (T ₃ ), тироксин (T ₄ ), хипофизната тироид-стимулиращ хормон (TSH). Установено е, че субклиничен хипотиреоидизъм се открива в 38-45% от пациентите с белодробна туберкулоза, и най-често се диагностицира с разпространени и фибро-кавернозен процес форми. При същите тези форми повечето драстично намалени нива на двете Т ₃ и Т ₄ и идва дисбаланс на тези хормони под формата на увеличаване на съотношението T ₄ / T _S.

Адренокортикален функция се оценява от нивото на кортизол в кръвния серум, и ендокринната функция на панкреаса - концентрация на имуно-реактивна инсулин. В острата фаза на инфекциозното заболяване нараства нуждата от ендогенен кортизол и инсулин. Хиперинсулинемията също така свидетелства за инсулиновата резистентност на телесните тъкани, която е типична за всеки активен възпалителен процес, по-специално специфичен. Определяне glyukokortiko idnoy-надбъбречната функция с активна белодробна туберкулоза разкрива присъствието на Кушинг при повечето пациенти. Нормални нива на концентрация на кортизол в кръвта на пациента с инфекциозно възпаление на остър период следва да се разглеждат като относителна недостатъчност на глюкокортикоидния функция на надбъбречната кора, която може да служи като основа за поставяне на дозите подходяща заместваща терапия на глюкокортикоиди.

Почти една трета от пациентите с белодробна туберкулоза могат да установят, че нивото на инсулинемия в тях е доста ниско и достига до долната граница на нормата, докато 13-20% наблюдават значителен хиперинсулинизъм. И двата относителни хипо- и хиперинсулинизъм са високи рискови фактори за развитието на нарушения на метаболизма на въглехидратите в различна степен. Тези промени във функционалната активност на В клетките на панкреаса изискват редовно проследяване на гликемията при пациенти с туберкулоза и навременна профилактика на захарен диабет. В допълнение. Това служи като допълнителна обосновка за целесъобразността от използването на физиологични дози инсулин в комплексната терапия на туберкулозата.

Най-общо, по-ниски нива на хормони на щитовидната жлеза и техните дисбаланс хиперкортизолемия и хиперинсулинизъм-голям обхват при пациенти с тежко протичане на туберкулозен процес, с богат увреждане на белите дробове и тежки симптоми на туберкулоза интоксикация.

Микробиологична диагностика на туберкулоза

Необходими са и микробиологични изследвания за идентифициране на пациенти с туберкулоза, проверка на диагноза, наблюдение и корекция на химиотерапия оценка на резултатите от лечението, с други думи, тъй като регистрацията на туберкулоза на пациента, преди да го извадите от Регистъра.

Всички епидемиологични програми и проекти се основават на оценка на броя на бактериалните екскременти, които не могат да бъдат направени без използване на лабораторни методи за откриване на туберкулоза на микобактерии. В проучване на така наречената неорганизирана популация процентът на бактериални нашественици достига 70 или повече, което прави лабораторните методи достатъчно ефективно средство за идентифициране на туберкулозни пациенти сред тази група от населението.

Традиционните микробиологични методи за диагностициране на туберкулозата са бактериоскопични и културни изследвания. Съвременните методи разглеждат отглеждането на mycobacterium tuberculosis в автоматизирани системи, определянето на PCR. Всички тези методи обаче задължително се съчетават с класическите бактериологични методи.

Събиране на диагностичен материал

Ефективността на лабораторните изследвания зависи до голяма степен от качеството на диагностичния материал. Съответствието с правилата за събиране, съхранение и транспортиране на диагностичния материал и точното прилагане на алгоритъма за оценка на пациента влияе пряко върху резултата и осигурява биологична безопасност.

За тестване на туберкулоза се използват различни материали. Поради факта, че TB logkih- най-честата форма туберкулозни лезии, основният материал за изследване помисли храчките и други видове подвижен трахеобронхиални: секрети на горните дихателни пътища, получени след аерозолно вдишване: бронхиални промивки; бронхоалвеоларни изплаквания; материал, получен от бронхоскопия, и интрапулмонарно транстрахеално биопсии от бронхиални аспирати, ларингеални тампони, ексудати от рани и намазки др.

Ефективността на изследванията се увеличава, ако се извършва контролирано събиране на материал от пациент. За тази цел се разпределя специално оборудвана стая или се купуват специални кабини. Събирането на материали е опасна процедура, поради което е необходимо да се съберат материали за изследване, спазвайки правилата за инфекциозна безопасност.

Материалът за тестване върху mycobacterium tuberculosis се събира в стерилни бутилки с плътно завити капачки, за да се предотврати замърсяването на околната среда и да се предпази събраният материал от замърсяване.

Флаконите за събиране на диагностичен материал трябва да отговарят на следните изисквания:

• трябва да бъдат направени от устойчив на удар материал;
• лесно се разтапя по време на автоклавирането;
• да има достатъчно количество (40-50 ml):
• имат широк отвор за събиране на храчки (диаметър не по-малък от 30 mm);
• да бъде лесна за работа, прозрачна или полупрозрачна, за да можете да оцените количеството и качеството на събраните проби, без да отваряте капака.

За постигане на оптимални резултати от изследването трябва да се спазват следните условия:

• Съберете материала преди началото на химиотерапията;
• материалът за изследването трябва да бъде събран преди сутрешното приемане на храна и лекарства;
• за изследвания е желателно да се съберат най-малко 3 проби от сутрешната храчка. Съберете слюнката в продължение на 3 последователни дни;
• събраният материал трябва да бъде доставен в лабораторията възможно най-скоро:
• в случаите, когато е непосредствено невъзможно да се достави материалът в лабораторията, той се съхранява в хладилник при температура на въздуха 4 ° C в продължение на не повече от 48 часа;
• При транспортиране на материала е необходимо внимателно да се следи целостта на флаконите.

Правилно събраните храчки са мукозни или мукопурулентни. Оптималният обем на изследваната храчка е 3-5 ml.

Слюнката се събира под наблюдението на медицински специалист. Лицата, отговорни за събирането на храчки, следва да следват прилагането на определени правила:

• е необходимо да се обяснят на пациента целта на проучването и необходимостта да се кашли не слюнката или назофарингеалната слуз, а съдържанието на дълбоките дихателни пътища. Това може да бъде постигнато в резултат на продуктивна кашлица, която настъпва след няколко (2-3) дълбоки вдишвания. Необходимо е също така да се предупреди пациентът, че трябва да изплакне устата си с преварена вода, за да отстрани основната част от микрофлората, която расте в устната кухина, и хранителни остатъци, които пречат на изследването на храчките;
• медицински работник, участващ в събирането на храчки, в допълнение към хавлия и шапка, трябва да носи маска, гумени ръкавици и гумена престилка;
• застанал зад пациента, се препоръчва бутилката да се пази възможно най-близо до устните му и незабавно да се отдели в него храчки и да се осигури, че въздушният поток е насочен далеч от здравния работник:
• При завършване на събирането на храчки, здравният работник трябва внимателно да затвори флакона с капак и да оцени количеството и качеството на храчката, събрани. След това бутилката се етикетира и поставя в специална опаковка за транспортиране до лабораторията.

Ако пациентът не произвежда храчки, в нощта преди и рано сутринта в деня на събиране на материала е необходимо да му даде отхрачващо :. Екстракт от корените на бяла ружа (mukaltin), бромхексин амброксолът и т.н. - или да приложите дразнещо вдишване помощта на апаратура, инсталирана в стаята, за да се съберат храчки. Така събраните материали не е предмет на опазване и трябва да се разглежда в деня на събиране. За да се избегне неговото "отхвърляне" в лабораторията в посока, трябва да се дава специална маркировка.

Ако в това съоръжение не се извършват микробиологични изследвания, събраният диагностичен материал трябва да се доставя централно в лабораторията, при условие че материалът се съхранява през интервалите между доставките в хладилника или с консерванти. Доставяйте материали в лабораторията в транспортни кутии, които могат лесно да бъдат дезинфекцирани. Всяка проба трябва да бъде снабдена с подходящ етикет, а цялата партида трябва да бъде попълнена с придружаващ формуляр.

[29], [30], [31],

Режими и честота на изследване на пациентите

При първоначалното, така нареченото диагностично изследване на пациента за туберкулоза е необходимо да се изследват най-малко 3 части на храчката в продължение на 2 или 3 дни. Събрани под наблюдението на медицинския персонал, което увеличава ефективността на микроскопията.

Първичният скрининг за туберкулоза трябва да се извършва от всички медицински диагностични институции в системата на здравеопазването. Напоследък бяха организирани така наречените центрове за микроскопия, оборудвани със съвременни микроскопи и оборудване за епидемична безопасност, на базата на клинични диагностични лаборатории за подобряване на ефективността на първоначалния преглед.

При обекти против туберкулоза се използва скринингов тест, който включва преглед на храчки или друг диагностичен материал най-малко три пъти за 3 дни. По време на лечението микробиологичните изследвания се провеждат редовно поне веднъж месечно по време на интензивната фаза на химиотерапия. При прехода към фазата на лечение проучванията се провеждат по-рядко - с интервал от 2-3 месеца, докато честотата на проучването е намалена до две.

Характеристики на колекцията от диагностичен материал за екстрапулмонарна туберкулоза

Фокус патологичен материал с извънбелодробни форми на туберкулоза - Mycobacterium туберкулоза ниска концентрация в него, което изисква по-чувствителни методи за микробиологични изследвания, предимно за посяване техники среда.

При туберкулозата на пикочно-половата система урината е най-достъпният учебен материал. Събирането на урина трябва да се извършва от специално обучена медицинска сестра.

Външните гениталии се измиват с вода със сапун или слаб разтвор на калиев перманганат. Външното отваряне на уретрата се третира внимателно. В стерилен флакон се събира средна част от утринната урина: при мъжете естествено при жените се използва катетър. Урината от бъбречния таз е събрана в стерилни епруветки с катетеризация на един или два бъбрека, в последния случай - задължително отделно от всеки бъбрек. Малко количество от тази урина се центрофугира, утайката се изследва.

При мъжете, спермата, точковите тестиси, тайната на простатата се подлага на центрофугиране, за да се получи утайка. При всяка локализация на специфичен процес в гениталната област при мъжете, простатната масаж може да стимулира отделянето на секрети, съдържащи микобактериум туберкулоза.

Менструалната кръв при жените се събира чрез смучене или с капачка на Кафка. Полученият материал се освобождава от червените кръвни телца, измива се с дестилирана вода, последвано от центрофугиране. Утайката се изследва.

Разпределенията от цервикалния канал на матката се събират в някакъв капацитет или капачка на Кафка, т.е. Желателно е да се натрупат 1-2 ml патологичен материал.

Материал, получен от оперативни интервенции на бъбреците, гениталиите. С биопсии, отстраняване от ендометриума, хомогенизиране. За да направите това, тя се поставя в стерилен хоросан и се раздробява със стерилни ножици. Към тази суспензия се добавя стерилно речен пясък в количество, равно на теглото си и след това покрити с 0,5-1.0 мл изотоничен разтвор на натриев хлорид, и всичко се стрива до маса пастообразна с добавянето на изотоничен разтвор на натриев хлорид (4-5 мл). След това масата се оставя да се утаи за 1-1.5 минути, супернатантът се изследва.

Туберкулоза на костите и ставите. Точковият (гной на абсцеси), получен със стерилна спринцовка, се поставя в стерилни чинии и веднага се доставя в лабораторията. Стерилната пипета, предварително навлажнена със стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид, приема 2-5 ml гной, прехвърля се в бутилка с перли и се добавят още 2-3 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид. Бутилката се затваря с корк и се разклаща в шега-апарат за 8-10 минути. Разглежда се хомогенизираната суспензия.

При фистулни форми на остеоартикуларна туберкулоза се прави гной от фистулата. Широкото изхвърляне се събира директно в епруветка. В случаите, постно пиорея фистула промива със стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид и промивните води се събират в епруветка, или част от тампон импрегнирани с гной изпратени за анализ.

Хирургически материал, получен по време на операция на костите и ставите може да се състои от гнойни-некротичен маси, гранулати, белег, синовиалните мембрани костна тъкан и други субстрати. Неговото лечение се извършва, както при туберкулозата на бъбреците.

Микробиологичното изследване на синовиалната течност в 3% разтвор на натриев цитрат (съотношение 1: 1) за предотвратяване на коагулацията се извършва веднага след пункцията.

Туберкулоза на лимфните възли. Изследва се и гнила, извлечена по време на пункцията на лимфните възли. Като гной на абсцесите. Изследвани са тъканите на лимфните възли, получени по време на хирургични интервенции, биопсии, както при други форми на туберкулоза.

Изследването на масите на изпражненията върху mycobacterium tuberculosis е изключително рядко, поради почти пълната липса на положителни резултати.

[32], [33], [34], [35], [36],

Микроскопия микобактерий

Микроскопията на храчките е сравнително бърз, лесен и евтин метод, който трябва да се използва във всички случаи със съмнение за туберкулоза. В допълнение, това проучване се провежда, за да се оцени ефективността на химиотерапията и да се установи възстановяването или неуспеха на лечението, ако няма тест за култура.

Използват се два метода за микроскопско изследване:

• метод на директна микроскопия, когато се приготвя смазка директно от диагностичния материал;
• метод за микроскопия на седимент, приготвен от материал, третиран с дезактивиращо средство за култивиране.

Първият метод се използва в лабораториите, където се извършват само микроскопски изследвания (клинични и диагностични лаборатории от общата медицинска мрежа).

Най-добрите резултати от микроскопското изследване се получават чрез концентриране на диагностичния материал (например чрез центрофугиране).

За откриване на микобактериум туберкулоза с вероятност от 50% при извършване на микроскопията, 1 ml от храчките трябва да съдържа повече от 5000 микробни клетки. Храчките на пациенти с белодробни форми на туберкулоза обикновено съдържат значително количество кисело-бързи бактерии, което им позволява да бъдат надеждно открити чрез бактериоскопия. Диагностичната чувствителност на този метод може да бъде подобрена чрез изследване на няколко проби на храчката от един пациент. Негативният резултат от бактериоскопския преглед не изключва диагнозата туберкулоза, тъй като храчките на някои пациенти съдържат по-малко микобактерии, отколкото могат да бъдат открити с микроскопия. Лошата подготовка на слюнката на храчките може също да доведе до отрицателен резултат от бактериоскопския преглед.

Най-разпространеният метод за откриване на киселинно-бързи микобактерии в оцветяването е цвета според Tsiol-Nelsen. Методът се основава на проникването на карболичен фуксин в микробна клетка през мембрана, която включва восъкоподобен липиден слой, като същевременно се загрява и силно ецва действието на фенола. Следващото обезцветяване на смолата с 25% разтвор на сярна киселина или 3% солна киселина води до промяна в цвета на всички неактивни структури. Оцветените с обезцветени елементи на оцветяването се оцветяват с 0,3% разтвор на метиленово синьо. Mycobacteria не вземат обикновени анилинови бои, в резултат на киселина бацили са оцветени червено-червено, и други микроби и клетъчни елементи - в синьо.

За намазки оцветяват с Ziehl-Nelsenu използва светлина бинокулярен микроскоп с масло потапяне леща (90- или 100-кратно увеличение) и окуляра на увеличение 7- или 10-кратно. Разгледайте 100 полета на зрението, което е достатъчно, за да идентифицирате единичните микобактерии в смазката. В случай, че резултатът от това изследване е отрицателен, за потвърждение се препоръчва да видите още 200 зрителни полета. Запишете резултатите, като посочите броя на откритите киселинно-бързи бацили (KUM).

В допълнение към тази техника цветните флуорохроми се използват за луминисцентна микроскопия, което позволява постигането на най-добри резултати. Използването на този метод увеличава ефективността на микроскопията с 10-15%. При обработка mikobak Theurillat-флуоресцентни багрила (ауламин, родамин, и т.н.), тези вещества също се свързват към восъкоподобни структури на микробни клетки. При облъчване на оцветените клетки, стимулиращи светлинен източник (специфичен спектър на ултравиолетова радиация), те започват да светят оранжево или ярко червено на черен или тъмен зелен фон. Във връзка с висока яркост и контраст на видимия образ може да намали Общото увеличение на микроскоп 4-10 пъти, в сравнение с разширената зрителното поле и намаляване на времето за подготовка гледане. Заедно с това, благодарение на много по-голяма дълбочина на полето, можете да увеличите комфорта на изследването.

Когато се използва флуоресцентна микроскопия за сканиране на една и съща област, петна изразходва значително по-малко време от светлинния микроскоп на оцветяването на Tsiol-Nelsen. Ако за един работен ден микроскопът разглежда около 20-25 такива петна, а след това с помощта на флуоресцентна микроскопия, той може да изследва повече от 60-80 проби по едно и също време. Опитните микроскописти знаят, че оцветяването на клетките със смес от аурамин и родамин е по някакъв начин специфична за киселинно бързи бацили, които в този случай приличат на златни пръчки. Сапрофитите са боядисани в зеленикав цвят.

Друго важно предимство на метода на флуоресцентна микроскопия - възможността за откриване променена Mycobacterium, губи под влиянието на неблагоприятни фактори, включително интензивна химиотерапия, kislotousotoychivosti собственост и не се открива във връзка с това оцветяване Ziehl-Nelsenu.

Недостатъците на метода на флуоресцентната микроскопия са относително високата цена на микроскопа и неговата работа. Въпреки това, в централизирани или други големи лаборатории, където товарът надвишава нормата на 3 лабораторни техници, работещи с три конвенционални микроскопа, е по-евтино да се използва един флуоресцентен микроскоп.

Бактериоскопските методи имат доста висока специфичност (89-100%). Около 97% от положителните резултати, получени по всеки метод на микроскопия, се потвърждават недвусмислено от резултатите от сеитбата.

Трябва да се отбележи, че в микроскопско изследване на петна на патологична материал не може да установи вида на киселина бацили засича. Метод микроскопия позволява да даде становище само на присъствието или отсъствието на киселина в получаването на микроорганизми, което може да бъде обяснено с наличието в природата на голям брой морфологично подобни на туберкулоза Mycobacteria сложни nontubercular киселина резистентни микроорганизми.

Резултатите от микроскопията се оценяват в полуколичествени единици.

За да могат да се сравнят резултатите от различните методи на микроскопия, се въвеждат емпирични коефициенти. Например, за да се сравнят резултатите от намазки оцветяват с флуоресцентни багрила, изследвания данни светлина микроскоп (1000 пъти увеличение), е необходимо да се разделят на броя на киселина бацили открива чрез флуоресцентен микроскоп, съответния коефициент при 250-кратно увеличение - до 10, 450 пъти - до 4, с 630 пъти - до 2.

Характеристики на микроскопията за екстрапулмонарна туберкулоза

Извършва се директна микроскопия, както и микроскопията на петна, приготвени след обогатяване, последвани от оцветяване с Tsiol-Nelsen или луминисцентни багрила. Директната микроскопия на намазките е неефективна поради ниската концентрация на микобактерии в материала и поради това е по-разумно да се използват методи за обогатяване. Най-ефективно е центрофугирането. Ако биологичният материал е вискозен, центрофугиране се прилага едновременно с втечняване и хомогенизиране на материала, който се провежда, използвайки високоскоростни центрофуги с центробежна сила от 3000 г и хипохлорит решения. Други методи за обогатяване, като микро флотация, понастоящем не се използват поради образуването на биологично опасни аерозоли.

[37], [38],

Културният метод за диагностициране на туберкулозата

Методът на сеитба или методът на култивиране е по-чувствителен от смазочната микроскопия и има редица предимства пред последната. Тя позволява откриването на няколко десетки жизнеспособни микобактерии в изследваните материали и има голяма диагностична стойност. Това е особено важно при изследване на материала от ново диагностицирани или лекувани пациенти, които отделят малко количество микобактерии.

В сравнение с микроскопия, културата може да се увеличи броят на откритите случаи на туберкулоза с повече от 15-25%, както и проверка на туберкулоза в по-ранните етапи, когато заболяването е все още реагира добре на лечението. Много важно предимство на теста за култура е възможността да се получи култура на възбуда, която може да бъде идентифицирана и изследвана по отношение на чувствителността към лекарството, вирулентността и други биологични свойства.

Недостатъците на методите на отглеждане включват тяхната продължителност (времето на изчакване на материалите достига 10 седмици). По-високи разходи, сложност при обработката на диагностичния материал.

Принципи на предварителното лечение на диагностичния материал

Конвенционалните микробиологични методи не могат да се използват при провеждането на изследвания за туберкулоза. Това се дължи на факта. Че микобактериум туберкулоза расте много бавно и повечето клинични проби съдържат бързо развиващи се пиогенни и гнилостни микроорганизми, гъбички. Техният бърз растеж върху богати хранителни среди пречи на развитието на микобактерии и не позволява изолиране на причинителя на туберкулоза, така че диагностичният материал трябва да бъде предварително обработен преди засяването. В допълнение, микобактерията, освободена от дихателните пътища на пациента, обикновено е заобиколена от голямо количество слуз, което затруднява концентрацията. В тази връзка, преди засаждането на храчки и други подобни материали, тяхното втечняване, е необходимо обеззаразяване.

Всички детергенти и деконтамини имат повече или по-малко изразен токсичен ефект върху микобактериите. В резултат на обработката до 90% от микобактериите могат да умрат. За да се запази достатъчно от микобактериална населението, съхраняващи необходимостта да се използват техники за обработка, които позволяват, от една страна, за подтискане на бързо растящи пиогенни бактерии и гниещи, и от друга - да се запази жизнеспособността на микобактерии, налични в материала.

В зависимост от материала, неговата степен на хомогенност и замърсяване за предварителна обработка, използвайки различни обеззаразител: слюнка - 4% разтвор на натриев хидроксид, разтвори trohzameschonnogo натриев фосфат 10%, бензалкониев хлорид, тринатриев фосфат, NALC-NaOH (N-ацетил-Ь-цистеин натриев хидроксид) при крайна концентрация от 1% NaOH, в урината и други течни материали - разтвор на сярна киселина 3%, за замърсени проби, мазнини, съдържащ материали - разтвор на оксалова киселина до 5%. В допълнение, в някои случаи се използват ензими, повърхностноактивни вещества (детергенти). Приложение Tween детергенти и някои други микобактериални смърт е придружен от по-малко клетки (40-50% оцелее). Те обаче могат да се използват само за течни материали. Най-голямото разпространение в света е NALC-NaOH. Произведени в комплекти. Този метод позволява да се разпределят повече от 85% от популацията на микобактериални клетки. Обеззаразяване tkanesoderzhaschih твърди трудно да предполагам, тъй като степента на дисперсия на материала по време на хомогенизиране трудно. Например, лечението на биопсия на лимфните възли често е придружено от повишена честота на замърсяване от външна флора. В този случай може да се използва 1% етоний.

Нехомогенният материал се хомогенизира със стъклени перли в присъствието на дезактиватори. Течните материали се пре-центрофугират и се обработва само утайка.

Техника на сеитба и инкубация

След предварителната обработка материалът се центрофугира, като по този начин се утаяват микобактериите и се увеличава тяхното съдържание в утайката ("обогатяване на утайката"). Получената утайка се неутрализира и инокулира (инокулира) с гъста хранителна среда или епруветки с течна (полуликвидна) среда. От останалата част от утайката се приготвят петна за микроскопско изследване. Техниката на засяване трябва да предотвратява кръстосаното замърсяване на диагностичния материал.

За надеждно клинично тълкуване на резултатите от микробиологично изследване трябва да се спазва следното правило: изследвания на микроскопични и културни изследвания трябва да се извършат паралелно от същата проба от диагностичния материал.

Инокулираните тръби се поставят в термостат при 37 ^° С в продължение на 2 дни в хоризонтално положение. Това осигурява по-равномерно абсорбиране на материала в хранителната среда. След 2 дни епруветките се прехвърлят във вертикално положение и се затварят херметически с гумени или силиконови щепсели, за да се предотврати изсушаването на засетите носители.

Култури се инкубират при 37 ^за С в продължение на 10-12 седмици, с редовна седмична гледане. За всяка визуализация се записват следните параметри:

• периодът, наблюдаван визуално от деня на засяване;
• темп на растеж (брой CFU);
• замърсяване на културата с външна микробна флора или гъбички (такива тръби се отстраняват);
• липса на видим растеж. Тръбите са оставени в термостата до следващото гледане.

Хранителни среди

Различни хранителни среди се използват за отглеждане на микобактерии; гъста, полутечна, течна. Обаче, никоя от известните хранителни среди няма свойства, които да гарантират растежа на всички микобактериални клетки. Във връзка с това се препоръчват 2-3 хранителни среди от различен състав, които да се използват едновременно за повишаване на ефективността.

СЗО препоръчва средата Levenstein-Jensen като стандартна среда за първична изолация на причинителя на туберкулозата и за определяне на неговата чувствителност към лекарства. Това е гъста среда на яйцеклетка, на която растежът на микобактериите се получава на 20-ия и 25-ия ден след засяването на бактериоскопски положителен материал. Културите от бактериоскопски отрицателен материал изискват по-дълъг инкубационен период (до 10-12 седмици).

В нашата страна, предложените E.R. Фин яйчна среда Finn-II. Тя се различава в това, че вместо L-аспарагин, той използва натриев глутамат, който задейства други начини за синтезиране на аминокиселините на микобактериите. Растежът се появява на тази среда малко по-рано и честотата на разпределение на микобактериите е 6-8% по-висока отколкото в средата на Lowenstein-Jensen.

За да се подобри ефективността на бактериологичната диагностика на екстрапулмонарна туберкулоза, препоръчително е да се включат модифицирани Finn-II среди в комплекса хранителни среди. За да се ускори растежа, към хранителната среда на Finn-II допълнително се добавя натриев тиогликолат 0.05%, който намалява концентрацията на кислород. За защита на ензима от Mycobacterium системи токсични продукти на липидната пероксидация в хранителна среда Finn-II прилага антиоксидант α-токоферол ацетат в концентрация от 0.001 мкг / мл. Засаждането на диагностичния материал се извършва съгласно стандартна процедура.

В руските лаборатории за борба с туберкулозата се използват други модификации на гъсти хранителни среди; предложи G.G. Mordovian хранителна среда "New", разработена от V.A. Анични хранителни среди А-6 и А-9 и др.

Поради факта, че в процеса на химиотерапия е увреждане на различни метаболитни системи на микробни клетки, някои микобактериална население губи способността да се развиват нормално в конвенционална хранителна среда и изисква осмотично балансиран (или полутечни) културална среда.

Оценка и записване на резултатите от засяването на диагностичния материал

Някои щамове и видове микобактерии растат бавно, растежът може да се появи дори до 90-ия ден. Броят на такива култури е малък, но това прави възможно издръжливостта на културите в термостат за 2,5-3 месеца.

Вирулентните култури на Mycobacterium tuberculosis обикновено растат в гъста яйчна среда под формата на R-образни колонии от различни размери и видове. Колониите са сухи, набръчкани, слонова кост, леко пигментирани. В други среди колонията на mycobacterium tuberculosis може да бъде по-влажна. След курс на химиотерапия или по време на лечението могат да се разпределят гладки колонии с влажен растеж (S-форми).

При разпределяне на култури, като се използва набор от специални изследвания за разграничаване Mycobacterium туберкулоза от Mycobacterium nontubercular и киселинни сапрофити.

Положителен отговор се дава след задължително микроскопско изследване на оцветената цито-нелсен смазка от отглежданите колонии. В случай на растеж на микобактерии в намазка откриване ярко червени пръчки, разположени поединично или в групи, образуващи натрупвания под формата на филц или оплетка. При млади култури, по-специално изолирани от дългосрочно лечение на пациенти с химиотерапия, микобактерии различават експресирания полиморфизъм, докато присъствието на прътовидния, заедно с къси, почти coccoid или продълговати версии, които приличат на мицел.

Скоростта на растеж на микобактериите е показана със следната схема: (+) - 1-20 cfu in vitro (слаба бактериална екскреция); (++) - 20-100 CFU in vitro (умерена бактериална екскреция); (+++) -> 100 CFU in vitro (изобилна бактериална екскреция). При лабораторната диагноза на туберкулозата не е достатъчно да се отговори дали микобактериумът се открива по един или друг начин. Да имат подробно разбиране за степента и естеството на микобактериалната популация, нейния състав и свойства. Тези данни ни позволяват правилно да интерпретираме състоянието на процеса, да планираме тактиката и да коригираме своевременно лечението.

През последните години бяха предложени хранителни среди на базата на агар с различни добавки за растеж и използването на специална газова смес, за да се ускори растежа на микобактериите. За да се получи растеж на микобактерии върху тези среди, по време на култивирането се създава атмосфера с високо съдържание на въглероден диоксид (4-7%). За тази цел се използват специални CO ₂ инкубатор. Най-развитите автоматизирани системи за култивиране на микобактерии: MGIT-BACTEC-960 и MB / Bact.

Една такава система - MGIT система (растеж микобактерии показва тръба), което се отнася до развитието на високите технологии и е предназначен за бързо бактериологично диагностика на туберкулоза и Mycobacterium чувствителност към първа линия лекарства, както и някои от втора линия лекарства. MGIT е насочена към използването му като част от устройството VASTES-960. Микроорганизмите се култивират в специални епруветки с течна хранителна среда, базирана на модифицираната среда Middlebrook-7H9. За стимулиране на растежа на микобактериите и потискане на растежа на външната микрофлора, се използва MGIT растежен добавка и смес от PANTA антибактериални лекарства.

Растежът на микроорганизми се записва оптически. Той се основава на флуоресценция, която се получава, когато кислородът се консумира от микобактерии по време на растежа. Киселинно-flyuorohromny багрило, съдържащо се в долната част на специални епруветки и се покрива със слой от силикон. Възпроизвеждането микобактерии води до намаляване в количество кислород в тръбата и намаляване на концентрацията, която причинява повишаване на флуоресценцията, която става видимо при облъчване с ултравиолетова светлина тръби и автоматично регистриран фоточувствителен вграден уред VASTES-960. Интензитетът на луминисценцията се записва в единици на растеж (единици за растеж на GU). Данните за растежа се записват в компютъра, където могат да бъдат запазени автоматично. Компютърен анализ на кривите на растежа може да предостави информация за наличието на голямо разнообразие от микобактериални басейни, включително nontubercular, а също така помага да се оцени качествата на растеж на микобактерии.

В резултат от времето на появата на такива системи микобактериална растеж е значително намален, средно 11 дни VASTES-960 и 19 дни на MB / Bact до 33 дни на стандартната твърда хранителна среда. Трябва да се отбележи, че тези системи изискват висококвалифициран персонал. Посевния материал за течни носители ще бъде придружен от засяването на Lowenstein-Jensen среда, играе ролята на дубльор в случаи, когато други носители на Mycobacterium туберкулоза не позволяват растеж.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Определяне на лекарствената чувствителност на микобактериите

Определяне на обхвата и степента на чувствителност на микобактерии за анти-TB лекарства има важни клинични последици, както и епидемиологично Оценка на резистентна туберкулоза. В допълнение, мониторинг на лекарствена резистентност ви позволява да се оцени ефективността на програма за борба с туберкулозата като цяло, като неразделна показател за работата на всички компоненти на контрола на туберкулозата дейности.

Множество и синхронизиране на чувствителността към лекарството:

• преди началото на лечението веднъж за определяне на стратегията и тактиката на лечението:
• когато са изолирани от болни култури от различни материали (храчка, течност BAL, урина, ексудати, течност и др.), всички изолирани щамове се изследват:
• в края на интензивната фаза на лечение при отсъствие на клинична и радиологична динамика:
• ако е необходимо да се промени схемата на лечение в следните случаи:
  • липса на слюнка на храчки;
  • повторно изолиране на културата след отрицателна хрема;
  • драстично увеличение на броя на CMU в тампона след първоначалния спад. Известно е, че щамовете на mycobacterium tuberculosis, които са хетерогенни по отношение на чувствителността към лекарството, са изолирани от материала от пациент с туберкулоза. Чувствителността на щамовете към лекарствата против туберкулоза може да се различава в спектъра на лекарствата, степента, честотата и степента на възникване на резистентност.

Степента на лекарствена резистентност на Mycobacterium туберкулоза се определя в съответствие с установените критерии, които са насочени към клиничната значимост и стабилност зависи от активността на анти-TB наркотици, фармакокинетиката, концентрацията в лезията. Максималната терапевтична доза и т.н.

Определянето на лекарствената чувствителност на микобактериите понастоящем се извършва чрез микробиологични методи:

• Абсолютните концентрации (метод на разреждане върху гъста или течна хранителна среда),
• пропорции,
• коефициент на съпротивление.

Обикновено стабилност се проявява като визуално наблюдавана растеж колония на Mycobacterium туберкулоза, но има техники, които индуцират ранните етапи на растеж в делящи се клетки на Mycobacterium под формата на цветна реакция. Тези методи съкращат времето за тестване от 3-4 до 2 седмици.

Както обединени в Русия е бил удължен, препоръчани от метода на химиотерапия в комитета, който на абсолютните концентрации, което е от методологична гледна точка, най-просто, но изисква висока точност и стандартизация на лабораторни процедури. Тестът за чувствителност към лекарства се състои от набор от епруветки с хранителна среда, модифицирана с анти-ТВ лекарства. Комплектът се състои от 2-3 тръби с различни концентрации на всеки от лекарства, използвани, един контролни тръби без лекарство за околната среда и една епруветка, съдържаща 1000 мкг / мл натриев Sali tsilovokislogo или 500 мкг / мл paranitrobenzoynoy киселина nontubercular за откриване на растеж на микобактерии.

За да се приготви комплект от среди с препарати, се използва модифицирана среда на Levenstein-Jensen (без нишесте), която се излива в колби. Във всяка от колбите се добавя специфичен обем подходящо разреждане на антитуберкулозния препарат. Съдържанието на колбите се размесва добре, излива се в епруветки и се сгъва наклонено в продължение на 40 минути при температура 85 ° С. Препоръчва се бобината да се навива в електрически пренавивач с автоматично регулиране на температурата. Сряда с лекарства против туберкулоза

Едната серия може да се съхранява в хладилник при 2-4 ° C в продължение на 1 месец, като препаратите от втория ред - не повече от 2 седмици. Съхранението на средата с препарати при стайна температура е неприемливо. При приготвянето на разтвори на лекарства против туберкулоза се взема предвид тяхната активност, като се изчислява концентрацията, коригирана за молекулното тегло на неспецифичната част на препарата, чистотата и т.н. За да се определи лекарствената чувствителност, се използват само химически чисти вещества.

Принципът на метода е да се определи концентрацията на антитуберкулозно лекарство, което инхибира растежа на значителна част от микобактериалната популация. Ако е направено правилно, този метод има добра надеждност.

Преди теста е необходимо да се увери, че изолираната култура на mycobacterium tuberculosis няма външна микрофлора. От културата на микобактерии в 0.9% разтвор на натриев хлорид се приготвя хомогенна суспензия, съдържаща 500 милиона микробни тела на милилитър (оптичен мътност стандарт от 5 единици). Получената суспензия се разрежда с 0.9% разтвор на натриев хлорид (1:10) и към всяка епруветка от комплекта културална среда се добавят 0.2 ml суспензия. Заразените Епруветките се поставят в инкубатор при 37 ° С и се поддържа в хоризонтално положение в продължение на 2-3 дни, за да се равномерно инокулира със суспензия от Mycobacterium туберкулоза на скосен повърхността на средата. Епруветките след това се прехвърлят във вертикално положение и се инкубират в продължение на 3-4 седмици. Резултатите се записват след 3-4 седмици.

Тъй като времето на освобождаване на агента от клиничен материал за хранителни среди представлява поне 1-1,5 месеца чувствителност лекарство могат да бъдат получени по този метод, е не по-рано, отколкото след 2-2,5 месеца след посяване материал. Това е един от основните недостатъци на метода.

Интерпретирайте резултатите от определянето на чувствителността на микобактериите към лекарството въз основа на определени критерии. На твърда среда култура се счита чувствителни към концентрацията на лекарството, която се съдържа в средата, ако броят на колониите от микобактерии, отгледани ин витро с това лекарство не повече от 20 е с изобилен растеж в контролната тръба без лекарства. Само в присъствието на повече от 20 колонии, културата се счита за устойчива към тази концентрация. На практика, когато се получават растежни резултати в епруветки близки до 20 cfu. Е необходимо да се уведоми клиничната единица, че чувствителността или съпротивлението в този случай са гранични, тъй като понякога тя може да обясни размитата динамика на клиничните показатели.

За различни лекарства се установява определена концентрация, при която се наблюдава възпроизводството на критичния дял на микобактериалната популация. Тези концентрации се наричат "критични". Като критерий за стабилност се използва растежа на популацията от микобактерии върху хранителна среда с препарат при критична концентрация.

При практиката на домашна туберкулоза при определяне на лекарствената резистентност те не се ограничават до определяне само на критични концентрации. Това се дължи на факта. Че нивото на удължено определение на лекарствена резистентност позволява на клинициста за по-точно позициониране тактика на химиотерапията използване на знания за усилване действието на лекарствени комбинации, кръстосват очаква резистентност или да прилага група по-ефективни лекарства, използвани анти-TB лекарства.

Методът на абсолютната концентрация е най-простият, но също така е най-чувствителен към грешките, които се правят, когато се извършва. По-надеждни, особено при определянето на чувствителността към вторите медикаменти и общата извън Русия е методът на пропорциите. Той взема предвид недостатъците на метода на абсолютната концентрация, но при изпълнение е по-труден.

Методът е много подобен на метода на абсолютната концентрация. Подготовката на епруветките с лекарства се извършва по същия начин. Както при метода на абсолютната концентрация. Дозата за семената на суспензията от Mycobacterium tuberculosis обаче се намалява с коефициент 10. Който елиминира честотата на спонтанна устойчивост на някои щамове на Mycobacterium туберкулоза лекарства, такива като етамбутол, prothionamide, капреомицин. Като контрола се използват 2 или 3 епруветки с доза за семе, равна на епруветките, последователно разредени 10 и 100 пъти. Критерият за стабилност е делът на визуално наблюдавания растеж на mycobacterium tuberculosis. За лекарства критерий първия стабилност линия е превишаването на растеж 1% от първоначалната популация за съставите от втора серия - увеличение на един или повече от 10% от първоначалната, в зависимост от избрания критичната концентрация.

През 1997 г. Работна група на Световната здравна организация и Международния съюз за установяване на добра туберкулоза TB лекарствена резистентност е направила корекции на тези критерии, като предлага доказана резистентност микобактерии, които растат върху твърда яйце медии Lowenstein-Jensen при следните концентрации:

• дихидрострептомицин - 4 μg / ml;
• изониазид 0,2 μg / ml:
• рифампицин 40 μg / ml:
• Етамбутол - 2 μg / ml.

През 2001 г. Бяха предложени критични концентрации за следните лекарства от втора линия (за критичен дял от 1%):

• капреомицин - 40 mcg / ml;
• протионамид - 40 мкг / мл;
• канамицин - 30 ug / ml;
• виомицин - 30 mcg / ml;
• циклосерин 40 ug / ml;
• аминосалицилова киселина - 0,5 μg / ml;
• олоксацин - 2 μg / ml.

Резултатите от растежа се оценяват след 4 седмици като предварителна и след 6 седмици култивиране - като последната.

За да се определи чувствителността на лекарството към пиразинамид, който се използва широко в съвременната химиотерапия за туберкулоза, препоръчителната критична концентрация е 200 μg / ml. Въпреки това, все още не съществува общоприет метод за определяне на устойчивостта на това лекарство върху твърда среда хранителен поради неговата антибактериална активност се проявява само в кисела среда (рН <6), който е технически трудно да се поддържа. В допълнение, много клинични култури от туберкулоза на микобактерии неохотно растат на яйчна среда с кисела среда.

За да се оцени качеството на резултатите от изследване за чувствителност на лекарство от Mycobacterium, препоръчва всяка нова партида среда LJ контролира паралелно определяне на чувствителността на стандартната музей щам H37Rv. Освен това има определени микробиологични критерии, които трябва да се поддържат, така че техниките дават добре възпроизводим и правилно тълкуван резултат. Те включват жизнеспособността на културата на Mycobacterium туберкулоза, правилата за получаване на хомогенна суспензия и суспензионни култури на правилата за подбор на Mycobacterium туберкулоза, представителност на избрания бактериална маса. Надеждността на определянето на лекарствената резистентност намалява с изключително оскъдно бактериално освобождаване.

Напоследък е смятан за обещаващ метод за определяне на чувствителността към лекарства чрез използване на автоматизирани системи. Най-съвършените в тази област са разработките, базирани на VASTES MGIT-960. В този случай, чувствителността на микобактериум туберкулоза спрямо лекарството се определя въз основа на модифициран метод на пропорции. В процеса на определяне, се сравнява скоростта на растеж на mycobacterium tuberculosis в контролна тръба и в епруветки с лекарства. За определяне на чувствителността към стрептомицин, изониазид, рифамппин и етамбутол, добавки за обогатяване и антибиотици, включени в комплекта SIRE, се използват. За да се определи чувствителността към пиразинамид, използвайте комплекта PZA. В хода на окачването тест Mycobacterium туберкулоза инокулира епруветки с лекарства, както и за контрол на тръби с приготвената суспензия 100 пъти за всички лекарства с изключение на пиразинамид, която суспензия е разреждане на 10 пъти. Критерият за стабилност е индикаторът за растеж на микобактериите от 100 GU, когато растежът се постига в контролната тръба 400 GU (виж "Методи за култивиране за изолиране на микобактерии"). Счетоводството и интерпретирането на резултатите се извършват автоматично и се задават от входа или от избраната програма.

Като критични концентрации, крайните концентрации се използват в епруветка с течна хранителна среда. Понастоящем са разработени критични концентрации както за лекарства от първа линия, така и за втора употреба. Трябва да се отбележи, че чувствителността на туберкулозата на микобактерии към циклосерин и аминосалицилова киселина се определя само върху хранителната среда на яйцата.

Разработване на работа описан протокол система позволява да се проучи на чувствителността спрямо лекарства като посветен култура (плътен хранителна среда), и използване на първичен Mycobacterium MGIT-растеж ин витро. Последната опция значително намалява времето за култура, което ви позволява да получите най-пълните резултати от културата на Mycobacterium туберкулоза (включително информация за чувствителността на наркотици) след 3 седмици от датата на събиране на материала, докато традиционният метод е възможно да се получи само 3-тия месец. С течение на времето получените резултати, когато пациентът е в интензивна фаза на лечение, могат да компенсират относително високата цена на изследванията.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Диференциация на микобактериите

Като се има предвид, че използваните хранителни среди не са строго селективни. Последващата диференциация на изолираните микобактерии се признава за задължителна. Необходимостта за диференциация на микобактерии се дължи на редица функции на патологични процеси, предизвикани от рода: различен протичането и изхода на туберкулоза и микобактериози, наличието на естествен лекарствена резистентност към някои анти-TB лекарства.

Приема се, че първичната идентификация на Mycobacterium туберкулоза комплекс M. Nontubercular от микобактерии се извършва със следните характеристики: темп на растеж на твърди хранителни среди, пигментация, колония морфология, присъствието на киселина резистентност и температура оптимален растеж.

За съжаление, не е един метод лаборатория надеждно да се диференцират М. Туберкулоза комплекс микобактерии от друга киселина бацили, въпреки това комбинацията от характеристики, описани по-горе с резултатите, дадени по-долу за редица биохимични тестове позволява идентифицирането на Mycobacterium туберкулоза комплекс с М. Вероятно 95%.

За диференцирането на Mycobacterium комплекс М. Туберкулоза (М. Туберкулоза, М. Говежди, М. BovisBCG, М. Africanum, М. Microti, М. Canettii и други) от бавно нараства микобактерии използва nontubercular основните биохимични тестове, които откриват присъствието на следните симптоми:

• способността да се произвежда никотинова киселина (тест за ниацин):
• нитратна редуктазна активност;
• термостабилна каталаза;
• растеж върху среда с натриев салицилат (1 mg / ml).

Като допълнителни тестове може също да се използва растеж в среда, съдържаща 500 ug / ml паранитробензоена киселина или 5% натриев хлорид.

Много бактериологични лаборатории идентифицират тези микроорганизми само на нивото на комплекса, което се дължи на ограничените възможности на лабораториите и методологичните възможности на специалистите.

В повечето случаи, обаче, на практика за диференциране М. Туберкулоза и М. Говежди е достатъчно следните тестове: ниацин, за наличието на нитрат, регистрацията на присъствие и pirazinamidazy растеж в среда, съдържаща 2 мкг / мл хидразид на тиофен-2-карбоксилна киселина. Взема се предвид, че микобактериите на комплекс М. Tuberculosis се характеризират със следния набор от знаци:

• бавен растеж (повече от 3 седмици);
• температура на растежа в диапазона 35-37 ^o C;
• отсъствие на пигментация (слонова кост);
• белязан с киселинно бърз цвят;
• положителен тест за ниацин;
• положителен тест за нитрат редуктаза;
• липса на термостабилна каталаза (68 ^° С).
• Отсъствието на растеж върху среда на Levenstein-Jensen, съдържаща:
  • 1000 μg / ml натриев салицилат,
  • 500 μg / ml паранитробензоена киселина,
  • 5% натриев хлорид:
• растеж в присъствието на 1-5 ug / ml тиофен-2-карбоксилна киселина.

Значението на диференциацията на изолирани микобактерии ще се увеличи значително с увеличаването на честотата на регистриране на случаи на ХИВ / СПИН, свързани с туберкулоза или микобактериоза. Понастоящем няма абсолютна сигурност за готовността на практическите регионални лаборатории да изпълняват правилно този обем работа.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Имунологична диагностика на туберкулоза

Съществуват редица универсални явления, лекарства и имунологични тестове, които първоначално бяха открити точно с туберкулоза или с модела на имунния отговор към микобактериите. Те включват BCG туберкулин, такова явление като кожен DTH (туберкулин - Pirquet и Манту реакция), реакцията на подкожната туберкулинови сенсибилизирани животни (Koch явление). Едно от първите антитела при инфекциозни заболявания също е открито при туберкулоза. Разбира се, колкото по-дълбоко разбиране на добри механизми за туберкулоза имунитет и техния генетичен контрол, толкова по-голяма може да бъде използването на имунологични методи и лекарства, които влияят върху имунната система, за решаване на практически проблеми, свързани с туберкулозата.

Най-важният и труден практически проблем в момента се счита за откриване на туберкулоза в процеса на масов скрининг на населението. Въпреки многобройните съобщения за "успехи" (на ограничен материал), няма подходящ имунологичен метод (възпроизводим в "всички ръце") и лекарството.

Имунологичните методи, по-специално серологичните изследвания (определяне на антигени, антитела) и изпитванията, предизвикващи туберкулин, са широко използвани в клиничната практика.

На първо място сред имунологичните изследвания, използвани при диференциална диагноза, има серологични методи - определянето на антигени и антитела в различни среди на тялото.

Специфичността на антителата срещу туберкулоза на микобактерия зависи от антигените, използвани в имунологичния тест. Предлага се значително количество антигени, като първият от тях е туберкулиновият PPD:

• PAP и други сложни препарати от течната култура;
• ултразвукова дезинтеграция;
• Екстракт от тритон и други сложни препарати от клетъчни стени;
• 5-антиген (Daniel);
• 60-антиген (Coccito);
• липоарабиноманнан;
• корд-фактор (трехалоза-6,6-димиколат);
• фенолни и други гликолипиди;
• липополизахарид;
• фибронектин свързващ антиген;
• протеини (най-често рекомбинантни); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA и др.

Като резултат от години на изследвания от руски и чуждестранни учени разкри основните закони и ефективността на антитела серологично диагностициране на туберкулоза: колкото по-сложен антиген, по-висока чувствителност и по-ниски спецификата на теста. Специфика в различните страни варира в зависимост от популацията на М. Туберкулозна инфекция и nontubercular микобактерии от извършване БЦЖ ваксинация и други. При деца, информационното съдържание на serodiagnosis е по-ниска, отколкото при възрастни. При първичната туберкулоза (по-често децата), определението за IgM е по-информативно. С вторичен IgG. При HIV-инфектирани пациенти, информативната стойност на серодиагниза при определяне на антителата се намалява. Определяне ефективност на антитела зависи от броя на "клиничните аспекти": Метод активност (в присъствието или отсъствието на "изолиране" микобактерии присъствие гниене на кухини, степента на инфилтрация), разпространението на процеса, продължителността на потока.

Чувствителността на метода на ензимен имуноанализ (ELISA) е около 70%. Недостатъчната ефективност на изследването се дължи на неговата малка специфичност. Преди това се обсъжда възможността за използване на серологичен скрининг при високорискови групи, особено при лица с изменения в белите дробове след туберкулоза.

За да се увеличи специфичността на ELISA, продължават да се търсят по-специфични антигени, включително тези, получени чрез генно инженерство: ESAT-6 и т.н. (вж. По-горе). Използването на стриктно специфични антигени (38 kDa, ESAT) увеличава специфичността. Но значително намалява чувствителността на анализа. Заедно с IFA (системи експериментален лабораторните изследвания. Напр Pathozyme ELISA комплект) също осигурява комплекти с латерална имунохроматографски филтруване (Mycodot), както и други подобни тестове (точка за анализ на мембраната) с визуална оценка на резултата от теста. По време на тези тестове, анализът се провежда за 10-30 минути; те не изискват специално оборудване, те изискват визуална оценка на резултатите, която е свързана с определена субективност. Тези методи имат приблизително еднакви характеристики на чувствителност и специфичност (съответно 70% и 90-93%) като традиционните ELISA.

Използването на методи за имунен анализ има определена стойност като допълнителна, взета предвид в комплекса на използваните методи, в диференциалната диагностика на туберкулозата, особено при диагностицирането на нейните екстрапулмонарни форми. Най-ефективният метод на ELISA е в диагностиката на туберкулозния менингит в изследването на цереброспиналната течност. В този случай чувствителността на анализа е 80-85%, а специфичността е 97-98%. Съществуват данни за ефективността на откриването на антитела срещу туберкулоза на микобактерии в слъзната течност при диагностицирането на туберкулозен увеит.

Индукция на синтеза на гама-интерферон in vitro

Гама интерферонът (IFN-y) е специфичен имунен защитен фактор, осъществен чрез активиране на ензимните системи на макрофагите. Индуцирането на IFN-y синтеза от сенсибилизирани Т-лимфоцити предизвиква тяхното взаимодействие с антигени на микобактерии.

Като антигени, използвани като туберкулинов PPD. И специфичните антигени, получени чрез генно инженерство, по-специално антигени ESAT-6 (ранно секретирани антиген с молекулно тегло 6 Ша) и CFP-10 (култура филтрат протеин 10 kDa). Генетично инженерство или рекомбинантни антигени липсват в клетките на BCG ваксината и други микобактерии. Когато се използва туберкулин, резултатите от индукционния тест IFN-y са сравними с резултатите от туберкулиновия кожен тест (директна корелация). Когато се използват генетично конструирани антигени, резултатите от теста са по-специфични и не зависят от предишната BCG ваксинация. При тестване на ваксинирани лица, които не са имали контакт с туберкулозна инфекция, специфичността на теста е 99%. Чувствителността на теста при пациентите с туберкулоза варира от 81 до 89%.

Тестове и диагностични инструменти са разработени на базата на краткосрочни култивиране на клетки или мононуклеарни клетки от цяла кръв, изолирани от кръвта с антигените на Mycobacterium туберкулоза ин витро с последващо определяне на концентрацията на IFN-γ или чрез преброяване на броя на Т-лимфоцити, които синтезират IFN-γ. Концентрацията на интерферон синтезиран в епруветка се определя чрез ELISA, използвайки моноклонални антитела, свързващи IFN-y. След това, чрез калибриране на стандартния IFN-y, неговата концентрация се определя в епруветката или ямките на плочата.

При провеждането на теста Elispot броят на Т-лимоцитите, синтезиращи IFN-y. Се отчитат на повърхността на плака, покрита с антитела срещу IFN-y.

Разработчиците Diagnosticum на IFN-γ ин витро чрез индукция, който е одобрен от Агенцията за лекарствата и продукти в САЩ, се твърди, че един тест е невъзможно да се направи разлика между латентна туберкулоза инфекция от активна туберкулоза. Следователно, в региони с високо ниво на инфекция, тестът не е директно диагностичен. Въпреки това в нашата страна може да се използва за диференциране на туберкулозната инфекция при деца от алергия след ваксинация и за оценка на нивото на специфичен имунитет в процеса на лечение.

Понастоящем се проучва вътрешната тестова система за определяне на индуцирането на IFN-y синтез от специфични туберкулозни антигени in vitro.

Имунен статус и ход на туберкулоза, имунокорекция

В процеса на лечение на туберкулоза при хора, има промени в антигенезата и състоянието на имунната система.

Данните за промените в ексудатите и тъканите са до голяма степен противоречиви. Единственото нещо, което може да се отбележи със сериозна причина е, че при туберкулозни грануломи като правило се откриват значителен брой активирани Т-лимфоцити.

Има смисъл да се обсъждат още две разпоредби, които са необходими, за да се разбере ролята на имунологичните механизми при лечението на туберкулоза при хората:

• Пациентите със СПИН имат особено висока честота на резистентност към множество лекарства;
• с многократна лекарствена резистентност (и при отсъствие на HIV инфекция), имунитетни разстройства (особено Т-клетъчната връзка) са особено значими.

Когато туберкулоза широко се прилагат различни методи за имуномодулация: тя е предимно средства, действащи предимно на имунитета на Т-клетки и система от мононуклеарни фагоцити (тимусни хормони, изофорон, likopid, polioksidony и др.). Както и цели (атенюирани) микобактерии и техните компоненти.

Молекулярно-биологична диагностика на туберкулоза

За молекулярни методи биология в диагностицирането на инфекциозни заболявания включват, главно, методи базирани на манипулиране с геномната материал на бактериални и вирусни патогени да се идентифицират специфични генетичен материал - ДНК сегменти, които имат нуклеотидна последователност, специфична за определен вид или патогенни щамове да анализира специфичен ДНК последователности в гени, които определят чувствителността на патогена към определени медицински вещества, а също и функционален анализ активността на определени гени на патогена. Молекулярно биологични техники са широко в научните изследвания и практическо приложение в диагностиката и мониторинг на различни бактериални и вирусни инфекции след отваряне през 1985 г., Carrie Myullisom (носител на Нобелова награда. 1989) полимеразна верижна реакция.

Принципи и възможности на метода на полимеразна верижна реакция

PCR позволява да се амплифицира (умножи) in vitro нуклеотидна последователност (ДНК фрагмент на патогена) в продължение на няколко часа в милиони пъти. Реакцията в присъствието на единични ДНК вериги определя изключително висока чувствителност на анализа.

Нуклеотидната последователност на някои региони в ДНК веригата определя генетичната идентичност на микроорганизма, което обяснява високата специфичност на PCR.

Стойността на тази техника за откриване и изследване на характеристиките, причинени от Mycobacterium туберкулоза биологични характеристики на микроорганизми, имащи много бавен растеж: време за удвояване на Mycobacterium туберкулоза ДНК при култивиране е 12-24 часа.

Принципът на метода на PCR се състои в усилване - многократно, милиони пъти. Умножаване на участъците от специфична ДНК последователност в епруветков микроком, по време на цикличен рецидив на следните три реакционни етапа, всеки от които преминава в различен температурен режим:

• Етап I - денатуриране на двойноверижна ДНК при нагряване с отклонение на нейните вериги;
• II етап - комплементарно свързване (хибридизация) на праймери (първични олигонуклеотиди) с крайни участъци от строго специфични вериги, избрани за мултиплициране на ДНК фрагмента;
• Етап III - завършване на ДНК фрагментната верига с помощта на термостабилна ДНК полимераза.

За амплификация in vitro трябва да има молекули на матрична ДНК. Четири вида деоксинуклеозид трифосфати (нуклеотиди), съдържаща подходящи азотни бази: аденин (А), тимин (Т), гуанин (G), цитозин (С); изкуствено синтезирани първични олигонуклеотиди (праймери), състоящи се от 18-20 базови двойки; термостабилна ДНК полимераза ензим с температура на оптимално 68-72 ^на С, и магнезиеви йони.

Специфичността на PCR зависи от избора на ДНК фрагмента. В съответствие с това се синтезират олигонуклеотиди от фланкно семе. Специфичността на хибридизацията и завършването на ДНК веригата се дължи на принципа на комплементарност на следните двойки азотни бази: аденин-тимин, гуанин-цитозин.

За определяне на геномна туберкулозен микобактерии комплекса най-ефективно цел усилване в повечето системи за изпитване, избрани ДНК фрагмент на IS6110, които в повечето щамове на Mycobacterium туберкулоза геном има значителен брой (10-20) на повторения, която осигурява, заедно със специфичност, висока чувствителност на анализа. В същото време са описани щамове на Mycobacterium tuberculosis с малък брой повтаряния или липса на IS6110 фрагмент.

Изолиране на ДНК молекули от биологична проба

За осъществяване на PCR, ДНК молекулите на патогена трябва да бъдат изолирани от биологичния материал в минимален обем, с минимално количество неспецифична ДНК и различни инхибитори на ензим-ДНК полимераза.

Приготвянето на проби трябва да се извършва при условия, които предотвратяват кръстосаното замърсяване на пробите от изолираните молекули на ДНК. За тази цел е необходима предварителна обработка на помещението с ултравиолетови лъчи, подове и работни повърхности на бюра и уреди с хлор-съдържащи разтвори. Необходимо е също така да се използват чисти ръкавици, епруветки за еднократна употреба и върхове за автоматични пипети.

За изолиране на ДНК от Mycobacterium туберкулоза от клинични проби (цереброспинална течност, бронхиална промиване) не съдържа голям брой клетки, клетъчни остатъци, или техни соли, достатъчно, за да се центрофугира пробата на 3-4 хиляди. Rpm, се добавят към разтвора на утайката 20-30 мкл 2% тритон Х-100 и се загрява при 90 ° С ^за С за 30 минути.

За получаване на храчки проби трябва да бъде ефективна втечняване, който обикновено се използва в продължение на 4% разтвор на натриев хидроксид и N-ацетил-Ь-цистеин (NALC) в количество от 50-80 мг на пробата - в зависимост от вискозитета на пробите. Разтворът NALC трябва да се приготвя ex tempore или NALC прах може да бъде добавен директно към пробата. След втечняване пробите трябва да се центрофугират в продължение на 15 минути при 3.5-4000 об / мин (3000 g) в 50 ml флакони с винтова капачка, т.е. При същите условия, които се препоръчват за подготовката на храчките.

За извличането на ДНК от метода на пелети се използва най-често се основава на използването на 5-6 моларен разтвор на гуанидин изотиоцианат лизисен реагент като микропорести частици и силициев оксид ( "диатомит") сорбиращ ДНК молекула. Неспецифичните вещества, включително възможни инхибитори, след това се промиват в 2,5 моларен разтвор на гуанидин изотиоцианат и разтвор на етанол, след което ДНК молекулата се десорбира във вода, и тези проби се използват за извършване на PCR. За да се опрости технологията на екстракцията на ДНК, диатомичната пръст често се замества от магнитни микрочастици, покрити със силициев оксид. В този случай вместо центрофугиране се използва специална магнитна стойка за микротръбички, за да се утаят частиците.

В Русия беше разработен оригинален метод за имуномагнитно отделяне на микобактерии, последвано от екстракция на ДНК на патогена. За Mycobacterium туберкулоза имуномагнитно сепариране използване ferroparticles размер на 3-5 микрона, покрита със силициев двуокис, към който са прикрепени чрез химическо свързване поликлонално (заек) антитела към Mycobacterium туберкулоза. Пробите от храчки след алкален лизис се неутрализират с кисел разтвор на трис-НС1 и се инкубират с имуномагнитен сорбент. След това, имуноферо-частичките се събират с магнитна пръчка с подменяем връх, прехвърлят се в микротубус и се утаяват. Добавете 20-30 ц1 от 2% разтвор на Triton Х-100 и затоплете за 30 минути при 90 ^° С. Супернатантата се използва като ДНК шаблон за PCR анализ.

Трудният проблем е изолирането на ДНК от Mycobacterium tuberculosis от биопсични екземпляри. За ензимна биопсия, ензимната протеиназа К се използва в крайна концентрация от 200-500 mg / l при температура 56 ^° С в продължение на една нощ. Освен това е използван един от известните методи. Излишъкът от неспецифична ДНК в PCR анализа на биопсии често предизвиква инхибиране на реакцията, което изисква повторна екстракция на ДНК.

Методи за откриване на резултати

След завършване на реакцията, амплифицираните ДНК фрагменти на патогена се идентифицират чрез различни методи.

Методът за гел електрофореза е добре известен. Така получава ДНК фрагмент се идентифицират чрез положителна контрола, съдържаща желания специфичен фрагмент на ДНК или известни предварително размера (брой базови двойки) фрагмент, който се определя чрез стандартен молекулен маркер.

В присъствието на специфично багрило, етидиум бромид се включва в двойноверижна ДНК. Синтезираният ДНК фрагмент се открива като лента, осветена под действието на ултравиолетовия лъч.

Размерът на ДНК фрагмента, определен чрез електрофореза от разстояние от началото, трябва да съответства на известен маркер за молекулно тегло или положителна контрола.

Други методи за определяне на PCR резултати на базата на хибридизация на едноверижен PCR продукти с олигонуклеотид, комплементарен към него - ДНК сонда е белязана с биотин, последвано от откриване чрез ензимни реакции, например чрез свързване към стрептавидин-биотин алкална фосфатаза.

Въз основа на този тип откриване са създадени PCR анализатори, в които откриването на резултатите от PCR се извършва автоматично в резултат на прочитане на оптичната плътност в пробите след проявяването на ензимната реакция.

Недостатъците на тези методи са възможностите за интралабораторно заразяване с доста къси фрагменти от ДНК молекули. Когато молекулите навлизат в нови проби, те стават матрица за PCR и водят до фалшиви положителни резултати.

В тази връзка, за да се предотвратят неверни положителни резултати, се въвеждат стриктни правила за отделяне и изолиране на помещенията: да се извлече ДНК от биологични проби; помещения за откриване на резултати (електрофореза) от чистата зона. Тези помещения са зона с вероятно замърсяване. Друга изолирана област е чистата стая за въвеждане на ДНК проби, които ще бъдат изследвани в епруветки с реакционна смес за PCR. Накрая се приема, че основното устройство - ДНК-усилвателят - трябва да бъде поставено в отделна, може би офисна стая.

За да се предотврати замърсяване на продуктите от предходните реакции - някои тест Likon-усилвател PCR система вместо dezoksinukleozidtimidina съдържа dezoksinukleoziduridin, които при ин витро синтеза верига включен вместо в правилно положение, т.е. Азотната основа на тимин, намираща се в естествената ДНК, се замества с урацил. Урацил ДНК гликозилаза се добавя към реакционната смес за аналита, разрушава само замърсяващи фрагменти деоксиуридин, но не ДНК роден анализира. (I). Следващото нагряване при 94 ^° С инактивира този ензим и не пречи на амплификацията в PCR.

Има система за тестване, базираща се на изотермална амплификация на рРНК, за която първо се извършват обратната транскрипция и синтез на ДНК молекули. Който на свой ред е матрица за последващия синтез на РНК молекули. РНК ампликони се откриват, като се използва акридин-оцветена ДНК сонда, когато се хибридизира в разтвор на реакционната епруветка. Този метод, освен високата чувствителност, има предимството да се анализира в една тръба, която предотвратява замърсяването. Според авторите чувствителността на този метод в дихателните проби достига 90% със специфичност от 99-100%.

Нови методи за откриване се прилагат в PCR в реално време. Тези методи се различават главно по това, че PCR и откриването на резултатите се извършва едновременно в една затворена тръба. Това не само технологично опростява техниката на анализ, но също така предотвратява замърсяването на лабораторните помещения и тестовите проби с продукти от предишна PCR.

В реално време резултати PCR откриване се дължи на флуоресценцията, получена по време на флуорогенна хибридизационна сонда ДНК с amplifitsi Rui-PCR при специфичен ДНК фрагмент. Структура флуорогенни ДНК сонди, конструирани така, че флуоресцентен маркер, се освобождава в резултат на ензимната реакция или на разстояние от молекула флуоресценция гасител само при специфична хибридизация с желаната ДНК молекула да се амплифицира по време на PCR. Тъй като броят на пробни молекули хибридизират с увеличаването на флуоресценцията е пропорционална на открива нивото на броя на молекулите на амплифицирания продукт. Тъй като при всеки цикъл брой на PCR фрагмент ДНК молекула се умножава по две, броя на цикъла, при която флуоресценция се определя и увеличава обратно пропорционална на броя на ДНК молекули в първоначалната проба. Ако реакцията е да се въведе като калибратор няколко различни известни концентрации на молекули, съответстващи на ДНК фрагмент от Mycobacterium туберкулоза, като се използва компютърна програма може да се изчисли и количеството на геномна ДНК в изпитвания материал.

Всяка стандартна проба се дублира. Количественият критерий е минималният брой PCR цикли, необходими за началото и растежа на определената флуоресценция. На абсцисата - броят на циклите; ординатата е стойността на флуоресценцията. Концентрациите на ДНК са обратно пропорционални на броя на циклите, необходими за появата на флуоресценция. В дясната колона (21-32) се отбелязват номерата на цикъла за съответните концентрации. Разлики между 10-кратно концентрации на ДНК фрагменти 10 ² -10 ⁶ ml - 3.2-3.4 цикъла. За двама пациенти концентрациите на IS6110 фрагменти са около 10 ³ / ml и 10 ⁴ / ml. Като се има предвид броя на повторенията (6-20) на анализирани фрагменти в генома на Mycobacterium туберкулоза брой микобактерии в клинични проби - около 100 и 1000 клетки, съответно.

Използване на PCR за диагностициране на туберкулоза

Методът на PCR е най-често използван за ускорена диагностика на туберкулоза - откриване на микобактериум туберкулоза в клинични проби: храчка. Бронхиалното напояване, плевралния ексудат, урината, цереброспиналната течност, остеолизата, аспирациите на женските гениталии и различни проби от биопсия. В проучването в Холандия са изследвани около 500 храчки и бронхиална промивка проби от 340 пациенти с потвърдена диагноза на белодробна туберкулоза за сравнение на чувствителността на PCR методи, микроскопия и проучвания култура намазки. Чувствителността на анализа е съответно 92.6.88.9 и 52.4%. Специфичността на всички методи е около 99%.

Беше сравнена ефективността на откриване на Mycobacterium tuberculosis чрез микроскопия на смазване, засяване на среда на Levenstein-Jensen, тестова система VASTES и PCR анализ. PCR показва чувствителност от 74.4%, микроскопия - 33.8%, засяване на гъста среда - 48.9% и VASTES - 55.8%. Средното време за откриване за засяване на среда на Levenstein-Jensen е 24 дни. VASTES - 13 дни, PCR - 1 ден.

Разглеждат се и възможностите за използване на PCR като чувствителен и бърз метод за мониторинг на ефективността на лечението на туберкулозата.

Откриване на Mycobacterium туберкулоза ДНК чрез PCR с ефективна химиотерапия определя по-дълго време - средно 1,7 месеца в сравнение с намазка дефинирани под флуоресцентна микроскопия и от 2,5 месеца в сравнение с бактериологично изследване.

Диагностика на екстрапулмонарни форми на туберкулоза

Стойност като чувствителен метод PCR е особено голяма за извънбелодробни форми, като образува при тези клинични и рентгенови методи обичайни бактериологични методи за определяне на Mycobacterium туберкулоза в диагностични материали неефективни.

В изследването на проби от урина PCR резултати са положителни в 16 от 17 пациенти с активна туберкулоза и отрицателен пикочния 4 пациенти неактивен бъбречна туберкулоза и 39 пациенти с урината nontubercular система заболяване.

Ефективността на PCR анализа в изследването на аспирациите на костния мозък при пациенти с температура от неизвестен произход е демонстрирана в случаите на предполагаема туберкулоза. За да се диагностицира туберкулозен лимфаденит, бяха изследвани 102 аспирационни пункции и биопсичен образец от 67 деца с подозиран туберкулозен лимфаденит при деца. Постигнати са положителни резултати: 71,6% PCR в реално време. Флуоресцентна микроскопия - 46.3%. Изследване на културата - 41,8%. В проучването на 50 биопсии на лимфни възли при пациенти с "котешка драска" болест, всички резултати са отрицателни. Така се демонстрира 100% специфичност на PCR анализа. В същата работа, с пробивна биопсия на лимфни възли, беше демонстрирана възможността за откриване на M. Avium.

Диагнозата на туберкулозата на безплодието на женските полови органи, както е известно, е един от най-трудните проблеми на диагнозата. Когато се изследва чрез PCR биопсия на ендометриума, ендометриални аспирати течни проби от Дъглас пространство 14 (56%) от 25 пациенти изследват лапароскопски предполагаеми туберкулоза, се получават положителни резултати. Като се използва микроскопия на смазване и култура, съответно се получават 1 и 2 резултата. Тези случаи също са PCR-положителни. Повечето PCR-положителни резултати са свързани с случаи с характерни признаци на туберкулоза според хистологичното изследване; по-малък брой - с подозрение за туберкулоза според лапароскопски данни. Само един положителен резултат от PCR анализа е получен при отсъствие на лапароскопски данни за туберкулоза.

Когато се диагностицират екстрапулмонарни форми на туберкулоза, клиницистите често имат въпрос относно възможността за откриване на патоген при тестването на кръвни проби с PCR метода. Литературните данни показват, че откриването на ДНК от Mycobacterium tuberculosis от кръвни проби е възможно при широко разпространени форми на HIV инфекция. ДНК от mycobacterium tuberculosis се открива само с генерализирана туберкулоза на различни органи при пациенти с трансплантиран бъбрек и имуносупресия.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Идентификация на видовете микобактерии

Методът за PCR може да бъде доста ефективно за бързо идентифициране на микобактерии на туберкулозния комплекс и някои видове микобактерии nontubercular след получаване на първоначалното им растеж. В този случай използването на PCR може да спести 7-10 дни, което е необходимо за последващата културна идентификация на положителния резултат. Тестът за PCR е технически много прост, тъй като не изисква сложна подготовка на пробите от клиничния материал за постигане на висока чувствителност. В проучването 80 положителни в настоящия тест система (MB Васто. Organon фирма) всички положителни култури на PCR са строго специфични и държани в продължение на 1 ден. За да се идентифицират други видове микобактерии в препарата на ДНК от култура патоген хибридизира със специфични ДНК сонди, белязани с акридин и щамове, открити от появата на хемилуминесценция чрез chemiluminometer или нитроцелулозни ленти с визуална оценка след хибридизация. С помощта на такъв набор се идентифицира ограничен брой видове: комплекса mycobacterium tuberculosis. M. Avium, М. Avium комплекс, М. Kansasii и М. Gordonae.

A.Telenti et al. Разработи относително прост и евтин метод за идентификация на вида на клинично важни видове микобактерии от PCR и последващо третиране с два рестрикционни ензими (ензими, имащи свойства нарязани молекула ДНК в специфични точки). ДНК фрагментът се амплифицира. Кодираща протеина на топлинния шок (65 Ша), и след това се обработва в резултат PCR ДНК фрагмент от 439 нуклеотидни чифта поотделно два ензима - Bste II и Хае III. След това се анализира с помощта на електрофореза в агарозен гел, получен на два продукта, определяне на техния размер (брой базови двойки), използвайки стандартен набор от ДНК фрагменти (молекулни ДНК маркери) в дължина от 100 до 1000 базови двойки. Във всяка от специфичните видове (М. Туберкулоза, М. Авиум, М. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) откриване на два или три ДНК фрагменти с различни размери за всеки рестрикционен ензим. Комбинацията от различни размери на ДНК фрагменти прави възможно да се диференцират тези видове помежду си.

Разработва се технологията на биологичните ДНК микрочипове. Който ще помогне за идентифицирането на повече от 100 вида микобактерии в едно проучване.

Идентифицирането на видовете може да се извърши чрез PCR амплификация на вариабилен регион 16S рРНК последвано от секвениране на ампликони, в сравнение със съответната основна структура, която позволява идентификация на повече от 40 вида микобактерии.

С помощта на PCR може да се извърши и идентификация на вида в комплекс Mycobacterium tuberculosis, включително диференциация на M. Bovis и M. Bovis BCG. За целта се анализира наличието или отсъствието на някои гени в геномните региони на RD1. RD9 и RD10. RD1 отсъства при M. Bovis BCG, но присъства в вирулентни видове, включително M. Bovis.

Определяне на лекарствената чувствителност на Mycobacterium tuberculosis чрез PCR

Цели на молекулярни генетични методи за лекарствена чувствителност или резистентност на Mycobacterium туберкулоза намаляване за идентифициране на мутации в специфични нуклеотидни последователности на известни гени. Основни методи се основават или на директен prochityvanii (последователност) на тези последователности след амплификация или хибридизацията на биотин белязан ДНК фрагменти амплифицирани време сонди PCR ДНК. И двете алтернативи включват идентифициране на нуклеотидни замествания в последователностите, които използват ДНК сонди водят до липса или непълна хибридизация към нитроцелулозна мембрана се използва ензим конюгат (стрептавидин-алкална фосфатаза) - Метод липа-Rif-TB.

Метод за измерване на флуоресценцията в локално фиксирана на microsections ДНК сонди комплементарна познати мутации в PCR амплифицирани генни региони, отговорни за резистентност или на чувствителността спрямо лекарства, наречени mikrobiochipov метод. Основният алгоритъм за извършване на това изследване е както следва. След изолиране на ДНК от клинична проба или култура на микобактерии е необходимо да се провежда PCR амплификация на съответните фрагменти от rpoB ген, отговорен за лекарствена чувствителност към рифампицин или katG и Inha гени, кодиращи протеини на Mycobacterium са отговорни за чувствителност към изониазид. Резултатите от PCR се оценяват чрез агарозна гел електрофореза, в която се потвърждават съответните ДНК фрагменти с желаната дължина. След това се провежда втори кръг от PCR, за да се въведе флуоресцентен маркер в ДНК. Резултатите от PCR отново се потвърждават чрез гел електрофореза. След хибридизация се провежда (инкубация за една нощ), последвано от промиване на получения материал на биочипа, което е с голям брой, определен в малка стъклена плоча къси ДНК нишки (сонди), които са комплементарни нуклеотидни последователности тип Mycobacterium туберкулоза лекарствената-чувствителен в точките на възможните мутации. Както и на мутантните последователности, отговорни за лекарствената резистентност. Местоположение на ДНК проби от чинията - строго определени, както и нивото на флуоресценция се наблюдава при хибридизация да се определи резултата с помощта на специално устройство за четене е инсталиран. В тази връзка резултатите от анализа се определят чрез специална компютърна програма.

През последните години са разработени алтернативни методи за определяне на лекарствената чувствителност на микобактериална туберкулоза въз основа на PCR технологията в реално време, което дава възможност да се провеждат тези изследвания в тест с затворена тръба.

На фиг. 13-13 показва резултата от анализа на клинични изолати на Mycobacterium туберкулоза при определяне на устойчивост на рифампицин чрез PCR в реално време: 218 - контролната проба (чувствителен към рифампицин); 93 - положителна контрола за мутацията на Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - положителна контрола за мутация на Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - експериментални проби. Резултат от изчисляването на кинетичните криви на амплификация на 4 канала: канал 1: 393 - положителна контрола за мутация на Ser-Trp TCG-TGG; канал 2: 4482 - положителна контрола за мутация на Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - експериментални проби; канал 4: кинетични криви на амплификация на всички проби, участващи в експеримента. Положителна контрола на реакцията на амплификация. Заключения: Резултатите от анализа разкриват следните мутации, които определят устойчивост на рифампицин: в проби 162,163,172,295 - Ser-Leu-TCG TTG. Същият принцип се използва за определяне на лекарствената резистентност към изониазид за гените katG и inhA, което определя най-честите мутации.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Идентификация на щама на mycobacterium tuberculosis

Най-добре изследван метод за идентифициране на щамове на Mycobacterium туберкулоза е техника, наречена ограничение дължина фрагмент полиморфизъм (RFLP RFLP,. Или в английски език) и която се основава на fragmentirovanin (ограничение) на Mycobacterium туберкулоза ДНК ензим Pvu II и фрагментите, получени последваща хибридизация с някои специфични последователности на ДНК неговия повтарящ се елемент IS6110. Интерспеци променливост реализира чрез различен брой повторения IS6110 и тяхното местоположение на ДНК. Както и различни разстояния между определени точки на атака рестрикционен ензим (рестрикционни сайтове) и IS6110 елемент. Тази технология е много сложна и отнема много време. След лечение с ДНК, получена от култура на Mycobacterium туберкулоза, гел електрофореза се провежда с рестрикционен ензим, и след това се прехвърля ДНК фрагменти с различни дължини на нитроцелулозна мембрана, хибридизацията се провежда с фрагменти на IS6110-елемент и се открива чрез ензимни реакции. Полученият модел специфични ДНК ленти характеризират конкретния щам на Mycobacterium туберкулоза. С помощта на компютърния анализ се разкрива самоличността или свързаността на щамовете. Въпреки факта, че RFLP методът е най-дискриминационен, т.е. Идентифицира най-голям брой разлики в анализираните щамове, е неефективно за малък брой (по-малко от 5) IS6110-повторения, наблюдавани при някои щамове. На фиг. 13-14 показват резултатите от RFLP-типизиране на щамове.

Алтернатива може да бъде методът на размножаване - анализ на полиморфизма на спейсери ДНК последователности - междинни между директните повторения на DR областта. Когато се извършва размножаване на щамовете, PCR се провежда с праймери, ограничаващи DR областта, след което се формират фрагменти с различна дължина, които хибридизират с променливите междинни области на ДНК. Представен е анализ на спейсерните последователности на DR областта. Според изследователите, по-прости, продуктивни и подходящи за първичен скрининг на щамове и предварителен епидемиологичен анализ, както и за изследване на пряк клиничен материал.

Очевидно по-ефективен и технологично достъпен метод е VNTR (съкращение на английските думи) или метод за определяне на променливия брой точни тандемни повторения в ДНК на mycobacterium tuberculosis. Този метод се основава само на използването на PCR и не изисква допълнителна манипулация. Тъй като броят на тандемните повторения в различни щамове и в различни локуси е различен, фрагментите с различни размери се определят и анализират върху получената електрофореграма на PCR продуктите. Според изследователите, използването на VNTR постига по-голяма степен на дискриминация на щамовете, отколкото при метода RFLP.

През последните години се отделя голямо внимание на разпространението на щамове Mycobacterium tuberculosis от семейство W-Beijing (понякога наричани щам Пекин), които до голяма степен са устойчиви на наркотици.

Основни изисквания към качеството на молекулярните биологични изследвания

[72], [73], [74], [75],

Основни регулаторни документи за PCR

Поръчки руското министерство на здравеопазването: №45 от 2.7.2000 г .. Номер 109 от 21.03.2003 г .. Номер 64 от 02/21/2000, насоките: 1.3.1888-04 "Организация на работата в изследвания с използване на PCR материал заразени с патогенни биологичен агенти от групи III-IV на патогенност "; 1.3.1794-03 "Организация на проучванията, използващи PCR с материал, заразени с микроорганизми I-II патогенност групи". 2003. 3.5.5.1034-01 "обеззаразяване на материала, заразени бактерии I-IV патогенност групи при използване на PCR," 2001 Приложението 11 на унифицирани инструкциите за микробиологичните методи за изследване за идентифициране, диагностика и лечение на туберкулоза.

[76], [77], [78]

Персоналът

Изпълнение на молекулярно-биологични изследвания могат да държат лекарите по клинична лаборатория за диагностика, лекари бактериолози, вирусолози, лекари, биолози, клинична лаборатория за диагностика, както и специалисти със средно медицинско образование, преминал специализация и обучение на високо ниво по предписания начин.

Организиране на лабораторни помещения

Необходими са следните лабораторни помещения:

• Областта за обработка на проби е лаборатория, адаптирана за работа с инфекциозни агенти от групите на патогенност III-IV, съгласно Методически инструкции 13.1888-04.
• Зона за приготвяне на реакционни смеси PCR - лабораторно помещение, което осигурява защита от вътрешно лабораторно замърсяване - "чиста" зона.
• • Ако за анализиране на PCR продукти се използва електрофореза или хибридизация. Лаборатория стая, в която ДНК фрагменти умножените са извлечени от тръбите и амплификация, съответно, може да се получи в околната среда, в съответствие с изискванията за PCR лаборатории (1.3.1794-03 насоки, ориентиране 1.3.1888-04) трябва да бъде напълно се изолира от помещенията, посочени в предходните параграфи. Тя трябва да бъде изключен от зоната на движение към зона електрофореза за работа с пробата и "чиста" площ от всякакви персонал, оборудване, материали и предмети, както и прехвърлянето на въздух през вентилационната система, или в резултат на проекти. Тази зона не се изисква за флуорометричното откриване на PCR продукти.
• Стаята за документация и обработка на резултатите е оборудвана с компютри и необходимото офис оборудване. Тази стая може да съдържа оборудване, което осигурява откриване на PCR продукти без отваряне на тръбата. - флуоресцентни PCR детектори и термични цикли за PCR в реално време.

Санитарните и епидемиологичните изисквания за първично третиране на храчките са подобни на стандартните микробиологични изисквания за работа с микобактериална туберкулоза.

[79], [80], [81], [82],

Завършване на лабораторно оборудване за PCR диагностика

Лабораторията включва оборудване за следните стаи.

• помещение за подготовка на пробата, съдържа следното оборудване: ламинарен от II клас на защита "SP-1.2": термостат в твърдо състояние с нагревателно покритие за епруветки тип "Eppendorf"; микроцентрофуга при 13 000 об / мин; центрофуга (Vortex); хладилник с температурен обхват от -20 ^о С до +10 ^о С; пипети с променлив обем на серията "Rroline"; помпа с OM-1 уловителна колба; статив за пипети; работно място за стативи 200x0,5 ml; работно място за стативи 50x1,5 ml; Стендове за съхранение на епруветки 80x1.5 ml;
• Стая за приготвяне на реакционна смес: защитна камера PCR-кутия ("Laminar-C 110 cm); центрофугиране - Vortex; Пипети с променлив обем от серията Proline; статив за пипети; работно място за статив 200x0,2 ml; Стендове за съхранение на епруветки 80x1.5 ml; хладилник с температурен обхват от -20 ^о С до + 10 ^о С;
• помещение за електрофореза: камера за хоризонтална електрофореза; захранване; трансилюминатор;
• ДНК усилватели или анализатори на нуклеинови киселини (PCR в реално време) с компютър и софтуер; могат да бъдат поставени във всяка свободна стая. Ако се използва PCR технология в реално време. Няма нужда от място за електрофореза.

[83], [84], [85], [86]

Външен контрол на качеството

За да бъдат сигурни в постигането на обективни надеждни резултати, лабораториите трябва да участват в системата за външна оценка на качеството на лабораторните изследвания.

Участниците в системата за контрол на качеството получават; 12 флакона суспензии лиофилизирани бактериални клетки, две от които съдържат Е.коли Е. Кокосови, 3 флакона с Mycobacterium туберкулоза (авирулентен щам) при 10 ² / мл; 3 ампули с клетки от подобен щам в концентрация от 10 ⁴ / ml; 2 ампули с не-туберкулозни микобактерии M. Avium-intracellulare и M. Kansasii в концентрация от 10 ⁵ / ml.

Разпространените тестове за външно оценяване на качеството са предварително тествани в две независими лаборатории с богат опит в тази област.

[87], [88]