Ембрионални стволови клетки

Откриването на ембрионални стволови клетки - не е имало инцидент, и се появи на готови изследванията на почвата в областта на развитието изследвания биология. Терминът "стволова клетка" се въвежда в медицината още през 1908 г. На конгреса на хематологичното общество в Берлин от Александър Максимов във връзка с хематопоетични клетки. Много преди изолирането и получаването на стабилни линии на плурипотентни ембрионални стволови клетки в ранното развитие на процеса на изследване използва стволови terato- (ембрио-карциномни клетки, с които изследвали неизвестни механизми на ембриогенезата, включително последователност на експресията на ранните гени и протеинови продукти на тяхната работа.

Но дали действеността на човешкия геном е непоправимо изгубена в процеса на еволюцията? Не, и ембриогенезата е доказателство. Ако това е така, тогава, когато по принцип ще бъде реализиран вторият път на еволюционното развитие? Вероятно, когато човек напусне Космоса, условията на околната среда ще са относително постоянни от доста дълго време. Загуба на кост (костна деминерализация в безтегловност състояние) много бавно податлив ремоделиране и регенерация може да се разглежда като първа стъпка на процес човешки адаптация като вид на съществуване в пространството. Плащането за втория път на еволюционното развитие обаче ще бъде различно - стерилитет ще бъде цената за връщането на всички клетки на дейпотентност и абсолютна пластичност. Така че се размножава в този свят на "еволюционни хамелеони" няма да има мейоза, otpochkovaniem. Но ние ще живеем дълго. Теломеразно безсмъртие е безсмъртието на амебата. В многоклетъчен организъм стволовите клетки са субстрата на количествената и качествената дълголетие.

[1], [2], [3], [4]

Източници на ембрионални стволови клетки

Днес източници на ембрионални стволови клетки за лабораторни тестове са Line миши тератокарцином (129 / SV, F19, F8, Цин 40, CGR 86, Rl, КК, JM-1, E14TG2a, CGRSb) и човешки тератокарцином (NTERA-2, ТЕРА-2 , Н-9 клонинг), както и Hess Trauneona. Въпреки това, наличието подробно клетъчна паспорт показва имунен фенотип, хромозомен анализ на резултатите от експресионните профили иРНК изложени рецептори и протеин вътреклетъчно сигнализиране не компенсират значителни недостатъци teratokartsinomnyh линии ESC - бърза загуба на totipotency и невъзможност за приложение в клинични изпитвания и смесен диференциация в културата е много трудно да се изолира чиста специален ред от хетерогенна популация от клетки. Следователно, обикновено източник ESC линии, получени за клинични цели, служи като вътрешна клетъчна маса на бластоциста на ембриони отделните бластомери на 8-клетъчна етап на развитие, клетките морула-късни етапи, и първичен зародишните клетки.

Трябва да се отбележи, че тератокарциномните клетки, въпреки че имат свойството на плурипотентност, имат значително по-нисък плурипотентен потенциал в сравнение с ESC. Интегрирането им с ембрионални клетки рядко води до образуването на химери, при които в допълнение към това никога не се образуват гамети с генотип от тератокарциномни клетки. Смята се, че това се дължи на честата поява по време на клетъчното култивиране аномалии тератокарцином хромозомни: загуба на Y хромозома, различни тризомия, делеции или транслокации.

Опитите да се разграничи човешката линия ESC са били предприети много пъти, но тази задача не може да бъде решена, тъй като нормалните човешки бластоцисти са трудни за достъп до обекти. В допълнение, при хората честотата на хромозомните аномалии е по-висока, отколкото при ембриогенезата на животните. Преобладаващото мнозинство от ранните човешки ембриони, получени след ин витро оплождане, проявяват хаотична хромозомна мозайка и често има числови и структурни аберации. Дори по-късно, на етапа на бластоциста само 20-25% от човешките ембриони се състоят от клетки с нормален кариотип. Беше почти невъзможно да се използват такива ембриони за създаване на ЕСС, тъй като зиготите обикновено се култивират до етапите на две или четири бластомери и след това се трансплантират в матката. Само сравнително наскоро беше надеждна техника, разработена за култивиране на оплодени човешки овули до етапа на бластоциста. Въвеждането на тази техника в практиката на ин витро оплождане не само увеличава честотата на успешния имплантационен резултат, но и прави нормалните бластоцисти по-достъпен обект.

Друг източник плурипотентни стволови клетки е първични полови клетки, които, за разлика от по-напредналите прогениторни популациите germenativnogo епител, не са на повърхността на бета-интегрин, но експресират висока активност shelochnoy фосфатаза. Трябва да се отбележи, че в експеримента от населението на стволови клетки, които се образуват от първичните полови клетки се учил с 80-те години на миналия век. В същото време е разработена техника за изолиране на първични зародишни клетки от рудимента на говежди ембриона гонада. Първите неуспешни резултати от култивиране на първичните полови клетки ин витро показват, безсмислието на тези усилия, тъй като клетките, въпреки че са оцелели, но не се размножават и умира в рамките на първия ден. По-късно е установено, че първични миши зародишни клетки пролиферират ин витро в присъствието на само в културална среда на разтворими и мембранно-свързани специфични полипептидни растежни фактори. Многобройни проучвания са показали, че е необходимо наличието в културалната среда не само LIF, но membrannosvyazannyh и стомана разтворим фактор (SIF) за оцеляване и пролиферация на първични полови клетки. Тези пептиди се получават чрез клетъчни ембриони соматични хомозиготни за мутация на стомана, и един от тях е лиганд на прото-онкоген Ckit.

Първичните зародишни клетки от бозайници и хора са от извънгонален произход и са източник на клонално развитие на половата клетъчна линия. Стартовата линия първичната зародишни клетки, както и всички тъкани на ембриона и екстраембрионалната мезодерма дава epiblast (първична ектодерма) ранни ембриони с мозайка структурна организация. Микрохирургичното отстраняване на различни части от ранния ембрион създава локализираща зона в епибласта на клонинг от ангажирани прекурсори на първични зародишни клетки. С rodamindekstrana, което се използва като клетъчен маркер е установил, че прекурсори първични полови клетки са разположени в близкия участък на epiblast, в близост до екстраембрионалната ектодермата. Първичната сексуална клетъчна линия излиза от 45-клетъчния клон, чието разпределение се извършва в самото начало на гастролация. Тогава клонинг сегрегацията настъпва, а по време на гастролация, първичните полови клетки навлизат в екземебрионовия мезодермизъм и се намират в основата на алантоичния рудимент зад основната лента. Оттам, първичните зародишни клетки мигрират към вентралния край на ендодермалния ендодерм и след това активно се движат по мезентерията, като населяват гениталните ролки в края на миграцията. В процеса на миграция, както и в първите 2-3 дни локализация в гонадовия рудимент, първичните полови клетки активно пролиферират и преминават през осем репликативни цикъла. Ако в началото на миграцията има около 50 първични зародишни клетки, в репродуктивните кисти на миши ембриони от 12-дневно развитие, броят на първичните полови клетки надвишава 25 000.

Функционалната сходството на ЕСС и първични полови клетки показва пълно интегриране на последните в масата на заместване бластоцист вътрешна клетка и последващо пълно развитие на ембриона, тъкан, която се състои само от потомството първични зародишни клетки. Според други характеристики миши първични зародишни клетки PGCs също са идентични, показва способността да се диференцират в различни посоки, за да се образува ембриоидни тела в ин витро, а ин виво форма тератоми когато се инжектират подкожно в имунодефицитни мишки наподобяващи спонтанни тератоми тестикуларни мишки линия 129 / трет.

Установено е, че, когато се добавя към LIF среда и разтворим membrannosvyazannogo SIF изолирани първични полови клетки на 8 дни миши ембриони оцеляват и се размножават в култура в продължение на 4 дни, но след това умират. Освен това, на периода, когато културата на смърт наблюдава първични полови клетки съвпада с фазата на развитие на миши ембриони (12.5-13.5 дни), когато пъпките първични гонадни женски полови клетки влизат мейоза, и в мъжките първични зародишните клетки са блокирани митотичен деление. Въпреки това, ако добавите към околната среда не само растежни фактори LIF и на СИФ, но също така и на FGF2, първична зародишни клетки продължават proliferirovat и субкултури се формират клетъчни колонии могат да се възпроизвеждат дори след като е бил отстранен от средата на растежни фактори (СИФ и FGF). Такива клетки могат да се култивират дълго време върху ембрионалния фибробластен субстрат без добавяне на разтворим LIF на растежен фактор. Това са тези стабилни клетъчни линии, получени от първични зародишни клетки, за които се предполага, че се наричат ембрионални зародишни клетки. Този термин не може да се счита за успешно, както при култивирани EG-клетки не могат да бъдат получени ембрионални зародишни клетки, способни на извършване на следващите етапи на овогенезата или сперматогенезата. Това се дължи на факта, че EG-клетъчни линии, макар и получени от първичните полови клетки, но в културата на придобиване на свойствата на ембрионални плурипотентни стволови клетки губят способността си да ангажира germenativnye линия. С други думи, основните половите клетки по време на отглеждането губят свойствата си гамети трансформирани в прекурсори и ESC подобни плурипотентни клетки.

Трябва да се отбележи, че когато се прилагат имунодефицитни EG мишки, не се появяват тератоми. Предполага се, че загубата на способността на човешките EG клетки да инициират тератоми се дължи на факта, че тези линии не са създадени директно от култивирани първични зародишни клетки, но са получени от клетки, изолирани от ембриоидни тела. Следователно е възможно те да са потомци на плурипотентни, но вече ангажирани клетки.

Трябва да се отбележи, че съществуват фундаментални разлики между EG клетките и първичните зародишни клетки. Последните не правят възможно получаването на химерни ембриони на мишка, което показва липсата на способност на първичните зародишни клетки да се интегрират във вътрешната клетъчна маса или трофектодерма. Особености населението първични зародишни клетки, подобни на най-соматични клетки от извършени линии късните ембрионите, въвеждането на който в бластоцист също води до образуване на химерни ембриони.

Модификация техники култивиране на ембриоидни тела, получени с EG-агрегация на клетки, позволени от селекция на селективна среда, за да получи друга популация от плурипотентни клетки, наречени "клетки, получени от ембриоидни тела (получени клетки ембриоидни тялото - EBD-клетки). Способността на EBD клетките да се размножават в продължение на дълго време в културата позволяват да се създават стабилни клетъчни линии на ангажирани клетки. Бяха получени клонове на клетки, експресиращи широк спектър от mRNA и белтъчни маркери на специализирани клетки. Този подход в резултат доказва, че основната секс човешки плурипотентни клетки, и се диференцират в ин витро в различни клетъчни типове: неврони, глия, съдов ендотелиум, хематопоетични клетки, мускулни и ендодермалните клетки.

Алтернативни източници на ембрионални стволови клетки

Алтернативен източник на човешки ESC линии може да бъде хибридни клетки. Имплантиране в матката на структура псевдобременни крави geterogenomnoy получена при сливане чрез електропорация fetusa човешки соматични клетки с крави яйца, които преди това са били отстранени от проядрата, дава възможност да се получи вътрешна клетъчна маса на предварително имплантиране ембрионални изкуствени стадии на развитие. За тази цел, в първия етап се получава от краве бластоцист яйце с трансплантиран човешки клетки ядро.

Във втория етап ембриобластът се извлича от бластоциста и от него - ESC по метода Thomson. Забележително е, че най-добри резултати в разделяне ESC линии по този метод, са получени при използване ядра на фоликуларни клетки или първични зародишни клетки, които съществуват в човешкото тяло в състояние на хибернация. Това се дължи на факта, че яйце краве трансплантиран човешки клетки ядро neukorochennye трябва да има висока активност и теломерите telomeazy че избягва преждевременно стареене ESC клонинги получени от хибрид яйце (Репин, 2001). Известно е, че най-важните вътреклетъчни маркерни протеини PGCs са Oct3, Oct4, TCF, Groucho, които принадлежат към така наречените шумозаглушители, хроматиново протеини. Заглушителите осигуряват особено компактно опаковане на хетерохроматин, което предотвратява образуването на епруветки от евхроматин. Пакетът от хроматини, медииран от тези протеини, корелира с активността на ESC генома. Досега е установено, че зрелите овули от едър рогат добитък и хора са единственият тип специализирани клетки, съдържащи високи концентрации на протеини за заглушител в цитоплазмата. На тази основа беше разработен метод за производството на хибридни ESC чрез прехвърляне на соматични клетъчни ядра в не ядрени овули от крави. Предварителни in vitro проучвания показват, че цитоплазмата на яйцеклетките от крави възстановява жизнеността на човешкия соматичен клетъчен ядрен геном за 12-24 часа от култивирането.

Особен интерес представляват данни за характеристиките на преимплантационното развитие на човешки ембриони, които показват по-късна замяна на фактически клетки от популация от плурипотентни клетки, отколкото от мишки. Изследването на клетъчните трансформации показва, че клетките на вътрешната клетъчна маса на човешкия бластоцист, в допълнение към ESC, също генерират трофобластни клетки, което показва тяхната обща сила.

Известно е, че на етапа на бластоциста има две различно ангажирани клетъчни популации. Един от тях е външният слой на бластоциста, трофедедром, получен от трофобластни клетки и други компоненти на ембрионалната плацента. Втората популация от клетки се групира в плътна маса, която влиза в контакт с вътрешната повърхност на трофектодермата. Клетъчната популация на вътрешната клетъчна маса се получава от всички тъкани и микроби на ембрионалните органи. На етапа на късния бластоцист се образува екстра-ембрионален ендодерм от вътрешната клетъчна маса и се образува епибласт (първичен ектодерма). В същото време, епибластните клетки запазват плурипотентността, докато способността за диференциране на клетките на екстра-герминалния ендодерм е ограничена.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Получаване на човешки ембрионални стволови клетки

Доскоро се смяташе, че фобластната получена от hESCs невъзможно. Въпреки диплоидни линия trophectoderm стволови клетки, изолирани от бластоциста в среда, която съдържа, вместо LIF и FGF2 хепарин, пролиферира и се трансформират в стволови клетки. Ако премахнете от средата на FGF2, trophectoderm клетки спират разплод, те започват ендоредупликация на хромозомите и клетъчни елементи trofektodermalnye постепенно се превръща в гигантски трофобластни клетки. Вероятно, LIF не стимулира пролиферацията на trophectoderm клетки се дължи на факта, че FGF2 задейства механизъм transsignalizatsii като FGF2, свързване с цитоплазмения рецептор (FGFR2), активиране на MAP киназа в цитоплазмата - ERK1 и ERK2. Следователно, когато са включени в клетките на бластоциста на един сигнален път (LIF - gpl30 - JAK-киназа - STAT3) вътрешните клетъчна маса клетки се трансформират в плурипотентни hESCs, докато активирането на втория механизъм на трансмембранен сигнализация (FGF2 - FGFR2 - MAP кинази ERK1 / ERK2) стволови клетки в trophectoderm на бластоцист оформен. Избор на сигналния път, на свой ред, зависи от активността на гена oct4. Този ген, принадлежащ POU домен, разположен в мястото т 17 автозоми и се изразява по време на овогенезата, в период раздробяване, както и в клетки на вътрешната клетъчна маса на бластоциста, и по първични полови клетки. Функционална роля oct4 ген, кодиращ транскрипционен фактор, необходима за поява на плурипотентни клетки, тяхната диференциация и дедиференциация.

Експресията на oct4 гена в ESC варира в зависимост от взаимодействието на този транскрипционен фактор с кофакторите. Насочената регулация на експресията на oct4 в бластоцистите показва, че когато неговата активност намалява, половината от клетките образуват трофектодерма, докато с увеличаване на индуцираната експресия на oct4 се наблюдава предимно ESC.

В експеримента, ESC не може да преведе в ред чрез култивиране на стволови бластомери разцепване етап и при gastrulation на сцената и по-късните етапи на ембрионалното развитие. Mouse ИСС обикновено разпределят най-3.5-4.5 дни на бременността, което съответства на шести (единичен слой на бластоциста) и седмата етапи (двуслойни на бластоциста - ранен яйце цилиндър) нормална ембриогенеза. Очевидно е, че само в преимплантационния период ембрионите на мишките съдържат клетъчни популации, които могат да бъдат трансформирани в ESC. Следователно изолирането на линиите ESC е възможно само при определени стадии на ембриогенеза. Тотопотентен, от гледна точка на възможностите за развитие на жизнеспособен ембрион от ембрионални мембрани и плацента са зиготата и произтичащи по време на смачкване бластомери. Загубата на общата ефикасност на зародишните клетки започва в края на морулната фаза, когато по-нататъшното раздробяване на бластомери зависи от тяхното местоположение. Ранните блатомери запазват действеност, защото експерименталните манипулации с промени в тяхното местоположение, например, обръщане на тяхното местоположение, не пречат на развитието на пълен ембрион.

Установено е, че ефективността на освобождаването на ESC в линията е повлияна от състоянието на бластоцистите по време на имплантирането им. Използването на бластоцисти след седем дни симулация на diapause в гениталния тракт на мишки, при овариектомирани 3.5 дни от бременността и се обработва с прогестерон, допринася за по-успешното разделяне на линии на ембрионални стволови клетки. Предполага се, че при такива условия броят на бластомерите, образуващи вътрешната клетъчна маса, се увеличава. Също така е възможно клетъчният цикъл да се простира и повечето бластомери да навлизат в G0 фазата.

Освен това, създаването на стабилни плурипотентни hESC линии зависи от ембриони на генотип: доста лесно различава от ЕСС миши бластоцисти линия 129, е значително по-трудно да се получи, използвайки мишки CS7BL / 6 и почти невъзможно да се изолира линия от hESCs бластоцисти CBA / Ca мишки. Очевидно, ранните ембриони притежават някои генетични характеристики, които влияят върху развитието на плурипотентната линия на ЕСС. Въпреки това, когато се култивират epiblast изолация, както и от селективен подбор диференциране hESCs клетъчна линия от ранни ембриони са все още разпределени CBA / Ca мишки.

Доказана стандартна техника за получаване на ESK линии от бластоцисти е дадена в лабораторни ръководства за техниката на експеримента с ранни ембриони. Експерименталните ESK линии могат да се получат и чрез култивиране на изолиран епибласт (първичен ектодерма) от 4,5-дневни миши ембриони с доста сложна микрохирургична техника и модифицирани условия на култивиране. Сложността на тази процедура е оправдана, тъй като честотата на формиране на ESC линии е много по-висока, отколкото при работа с вътрешната клетъчна маса на бластоциста.

За да се изолират линиите ESC, всеки клонинг се прехвърля в микро-гнездо, а агрегат от 40-60 клетки се отглежда, отново се диспергира. Множество повторения на тази процедура дава възможност за получаване на обезсмъртена ESK съответствие с максимално normokariotipnyh клетки процент пролиферация, свързани с пластмаса, която през пасажи 50-100 запази totipotency и високо теломеразна активност. В процеса на подкрепа линии ESC най-голяма опасност от замърсяване или серумни бактериални ендотоксини - дори следи от концентрация ендотоксин в културалната среда, причинени маса смърт на незрели зародишни клетки. С внимателен контрол на растежа на линейни и навременното дисперсията на ИСС в областта на културата са в състояние да симетричен разпад, при който и двете дъщерни клетки остават плурипотентни и могат да извършват неограничен брой клетъчни цикли, поддържане на диплоиден кариотип и общата ефикасност.

Изборът на чиста популация от човешки ESC може да се извърши след трансфекция в техния геном на рекомбинантни ДНК молекули, съдържащи ген, кодиращ синтеза на зелен флуоресцентен протеин (GFP). Експресия на GFP се увеличава с нарастващ ЕСС в среда подкрепя тяхното пролиферация, като началото на диференциацията на нивото на генна експресия се намалява, което позволява избрани на селективна среда чисти стабилни, плурипотентни клетъчни линии. Когато се култивира с GFP селекция на ESCs, честотата на колониите се увеличава значително, тъй като при условията на селекция на културите мощният антипролиферативен ефект на диференцираните клетки се елиминира.

Превод на човешки ембрионални стволови клетки в съответствие с помощта на техния метод на изолиране на предимплантационни ембриони (стъпка 80-120 клетки), които остават след ин витро оплождане процедура. За тази синтетично получени "излишък" ембриони механично диспергирани в иглата средносрочен Delbekko. След маркиране на клетки с моноклонални антитела селективни флуоресцентен маркер embryoblast изолирани клетки. Embryoblast диспергира в единични клетки със смес от колагеназа-диспаза. Дисоциираните клетки се отглеждат в специална среда (80% Delbekko среда + 20% фетален телешки серум в присъствието на 500 ug / мл IL-6, LIF и SCF) върху монослой от ембрионални фибробласти захранващото 3 първите пасажи. Така оцеляване и пролиферация на стволови и потомствени клетки се поддържа чрез излагане на IL-6, LIF и SCF. В тази среда, hESCs за окачване растат клонове osharennyh неприкрепени клетки се отделят чрез внимателно пипетиране множествена. Нови клонове се появяват в суспендираната култура на 5-7-ия ден. Максималната скорост на растеж постига ESK повтаря клонове дисоцииращи стъпка 10-15 клетки. След това, всеки клон се прехвърля в микро клетки и израснал в съвкупност от 40-50 клетки. Процедурата се повтаря много пъти в проходите, увеличаване на обема на културата до плътност от 5-10 милиона клетки за 6 см блюдо. Чрез използването на такова Thomson пренасяне това се изолира 10 клона безсмъртни човешки ЕСС който през пасажи 100 запазват високо теломеразна активност, способността за интензивна пролиферация и фенотипни характеристики минимум общата мощност, с диференциация в някоя от 350 специализирани клетъчни линии, които са получени екто-, мезо- - и ендодерма. Диференциацията на човешки ESC започна (при смяна на средата, добавяне и премахване на серум LIF) с клетъчна прикрепване към субстрата, което показва развитието на цитоскелета и експресията на адхезионни рецептори. Важно е, че неограничената пролиферацията на човешки ИСС поддържа нормален кариотип.

Вторият метод за изолиране на линии на човешка ESC се основава на използването на първични полови клетки. Експериментални проучвания показват, че Eu-клетъчните линии могат да бъдат получени от гениталните плаки на 12,5-дневни ембриони от мишки. Въпреки това, в тези случаи честотата на образуване на клетъчните линии на прогениторни клетки е значително по-ниска, отколкото в експериментите с по-ранни ембриони. В същото време, първичните полови клетки от гонада на миши ембриони на 13,5-дневна гестационна възраст като цяло не са в състояние да се трансформират в линии.

Първите стабилни линии на плурипотентни човешки EG клетки бяха получени от първични гоноцити, изолирани от гениталните пъпки на ембриони на възраст 5-9 седмици. Изолираните клетки бяха култивирани върху субстрат на инактивиран миши ембрионални фибробласти в DMEM среда с фетален серум, към който се прибавя меркаптоетанол, форсколин, както и рекомбинантни човешки растежни фактори (FGF и LIF). След 7-12 дни се появяват многоклетъчни колонии в култура, според морфологични характеристики и молекулни маркери, съответстващи на човешки EG клетки. След агрегацията тези клетки образуват ембриоидни тела, с по-нататъшното развитие на които се появяват специализирани клетки, характерни за производните на трите ембрионални листа. През 10-20 пасажа EG-клетъчните линии запазват нормалния кариотип и не губят плурипотентност.

Също така е показано, че комбинираният ефект на LIF, мембранно-свързани и разтворими стоманени фактори, както и на TGF-b, променя програмата за развитие на първични зародишни клетки. Вместо да спират митотичните деления и започват да се диференцират към оогенеза или сперматогенеза, първичните полови клетки продължават да се размножават. След няколко допълнителни митотични цикъла те стават подобни на епибластните клетки и загубата на свойствата на прекурсорите на зародишните клетки се трансформират в pluripotent ембрионални стволови EG клетки.

Така, през 1998 г., обезсмъртени линии на първични сексуални клетки се изолират за първи път от сексуалната рудимента на човешката плодова аутопсионна тъкан. В ембриогенезата на човешки първични полови клетки се появяват в сак жълтък през третата седмица на развитие, както и върху 4-5th седмици, тези клетки да мигрират в областта на сексуалното туберкул, където те образуват населението на първични dormantnye gonocytes. В неактивно състояние, първичните зародишни клетки остават в пъпките до раждането. Първичен зародишни клетъчни линии бяха екстрахирани от фетални генитален Туберкулозните 5-9-седмична възраст ембрионите извлечени ех Tempore плат, който се обработва със смес от колагеназа тип IV-V, хиалуронидаза и дезоксирибонуклеаза за количествен и качествен добив увеличение клетка. Първичните зародишни клетки в тъканите на зародишните генитални тубури са заобиколени от Sertoli стромални (мезенхимни) клетки. Функционално предназначение на Сертоли клетки е производството на анти-апоптотичните фактори (Fas-лиганд), митогени и имуносупресивни агенти, които защитават сексуални стволови клетки от имунната атака от организма. В допълнение, стромната микросреда на гениталната туберкула играе важна роля при узряването на гамети. Изолираните първични зародишни клетки се засаждат в културата върху захранващия стромален слой, състоящ се от феталните фибробласти от първите три пасажа. Най-ефективната комбинация от митогени е комплекс, състоящ се от LIF, FGF и форсколин (стимулант за образуването на сАМР). Пролиферация първични полови клетки ин витро изискват добавяне на зародишен серум, в присъствието на първичен възпроизвеждащи gonocytes в култура клонове придружени от образуването на глобуларни, неприлепналите клетки към субстрата.

Американските Националния институт по здравеопазване на базата на обобщаване на наличната информация относно методите за разпределение на човешките ESC линии от бластоцисти е направена предварително заключение, че успешното разпределяне на ИСС е най-вероятно, когато култивирани бластоцисти с добре оформена вътрешна клетъчна маса (стволови клетки: научния прогрес и бъдещи изследователски направления Nat. Inst, на Health USA). От тази гледна точка, най-добрият източник на ИСС за създаване на линии са човешки бластоцист пети ден на развитие, от които разпределението на вътрешната клетъчна маса трябва да бъде внимателно извадете trophectoderm. Изолиран вътрешна клетъчна маса, състояща се на този етап от 30-35 клетки трябва да бъдат култивирани върху субстрат миши ембрионални фибробласти, което е решаващо условие за образуване на колонии в култура hESCs.

Анализ на фенотипните характеристики на ембрионалните стволови клетки

Определен интерес междувидовата сравнителен анализ на фенотипните характеристики на ИСС. Установено е, че човешките ESC колонии - гъста клъстери от плоски епителни клетки, докато мишки ембриоидни прасеца състоят от насипен конгломерат от заоблени клетки. В човешката индекс ESC ядрената плазмената съотношение е по-ниска, отколкото в мишка ЕСС. Ембрионалните стволови клетки от маймуни образуват по-плоски клетъчни колонии с неравномерни краища. В ранните клонове на ESC примати, единични клетки се виждат лесно. Пролифериращите hESCs всички видове животни не експресират МНС клас I и II. В същото време, човешки ЕСС дават положителен отговор на антитела ТЕРА 1-60 и GCTM-2, което показва наличието на тяхната повърхност кератин / хондроитин сулфат протеогликани, характеристика на ембрионалното (тератоми) -kartsinomnyh стволови клетки. Експресия в hESCs всички видове животни oct4 ген показва, че въпреки фенотипни различия в човешки и миши ЕСС, очевидно активира от същия набор от гени, отговорни за поддържането на плурипотентност (Перу, 2001). В допълнение, линиите ESC получени от ембрионални плъхове, свине, зайци, примати и говеда, имат сходни морфологични характеристики, подобен набор от молекулно идентифициране на маркери и почти идентичен молекулярен механизъм за изпълнението на програмата на ембриогенезата, че позволява да се вземе нов поглед към въпроса за ксенотрансплантация ,

За разлика от нормалната ембриогенеза ин виво, ин витро пролиферация на hESCs не е съпроводено с образуването на зародишни слоеве и продължава в блок хомеотични Nohgenov фон, т.е., без органогенезата. Тъй сегментиране гени не функционират в култура hESCs невъзможно да се възпроизведе такива периоди ембриогенеза като раздел сегмент сегментиране на ядрото, формирането на жълтъчната торбичка, алантоиса условно и други органи и тъкани. Културните ESC бяха замразени в началото на образуването на 350 ограничаващи линии на специализирани клетки. Така, клон спомагателни прогениторни клетки и централно локализирани PGCs са само модел на ембриони по време на развитието, в която различни региони тъкан са оформени в един етап са различни от специализирани клетки, получени, обаче, от общи прекурсори. Въпреки че минималното ниво на рецептори на повърхността на hESCs, те запазват способността да изпълнява примитивни морфогенетични процеси симулиращи голямата част от началото структура ембриони: суспензия hESCs в култура и агрегати образува структура, наподобяваща бластоцист или дори по-късно ембриони (яйчни цилиндри). Такива суспензионни агрегати са подходящо наречени прости и сложни ембриоидни тела.

При смесване диференцират в различни клетки на ембриоидни тялото едновременно изразени от началото на гени ектодерма (Oct3, FGF-5, възловата), ендодерма (Гата-4), мезодерма (brachyury), кардиогенен мезодерма (PKH-2,5), невралната тръба (msx3 ) и хематопоеза (elkf). Използването на различни комбинации на цитокини и растежни фактори за насочване образуване на зародишен слой клетки ин витро в редица случаи е възможно да се получи ембриоидни тела, които за предпочитане са експресирани гени ектодерма или мезодерма, която отваря пътя за моделиране на gastrulation и фаза рано органогенезата.

Клонираните растеж на hESCs доказателства за асиметричен деленето на клетките, в които само един от ESC в център клон запазва неограничаващ капацитет възпроизвеждане, а другата дъщеря клетката води до генериране на прогениторни клетки, диференциация вече идва инча Следователно, скоростта на умножение на клона в периферията на ембрионалното тяло е по-висока, отколкото в центъра. Гранични клетки, растящи клон претърпяват спонтанно диференциация на смущения мигрират или умират от механизми апоптоза. Тези събития определят съдбата на клона, ако скоростта на пролиферация надвишава скоростта на миграцията и апоптична клетъчна смърт, клон размери продължават да се увеличават, стабилизиране случва с равен апоптоза и скоростта на образуване на нова скорост клетка, регресия - обратната съотношението на тези процеси. Прогениторните клетки се делят симетрично, т.е. Двете дъщерни клетки допълнително се диференцират в зрели специализирани клетъчни линии. Съотношението на ESC / прогениторни клетки варира, но винаги е броят на PSCs е само част от един процент от населението на прогениторни клетки. Поради това само внимателното пипетиране и своевременното деагрегиране на клонингите може да увеличи броя на ESC в културата. Категоризация клонове се появява в етап 10-12 клетки най-ефективни за да се получи максимално hESCs добив. Насочването и степента на диференциация на клетките в ембрионалното тяло зависи от тяхното местоположение. Външни ембриоидни телесни клетки не експресират гена и oct4 претърпят диференциация в първични клетки от ендодермата които впоследствие образуват епителоидни клетки и париетална екстраембрионалната висцерална ендодерма. Вътрешни ембриоидни телесни клетки експресират oct4 запази плурипотентност ген и в рамките на 48 часа култивиране. Но тогава морфологичен оздравяването настъпва в епителната монослойна култура започва и експресиране на гените, които контролират развитието на първичен ектодерма. Освен това, процесът на общия нарушено цитоделене започва с появата на различни клетъчни типове, които са производни на трите зародишни слоя. В процеса на спонтанно диференциация на ембриоидни телесни клетки първо възникне агрегати ендодермата маркери под формата на фрагменти (кисти) жълтъчната торбичка. Освен това, ангиопласти и ендотелиални клетки от нарастващи капиляри се появяват в тези структури. В последните етапи на спонтанно диференциация на вътрешните клетки на тялото ембриоидни развива различни терминално диференцирани клетки, включително неврони, глиални елементи, кардиомиоцити, макрофаги и еритроцити. В някои приближение (това пространствен инверсия на листове, образуващи ембрионална тъкан) чрез ембриоидни тела ин витро могат да изследват морфогенетични процеси и анализ на молекулярните механизми на ембрионалното цитоделене първоначален период, и да се установи ролята на специфични гени в изпълнението на тези процеси.

По този начин в рамките на клона са клетки, в които са открити различни програми за генетично развитие - ESC, ранни прогенитори и диференциращи прогениторни популации. Култивирането на ESC чрез методите на намаляваща капка или масова култура без захранващ слой и без добавяне на LIF в средата неизбежно води до образуването на ембриоидни тела. Морфологията на клетките на външния и вътрешния слой на ембрионалните тела е различна. Външният слой се състои от големи, процесни клетки. Тяхната повърхност, обърната към околната среда, е покрита с многобройни микрони. Външният слой от клетки се отделя от вътрешната базална мембрана, наподобяваща мембраната на Reichert, докато клетките на вътрешния слой на ембриоидните тела са цилиндричен епител. Морфологично, вътрешният слой, макар и съдържащ много разделителни клетки, повече напомня на недиференцирани колонии на ESC.

Характеристики на човешки ембрионални стволови клетки

Липса на паренхимни-мезенхимни взаимодействия в фоновия сигнал блокиране гени homeosis причинява нарушен растеж на PGCs в култура, тъй като този раздел е счупен и образуване инфраструктурни условно органите на. Неорганизирано растеж и безредно спонтанна диференциация на hESCs в областта на културата, поради липса на мезенхимни маркиране на стромата рамка на бъдещите органи: ин витро, че е възможно образуването на милиони хепатоцити, но не можете да си спестите сегменти на черния дроб, включително и такива структурни и функционални елементи като синусите, пространството на Disse и Купфер клетки.

Смята се, че плурипотентност на ЕСС реализира само в ембриогенезата да образуват тъкани и органи на ембриона, докато пъпната връв и плацентата са получени трофобластна. Поставени в черупка trofektodermalnuyu ESK последователно генерират клетъчни клонове условно осъзнават програма за развитие чрез комбинаторни иРНК насипно Nohteyaov топографска матрица, които предопределят пространственото подреждане, формата, размерите, броя на временни и окончателни клетки органи и паренхим възел в структурна и функционална единица. В същото време на ESC са само типа на клетката, в която молекулният механизъм на реализация на техните потенциали напълно отделена от генетичната програма на развитие и ЕСКО се лишен от възможност за взаимодействие с други клетки се дължи на блокиране на двете възприятия рецептор и transsignalizatsii системи. Въпреки това, подходящи за активиране ИСС резултати в постепенното ембриогенезата разгръщане програма край раждане е напълно оформени и готови за извънматочна живот на един организъм, съставен от милиарди клетки. В този кратък период от време, но невъобразим дълг в клетъчната пространство път неизбежна появата на грешки в молекулярните механизми, които осигуряват жизненоважни функции на клетките, както и в програмите, които контролират тяхната пролиферация, диференциация и специализация. Ето защо, в модерни когеномни разглеждат отделно заболяване молекулни устройства, както и анемия програмиране. И действието на по-голямата част от новите лекарства, насочени към коригиране на името на програмата на диференциация, пролиферация и органогенеза, както и възстановяването на органи и тъкани. В организма на възрастен чрез ЕСС става възможно да се контролира поведението на стволови / прогениторни клетки, трансплантирани в мозъка, черния дроб, далака, костния мозък и други органи на човека, за да се ремонтира повредени паренхимни органи получатели поради диференциация и специализация донор мезенхимни клетки консервирани матрица. По същество, totipotency програма стартира още на овоцити на генома ниво, зиготи и бластомери, но тези клетки все още не е възможно да се клонира и пасирани, в необходимите количества за нуждите на experiental и практическа медицина. Затова ИСС е уникален източник на генетичната информация, съдържаща триизмерен линеен ограничение карта на ембриона и кодовете на специализирани клетъчни линии по време на gastrulation.

Почти неограничени възможности за рекуперативно ESC се дължи на факта, че техния геном, за разлика от генетичния апарат на диференцирани соматични клетки, поддържа плурипотентност. Една проява на пасивно състояние корени в ИСС генетична информация е така наречената минимална фенотип - на повърхността на ИСС на изразяване на ограничен брой рецептори, и по тази причина разположени много малко програми, за да си взаимодействат transsignalizatsii ядрен апарат на клетката с неговата микросреда. На фона на хибернация гени, отговорни за ограничаване на специализирани клетъчни линии и диференциация на клетки, активирано само 30 от 500 гени, чиито продукти осигуряват комуникационни клетки с заобикалящата я микросреда. Използвайки метода на получаване на сериен анализ на генната експресия показва, че общият на основните функционални геномни кутии регулиращи енергия и метаболизъм в соматични клетки и ЕСС в последния определя изключително ниско количество на иРНК на рецептори, G-протеини, вторични посредници, транскриптази, кофактори изразяване и репресия , т.е. Цялата система на трансмембранен трансфер на регулаторния сигнал в клетката. Това се дължи на липсата или много ниското изразяване на гени за транссанализация. По време на диференциацията индуцира в генома на ESC 18 операция се спира синхронно функционира гени за активирането transsignalizatsii 61 ген контролиране на синтезата на клетъчни адхезионни рецептори, извънклетъчни матрични компоненти, ограничение транскриптази messendzhernyh елементи и предаване на сигнала система за ядрено устройство с клетъчно-мембранни рецептори плазмените. Едновременно блокирана експресия на гени, отговорни за синтеза на протеини шумозаглушители, както и генна експресия koingibitorov осигуряване totipotency геномни hESCs.

Генетични маркери са открити за клетките на трите ембрионални листовки. Идентификация ектодермален клетъчен слой извършва върху експресията на гени възлова, Oct3 и FGF-5, мезодерма клетки - ген brachyury, зета-глобинови, ендодерма - в Гата-4 генната експресия. При нормална ембриогенезата, по време gastrulation наблюдава активно миграция на незрели популации на стволови и потомствени клетки, локално определяне области на лицевите кости на черепа, някои части на мозъка, периферната нервна система, сърдечно система проводимост и тимус тъкан, които са образувани от клонове разселени клетки. Етикетиране клетка ранните гени зародишни слоя улеснява топографски анализ на миграция на прогениторни клетки в развиващия се ембрион. Установено е, по-специално, че клетките в агрегати embryocarcinoma P19 експресия на първия ген мезодерма brachyury започва по време на намаляване на генната експресия на тъканен плазминогенен активатор, а-фетопротеин, кератин 8 и кератин 19, които са маркери за ранно ме-зодермалните мигриращи популации. Следователно, образуването на тъкани от мезодермален произход започва едва след процеса на миграция и точка утаяване мезодермален прогениторни клетки.

С изключително ограничени фенотипни характеристики и липсата на повечето блокове transsignalizatsii ESC въпреки това експресират някои рецепторни молекули, които могат да бъдат използвани, за да ги идентифицира. Забележително е, че антигените са маркери за ESC при хора и примати са чести. Най-често се използва за етикетиране hESCs белязани антитела антигени membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (уникални липидни антигени, представляващи комплекс гликолипид GL7 с сиалова киселина), както и високо полимерни гликопротеини TRA-1-81, TRA-1-60. Освен това, hESCs експресират специфични ембрионален антиген SSEA-1 и ендогенна алкална фосфатаза, както и специфичен транскрипционен фактор Oct4. Последното е необходимо за поддържане hESCs механизми пролиферация - специфичен транскрипционен фактор Oct4 ген активира експресията на фибробластен растежен фактор 4 генната експресия и стабилизира бокс отговорен за неограничаващ ДНК удвояване в незрели клетки. Най-важните вътреклетъчни маркерни протеини са Oct3, Oct4, TCF и Groucho, свързани с протеини на хроматин-шумозаглушители.

Почти веднага след дългосрочните култивирани опитите ИСС е неуспешна и организма първо се получава чрез култивиране на стволови клетки, изолирани от миши бластоцисти и първичен зародиш клетъчна култура, започва етап на обучение капацитет ESC плурипотентни, когато се прилага в ранните етапи на развитие на ембриона. Показано е, че в морула и бластоцист PGCs са способни да образуват химерни ембриони в която потомци донори PGCs открити във всички соматични тъкани и дори в гамети. Така, в развитието Biology използване ESC включили "мост" между експерименталните изследвания ин виво и ин витро, което значително увеличава възможността за изучаване на процесите Маркери първични тъкани и органи, тяхната диференциация и ембрионален органогенезата.

Установено е, че ин виво по време на ембриогенезата ESK интегриран в клетъчната маса на началото на ембриони и техните производни са намерени във всички органи и тъкани. PGCs колонизират бактерийна линия на химерен зародишни клетки, потомци на които образуват пълен яйце и сперматозоиди. Ембрионалните стволови клетки са клоногенни - единични PGCs могат да създадат генетично идентични на колония от клетки с молекулярни маркери, които включват oct4 генна експресия и алкална фосфатаза, високо теломеразна активност, както и експресия на специфични ембрионални антигени.

За изследване на механизмите на ембриогенезата, използвайки техниката на hESCs химеризация морула чрез създаване на биологична структура, която се намира извън слой тетраплоидни бластомери реципиенти и донори PGCs се прилагат в. По този начин, трофобластна образуван от потомството тетраплоид бластомери получател, който позволява на имплантацията и плацентата и донори PGCs, действащи като вътрешна клетъчна маса, която се образува от жизнеспособна зародишната линия на първичните тялото и потомствени гамети. Проучване ESC стойност се крие не само в това, че когато манипулация ин витро с техния геном запазва плурипотент, но и в това, че като запазва способността да участва в образуването на hESCs изначалната половите клетки на химерно ембриона. Показано е, че само един потомство на генетично модифицирани PGCs колонизират всички първични и микроби, които плат химерен на ембриони, получени чрез обединяване или съвместно отглеждане на клетките с 8-клетъчна ембрион. Когато трансплантирани в мишки морула ЕСС трансфектирани с зелен флуоресцентен протеин ген, флуоресцентни потомци на клетките бяха открити във всички изследвани тъкани на развитие на ембриона (Shimada, 1999). Трансплантация на ESC в морула може да създаде жизнеспособни мишки, тялото на която се състои единствено от потомци дарени на ИСС, което открива възможности за различни терапевтични възможности за клониране. Сега като методичен подход се прилага успешно за изследване на проблемите на биологията на развитие, по-специално, тя може да анализира генетични механизми на инактивиране на X хромозомата или епигенетични нестабилността на hESCs. Трансплантацията на ESC в ранния ембрион се използва и в биотехнологиите в селското стопанство, както и в експериментите за генна терапия.

Трансплантации на генетично модифицирани ЕСС се използват за тестване на прицелните клетки на мутантни гени. In vitro култивираните ЕСС се използват в биотехнологията за създаване на knockout мишки. За тази цел, чрез хомоложна рекомбинация, за да бъде отстранен от ЕСС проучване ген (нокаут) и селективна среда отделят клетки липсва този ген. След това се правят инжектиращи ESCs в бластоциста или се агрегират с бластомери на морула. Така получените химерни ранни ембриони се трансплантират в женски получател и новородени мишки избрани между индивиди с гамети, nullizigotnymi на този ген. Според тази технология, създадена много линии на мишки, които са широко използвани в експериментална биология и експериментална медицина. В тези биологични модели проучен стойността на някои гени в ембрионалното развитие, както и тяхната роля в механизмите на заболявания и патологични състояния при хора. Освен това, линията на нокаут животни, използвани по време на етапа на предклинично изследване на нови методи за генна терапия. Например, като се използва генна трансфекция в ESK нормален алел на мутантния ген ефективно управление коригира мутация, удари система хемопоетичен. Въвеждането на чужди гени в ЕСС позволява бързо създаване на линии хомозиготни трансгенни лабораторни животни. Все пак трябва да се отбележи, че техника, насочена рекомбинация генно на надеждно разработен все още относително ESC мишки. Използване на миши ЕСС двойно разрушаване инсталиран функционална роля площ група от гени върху хромозома 7 (копие геномна област 19 минути човешката хромозома) и проксималната част на хромозома 11 (копиране човешка хромозома 5г) - заличаване на тези гени в ESK мишките са позволили да оценят функцията на техните аналози при хора.

Изследванията на функционални капацитет на човешки ембрионални гени, трансфекция в ген, който лабораторни животни право hESCs по-специално крипто изясняване на ролята на гена в раздела и образуващи кардиогенен мезодерма, ма-6 гена - в ембриогенезата око. Представлява първата експресията на гени в незрели пролиферативни карта ESC тератокарцином и бластоцист мишки потвърди преобладаващото репресия в ESK transsignalizatsii гени. Комбинацията от мутирали ИСС 60-80 и 20-30 клетки на нормални ембриони мишка води до развитието на химерични ембриони, в които маркерите тела са съставени от донор и реципиент клетки, която ни позволява да се определи ролята на неизвестни гени в gastrulation и органогенезата. Функционална карта на генни разработване миши ембриони уголемени детайли на ролята на ген раздела SF-1 в надбъбречната жлеза и генитално primordia, WT-1 гена - в бъбреците раздела Myod семейството гени - в раздела на скелетната мускулатура генно семейство Гата-1-4 - в ограничение узряването на основите на еритро- и лимфопоезата.

Режисьор на разстояние от майчина и бащина алели на гени в hESCs използващи вектор на рекомбиназа служи за изясняване на функциите на различните гени по време на ранната ембриогенеза и технология за насочване на човешките неизвестни гени в мишка ИСС допринесе за откриването на нови мутирали гени, отговорни за развитието на тежки наследствени заболявания. Използвайки метод нокаут дефинирани облигатен значение на някои гени за полагане ембрионални тъкани: Гата-4 - на миокарда, Гата-1 - еритроид хемопоетичен тъкан, Myod - скелетната мускулатура, brachyury - за мезодерма ограничение транскриптази hnf3 и hnf4 - за чернодробни стволови клетки, парцал-2 - маркери за клонинги на Т и в-лимфоцити (Репин, 2001). Двойна заличаване на гени в hESCs отвори достъп до изучаването на функционалната роля на гените на зародишен слой, сегментирането и homeosis и присаждането ESC се има предвид възможността за получаване на надеждни междуспецифичните хибридни ембриони. С подобрени методи за трансплантация на донори PGCs в един 8-клетъчна ембриони доказано, че химеризацията на клетъчно ниво на много органи на ембриона получател. Имайте предвид, че клетъчни кълнове са открити в тъкани реципиент мишки органи на човека след прилагане на човешки хематопоетични стволови клетки в бластоцист. Установено е, че в миши ембриони по време на формирането на кръвоносните органи, които се движат плурипотентни hESCs. Възможно е тяхната биологична функция да е в ембрионалната организация на бъдещата имунна система. С ESC ин витро възпроизведен подходящи модели на човешко генетично заболяване: двойно нокаут модели гена на дистрофин при мишки на мускулна дистрофия на Дюшен, ген изключване атм (управляващ сигнал синтеза киназа хроматин) - атаксия-teleangektaziyu. В този случай, фатална наследствено заболяване при деца поради дефекти в възстановяване на ДНК развива дегенерация на Purkinje клетки в малкия мозък, което е придружено от инволюция на тимус, поради смъртта на пролифериращи клетки. Клиника, патофизиологията и patomorfologija атаксия-teleangek- tazii възпроизведени чрез въвеждането в ESC анормален генетична информация от мишки химери съответстват на тези при хора. Освен атаксия-teleangektazii използване PGCs и нокаут мишки разработен експериментален модел, някои наследствени хомозиготни човешки заболявания, свързани с нарушения на въглехидрати и липидния метаболизъм, катаболизъм на аминокиселини, отстраняване на мед и билирубин, което значително увеличава възможността за експериментално лекарство за предклинично изследване на нови методи за лечение на съответните заболявания човек.

[12], [13], [14], [15]

Използването на цитохибридни стволови клетки

Клетките хибридни получени чрез сливане на соматични клетки от hESCs, са подходящи и обещаващ модел за изследване на стволови клетки са плурипотентни и препрограмиране на диференцирани клетъчни хромозоми. Tsitogibridy получено от сливането на ESC с диференцирани клетки на животното за възрастни, предоставя възможност за изучаване на връзката между геномите на различни "възраст": разработва уникална ситуация, в която хомоложните хромозоми, получени от клетки на различни етапи на диференциация, както и различна степен на зрялост, са в същото ядро, където те могат лесно transdeystvuyuschimi споделят регулаторни сигнали. Трудно е да се предвиди как ще реагира tsisregulyatornye епигенетичния система на хомоложни хромозоми съществуваща по време на ин разделим развитие, в отговор на въздействието transdeystvuyuschih сигнали от ембрионални свързани геноми. Освен това, в хибридните клетки настъпва разделяне на родителски хромозома, която позволява да се проучи взаимодействието на геномите на отделни ниво хромозома, т.е. Потенциално идентифицира част на специфични хромозоми в поддържането на плурипотентност или напротив, продукция в диференциация.

Като първа експериментален модел за изучаване на взаимодействието на геноми на различни "историята на развитие", използван tsitogibridy получен чрез сливане teratokartsinomnyh плурипотентни и диференцирани соматични клетки. В някои случаи такива хибридни клетки запазват плурипотентни свойства на достатъчно високо ниво. По-специално, ин виво соматична хибридни teratokartsinomno-клетки се индуцират развитието на истински тератоми съдържащи производни на трите зародишни слоя, а ин витро в суспензионни култури образувани ембриоидни тела. Дори и в този вид междувидовата tsitogibridov отбележи присъствието на фетални антигени в случаите, когато соматични партньор в сливането с тератокарцином клетки са лимфоцити или тимоцити. Трябва да се отбележи, че цито-хибридите, създадени чрез сливането на тератокарциномни клетки с фибробласти, съответстват на фибробласти според фенотипа.

Най-важното е, че установен факт, че в teratokartsinomno соматични хибридни клетки се появяват признаци геном препрограмиране на диференцирани клетки, характеризиращи се с активиране на отделни гени или неактивна Х-хромозома соматични партньор. По този начин, резултатите от изследвания върху цитохибридиди като тератокарциномни-соматични клетки показват, че хибридните клетки често запазват плурипотентността и има признаци за препрограмиране на генома на соматичния партньор.

В експериментите за получаване на ембрионални вътревидови хибридни клетки чрез сливане спленоцити с животното миши ЕСС възрастен изследваните характеристики като tsitogibridov, сегрегация анализ на родителските хромозоми и оценени плурипотентност хибриден геном. За междуспецифичните хибридните клетки, получени от слети тератокарцином клетки с соматични клетки, обикновено се характеризира с ниско разделяне на хромозомите с тетраплоид или почти тетраплоид кариотип. Подобен хромозомен състав се наблюдава в цитохибрида чрез сливане на първични полови клетки с лимфоцити. В същото време, междуспецифичните хибридни клетки, получени в резултат от сливането на мишка лимфоцитния teratokartsinomnyh норка, имаше интензивна разделяне на хромозомите соматични партньор.

Качествено нов етап в изследването на разделяне на родителските хромозоми в междуспецифичните хибриди беше след развитието на микросателитния метод за анализ, използвайки полимеразна верижна реакция, при което всяка мишка хромозома намерено няколкостотин маркери, което позволява надеждно разлика между всяка двойка хомоложни хромозоми в хибридните клетки.

Чрез сливане ESK (използвайки HM-1 клетки с дефицит в gipoksantinfosforiboziltransferazy активност, 2n = 40, XY, изолиран от бластоцисти миши щам 129 / 01a) с спленоцити от мишки конгенитални линия DD / в не получи множеството от хибридни клонове морфологично има сходство с hESCs. Всички клонове се изолират в селективна среда, в която могат да растат само клетки с активна хипоксантин фосфорибозилтрансфераза. Електрофореза анализ показва присъствието на всички клонове алелен вариант gipoksantinfosforiboziltransferazy характеристика мишки ДД / гр. Използвайки цитогенетичен анализ, беше установено, че от четирите хибридни клонинги, три са имали почти двойствен набор от хромозоми. Един почти тетраплоид клон, съдържаща две популации на хибридни клетки, една от които е тетраплоид, и второ, по-малък - диплоидни.

Анализ на микросателитния позволява да дискриминира всяка двойка хомоложни хромозоми мишката 129 / 01a и DD / C, в хибридни клонове с okolodiploidnym набор показа, че клонове, настъпили в две различни преференциално елиминиране автозоми соматични партньор. Повечето автозомно клонинги HESS2 и HESS3 има маркери, линия 129 / 01a, т.е. Плурипотентни партньор. Изключение е хромозома 1 и I: клонове HESS2 и HESS3, заедно с маркери за HM-1 клетки, малък брой маркери настоящото соматични партньор. Тези резултати могат да отразяват непълна разделяне на хромозомите и 1 и соматична партньор и са съвместими с цитогенетичен данни, тризомия на хромозомите, която се проявява в 30-40% HESS2 и HESS3 клетъчни клонове. HESS4 клон се различава значително в хромозомна състав: много автозоми Този клон произлезли от генома ESK (хромозоми 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 и 17), но хромозоми 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 и 19 са представени от хомолози на двамата родители. Количественото съотношение на микросателитни маркери тези хомоложни хромозоми съответстват приблизително 1: 1. Това позволи на авторите да предполагат, че един хомолог се извлича от генома на ИСС, а другият - от диференцирани клетки. В някои суб-клонинги на клонинг HESS4 наблюдава само символично присъствие на хромозоми 18 и 19 соматична партньор. Резултатите показват, че клетките клонинг HESS4, в допълнение към разделянето на хромозомите соматична партньор, имаше премахването на едната или двете хомолози на плурипотентни геном над хромозома, т.е., имаше един двустранен на хромозомите на двамата родители - феноменът е доста необичайно, защото tsitogibridov характеристика на хромозомите само един от родителите.

Освен това, след 20 пасажа, всички клонове на хибридни клетки съдържат само X хромозомни маркери на соматични партньор, а именно в клоновете беше заменен X хромозома ESC на X хромозомата на соматични партньор. Това се потвърждава от in situ хибридизационни данни, като се използва белязана с FITC сонда, специфична за мишата Х-хромозома: положителен сигнал се открива само на една хромозома. Трябва да се отбележи, че в по-ранните стадии на култивиране (до 15-ия пасаж), според цитогенетичните данни, в много клетки имаше две Х-хромозоми. Следователно, използването на селективна среда прави възможно да се манипулира хромозомният състав на хибридни клетки и селективно да се насочат клонове, носещи единични хромозоми на соматичния партньор на фона на ESC генома.

Като уникална характеристика на tsitogibridov на геном е локализацията на родителски геноми в едно ядро, разбира се, повдига въпроса за запазване на свойствата на плурипотентни ембрионални геномни ESC-соматични клетъчни хибриди в условията на близък контакт с генома на диференцирани клетки. Морфологично цитохибридът на ESC и соматичните клетки наподобява родителската линия на ESC. Квалификация плурипотентност показа, че всички клонове okolodiploidnym набор от хромозоми са способни да образуват в суспензионни култури от ембриоидни тела, в които производните на трите зародишни слоеве настоящото.

Повечето хибридни клетки съдържат антигена ECMA-7, маркер, характерен за ранните миши ембриони, и също имаха висока активност на алкална фосфатаза. Най-убедителните данни за високите плурипотентни свойства на хибридните клетки са получени в експерименти за получаване на серия от инжекционни химери, включващи хибридни клетки на клон HESS2. Анализът на биохимичните маркери показа, че потомци на донорни хибридни клетки са открити в повечето химерни тъкани. Следователно, хибридните клетки, получени чрез сливане на ESC и соматично диференцирани клетки, запазват плурипотентността на високо ниво, включително способността да се образуват химери, когато се вкарват в бластоцистната кухина.

Клонове HESS2 и HESS4 се различават значително в състава на родителските хромозоми, но те имат сходни плурипотентни свойства. Може да се вярва, че плурипотенцията в хибридния геном се проявява като доминираща характеристика, но е възможно не всички хромозоми на ембрионалния геном да участват в процеса на поддържане на плурипотентността. Ако това предположение е правилно, може да се очаква, че елиминирането на някои хромозоми на плурипотентния партньор от хибридомния геном няма да бъде придружено от промяна в техния плурипотентен статус. В този случай, анализ на сегрегацията на родителски хромозома в ембрионални хибридни клетки ще позволи да се доближи до идентифициране на хромозоми, които отговарят за контрола на плурипотентност ембрионални клетки.

Serov О. Сътр (2001) намира между 50 потомство, получено от кръстосването на химери с нормални мишки, тези, които ще имат генотип мишките 129 / 01a, и провеждане на X хромозомни DD мишки. Авторите виждат причината за това в намаляването на плурипотенцията в хибридни клетки под влиянието на соматичния геном. Алтернативен обяснение може да бъде отрицателен ефект на тризомия за някои дисбаланс на автозоми и полови хромозоми (XXY наблюдава в клетки до 15-ия пасаж) в хибридните клетки при преминаване на мейоза. Известно е, че клетките на XXY не могат да преминават през мейоза и да образуват гамети. Тризомията е също така способна да предизвика намаляване на пролиферативната активност на хибридни клетки, в резултат на което селективното предимство в развитието на химери могат да принадлежат на клетките на ембриона на реципиента. От това следва, че за адекватна оценка на плурипотентния потенциал на хибридни клетки е необходимо да се получат хибридни клонове с нормален диплоиден набор от хромозоми.

В експерименти Serova О. Сътр (2001) първи демонстрира възможността за препрограмиране на X хромозомата в генома на соматични клетки хибридна клетка. Това заключение следва от авторите анализира експресията на химери HPRT гена (Х-хромозома маркер): наличието на алелни варианти HPRT DD / C мишки се открива във всички анализирани химерен тъкани. Трябва да се подчертае, че след въвеждането на хибридни клетки в бластоцист кухина tsitogibridy попадат в неселективни условия и запазването на X хромозомата в генома на хибридните клетки означава, че вече е облигатен компонент на своя геном и не го дискриминират от хромозома плурипотентни партньор Y.

Обобщаване на резултатите от анализ на взаимодействието на соматични и плурипотентни ембрионални геном в хибридните клетки, Авторите заключават, че в някои tsitogibridah плурипотентност появява като доминантен белег. Хибридният геном е в състояние да препрограмира индивидуални хромозоми на диференцирани клетки, които обаче не изключват възможността от обратния ефект на соматичния геном върху плурипотенцията на ембрионалния геном. При отглеждането на хибридни клетки индуцирането на диференциация се извършва много по-често, отколкото в оригиналната родителска линия на ESC NM-1. Подобен ефект се наблюдава при формирането на първични колонии: много първични колонии на ембрионални хибридни клетки се диференцират в ранните стадии на образуване с големи загуби на клонинги по време на тяхната селекция и умножение.

Така tsitogibridy от сливането на ESC с соматични клетки, въпреки близък контакт с генома на диференцирани клетки запазват плурипотентност като уникална черта на ембрионалното геном. Освен това, в такива хибридни клетки е възможно да се препрограмират отделните хромозоми, произхождащи от дифузираните клетки. Остава неясно колко напълно са налице плурипотентните свойства на ембрионалния геном в хибридните клетки, по-специално тяхната способност да участват във формирането на ембрионалния път в химери. За целта е необходимо да се получат ембрионални хибридни клетки с нормален кариотип. Във всеки случай, на полипотентни хибридни клетки могат да бъдат истински модел за генетична идентификация на хромозомите, които участват в поддържането на плурипотентни или контрол нея, както двустранно сегрегация на родителските хромозоми потенциално предвижда такава възможност.

Не по-малко привлекателно е изследването на явлението, което О. Серв и съавторите (2001) определят като "хромозомна памет". В хибриден геном хомоложни хромозоми са две алтернативни конфигурации: хомолози на соматични партньор веднъж преминали диференциация, докато хомолози плурипотентни партньор, този процес е само началото. Следователно, поддържане на високи плурипотентни свойства на хибридни клетки показва, че "плурипотентни" конфигурация хомолози ESC сравнително стабилни хибридни геноми, въпреки въздействието на transdeystvuyuschih фактори, произтичащи от соматични партньор. Гореописаните характеристики на препрограмиращи диференцирани хомоложна геномни хромозоми по време на развитието на химери не изключват възможността, че първите етапи на образуване на ин витро и култивиране tsitogibridov те запазват статус придобити по време на диференциация ин виво. Съгласно последните данни, при прехвърляне на ембрионални хибридни клетки в неселективна среда, в която има интензивно само елиминиране хромозоми соматични партньор, т.е. Генома на хибридни клетки лесно дискриминира хомолози след ин витро култура в продължение на 10-15 пасажи. Така ембрионални хибридни клетки представляват обещаващ експериментален модел за изследване не само от основните свойства на ембрионалното геном като плурипотентност, но и неговите алтернативите - ембрионална диференциация.

Терапевтична ефикасност на трансплантацията на ембрионални стволови клетки

Преди да анализираме терапевтичната ефикасност на трансплантацията на ESC и нейните производни, обобщаваме горния материал. Параметри ESC по отношение на пълното прилагане на ембриогенеза ин витро са недостатъчни поради дефекти в този случай, поради липса на мезенхимни стволови клетки, които се появяват в тялото самостоятелно и независимо от hESCs. Генетични потентност ESK-малко генетични потенциални зиготи затова направо за клониране на ембриони ИСС които не се използват. Уникален биологичен потенциал на hESCs като единствените клетки, в които програмите за развитие са разположени напълно последователно прилагане, намира приложение в изследването на ген функционални изследвания. Използване на ESK извършва декодиране на първите комбинации сигнали, които активират експресията на ранни и късни гени, кодиращи за развитието на трите зародишни слоеве. Запазване геном плурипотент на ИСС ин витро ги прави уникален инструмент за ремонт регенерация, която може автоматично да се компенсират загубите клетъчни повредени органи и тъкани. В един идеален хипотетичен вариант може да се предположи, че "... В трансплантация на донорски PGCs в организма на реципиента се прехвърлят компактно пакетирани програми, които при благоприятни условия са реализирани в изграждането на нов tkani'7 способен" ... Интегрирани ефективно в тялото на реципиента, както морфологични, функционални и функционални. "

Естествено, след разработването на методи за еднодиференциране на ESC, започва in vivo изследването на функционалната активност на клетките, получени in vitro от един специализиран клон. Пролифериращият ESO клон генерира популации от мигриращи прогениторни клетки, които са наистина способни активно да се интегрират в зоните за увреждане на тъканите на реципиента, който се използва в регенеративно-пластичната медицина. Установено е, че трансплантацията на допа-неврони в substantia nigra намалява клиничните прояви при експериментален хемипарсконсонизъм. Регионалните трансплантации на донорни нервни стволови клетки намаляват степента на двигателни нарушения, причинени от травма или контузия на гръбначния мозък и мозъка. Получени и първите положителни резултати от трансплантацията на стволови клетки при демиелинизиращи заболявания. Изглежда, че регенеративно-пластичните потенциали на ESCs откриват неограничени възможности за използване на клетъчна трансплантация в практичната медицина. Въпреки това, при трансплантиране в извънматочни зони, ИСС неизбежно се трансформират в тумори. Когато се образува подкожно инжектиране на ESC в имунодефицитни мишки, се образуват тератоми. Когато разсаждане под ESK тестисите на капсула суспензия в сингенни мишки също се образува тератоми, състоящи се от различни тъкани, клетки, които са производни на трите зародишни слоя. При такива тератоми, процесите на намалена органогенеза са изключително редки.

Редица творби предоставят информация за положителните резултати от трансплантацията на ранни производни на ESCOs на животни с екстремитна патология. Cell neurotransplantation използване на производни на PGCs е доразвита в експеримента и първите клинични изпитания за корекция на функционални нарушения в мозъка и травма на гръбначния мозък, лечение на сирингомиелия и множествена склероза (Репин, 2001). С появата на технологии neyronogeneza ЕСС ин витро, вместо да се използва ембрионални техники трансплантация мозъчната тъкан разработени производни на невросфери, получени от култури на ембрионалното нервна тъкан. Такива трансплантационни суспензии са много по-хомогенни и съдържат ангажирани невронални и невроглитни прекурсори.

В допълнение към обичайната културална среда с ретиноена киселина в доза от 10 мкг / мл в продължение на 6 седмици в ембрионални линии (тератоми) NTERA-2 човешки -kartsinomy формира над 80% от пост-митотични неврони. Пълният хомогенност на невроналната населението се постига чрез поток сортиране етикетирани имунофенотипни маркери на зрели неврони, които могат да се отървете от останките teratokartsinomnyh и незрели клетки. След трансплантация в различни области на мозъка на експерименталните животни, такива неврони не само оцеляват, но и се вграждат в регионални невронни мрежи. При животни с експериментални модели на местни дефекти neurotransplantation CNS намалява клиничните прояви на човешко патологично състояние, като ефектите на черепномозъчна травма, удар, демиелинизиращи заболявания, наследствени дефекти церебрални развитие, заболявания отлагането на липиди и полизахариди.

За оптимизиране на процесите на регенерация при дегенеративни заболявания на централната нервна система се разработват технологии за получаване на олигодендроцити, произвеждащи миелин от ESK. Първият етап традиционно включва пролиферацията на ИКС с умножаване на броя клетки, необходими за трансплантация. Във втория етап се извършва насочена диференциация на клетките в популация на миелин-продуциращи олигодендроцитни прекурсори, която се контролира със селективни маркерни антигени.

Някои възможности са отворени за ЕСС употреба деривати да се разработят методи за корекция на имунна недостатъчност, причинена от генетични дефекти в узряването на тимуса. В проучвания при нокаут (кърпа 1) мишки с индуциран генен дефект - нарушение механизъм рекомбинация V (D) J генни локуси TCR, водещи до загуба на функция на Т-лимфоцити, трансплантация началото на производни на PGCs в тимуса животински възстановява съзряване на нормални популации на имунни клонове, отговорни за клетъчен имунитет. Клинични изпитвания на трансплантация на заготовки на ин витро hESCs за лечение фатално наследствена анемия при деца.

Възражения срещу бързото въвеждане на трансплантация на стволови клетки в клиниката са оправдани от ограничен брой стабилни линии на човешки ембрионални стволови клетки и необходимостта от тяхното стандартизиране. За да се увеличи чистотата на стандартизираните ESC линии, както и на възрастните стволови клетки, се предлага метод за избор на линии въз основа на молекулярен генетичен анализ на кратки тандемни повторения на ДНК. Необходимо е също така да се тестват линиите ESC за наличие на малки хромозомни пренареждания и генетични мутации, като потенциалната възможност за появата им при условия на клетъчно култивиране е достатъчно висока. Теза простира задължително изпитване на свойствата на всички видове PGCs и регионалните плурипотентни стволови клетки, тъй като разпространението им в ин витро може да доведе до нови характеристики не присъщи на ембрионални стволови клетки на окончателно или тъкани. По-специално, се приема, че дългосрочно култивиране в среда с цитокини Hess близо до туморните клетки, тъй като те се появят и други пътища на климата, регулиращи клетъчния цикъл с придобиването на способността за прилагане на неограничен брой клетъчни деления. Някои автори, въз основа на потенциала за развитие на тумори, считат човешката трансплантация на ранни производни на ембрионални стволови клетки като безразсъдство. Според тях е много по-безопасно да се използват ангажираните потомци на ИСС, т.е. Линиите на предците на диференцираните клетки. Въпреки това все още не е разработена надеждна техника за получаване на стабилни човешки клетъчни линии, които се отличават в правилната посока.

По този начин в литературата има все повече и повече данни за положителния терапевтичен ефект от трансплантацията на производни на човешки ембрионални стволови клетки. Много от тези произведения обаче подлежат на ревизия и критика. Някои изследователи смятат, че резултатите от ранните клинични изпитвания са предварителни по своя характер и предполагат само, че стволовите клетки могат да имат благоприятен ефект върху клиничния ход на заболяването. Следователно е необходимо да се получат данни за дългосрочните резултати от клетъчната трансплантация. Като аргумент са дадени етапите на развитие на клиничната невротрансплантология. Наистина, в литературата, първоначално контролирани от публикуването на високата ефективност на мозъчни трансплантация фрагменти на ембриони в болестта на Паркинсон, но след това започва да се появява доклади отричат терапевтична ефикасност на ембрионални или ембрионален нервна тъкан трансплантирани в мозъка на пациенти.

Проведено първите клинични проучвания за оценка на безопасността на трансплантация neuroblast - производни на PGCs NTERA-2 тератокарцином, незрели клетки, които пролиферират в културата се подлагат на съхранение 100 милионна клетъчна маса. Част от така получените клетки се използва за определяне на характеристиките на клетъчен фенотип и примеси, както и да се тества потенциално заразяване с вируси и бактерии. От културалната среда се отстранява и LIF слой поддържащи клетки от строма клетки и фетални създадени условия за насочена диференциация на hESCs в neuroblasts с комбинация от цитокини и растежни фактори. След това, невробластите бяха пречистени от незрели тератокарциномни клетки в сортировач на клетка. След втората пречистването и характеризирането на фенотипа на трансплантирани клетки neuroblasts (10-12000000) суспензия с помощта на специална спринцовка и microcannulas стереотаксия и под контрола на CT инжектира в базалното ядро на мозъка на пациента (седмия месец след хеморагичен инсулт). Посттрансплантационното едногодишно скриниране на ефектите от невронната трансплантация в зоната на инсулт не показва странични ефекти и нежелани ефекти. Половината от пациентите са имали подобрение на двигателната функция в периода от 6 до 12 месеца след трансплантацията. Положителни клинични промени са придружени от увеличаване на инсулт зона кръвоснабдяване след трансплантация на клетки: средно увеличение абсорбция на флуоресцентно-белязан 2-деоксиглюкоза, съгласно позитронна емисионна томография достига 18%, а в някои пациенти - 35%.

Въпреки това, Националният институт по здравеопазване на САЩ проведе независимо проучване на клиничната ефикасност на невротрансплантацията при пациенти с паркинсонизъм. Пациентите в първата група са били трансплантирани с ембрионална нервна тъкан, продуцираща допамин, докато втората група пациенти са претърпели фалшива операция. Резултатите показват нулева клинична ефикасност на такава невротрансплантация, въпреки факта, че ембрионалните неврони, продуциращи допамин, оцеляват в мозъка на реципиентите. Освен това, след 2 години след трансплантацията на зародишен нервна тъкан в 15% от пациентите развиват устойчиви дискинезия, който липсва при пациенти в плацебо групата (стволови клетки: научния прогрес и бъдещи изследвания посоки Nat Inst, на здравеопазването САЩ ...). Наблюденията за по-нататъшното развитие на болестта при тези пациенти продължават.

Някои автори приписват противоречиви литературата за оценка на клиничните данни ефикасност Neurotransplantation с различен подход към избора на пациентите групи, посредствено избор на обективни методи за оценка на тяхното състояние и най-важното, различни от гледна точка на развитието на нервната тъкан на плода и в различни части на мозъка, от която тъканта се произвеждат в различни размери трансплантация и методични характеристики на операцията.

Трябва да се отбележи, че опитите да насочи трансплантация на плурипотентни ембрионални стволови клетки в стриатума на мозъка на плъхове с експериментална тяло gemiparkinsonizmom придружено ESC пролиферация и тяхната диференциация в допаминергичните неврони. Тя трябва да се приеме, че новообразуваните неврони ефективно вградени в невронната мрежа като ИСС след трансплантацията се наблюдава корекция на аномалии на поведение и мотор асиметрия в тест апоморфин. В същото време, някои от животните умряха поради трансформация на трансплантиран ESK в мозъчния тумор.

Експерти на Националния и Медицинска академия на САЩ, специалисти от Националния институт по здравеопазване смятат, че клиничната потенциал на hESCs заслужава сериозно внимание, обаче, настоява за необходимостта от по-подробно проучване на техните свойства, вероятността от усложнения и дългосрочните ефекти при опити с подходящи биологични модели на човешки заболявания (стволови клетки и на бъдеща регенеративна медицина Национална академична преса, Стволовите клетки и бъдещите насоки за научни изследвания., Национален институт на Health USA).

От тази гледна точка е важно, че сравнителната хистологичен анализ на експериментален тератома, получен чрез трансплантация в тестикуларни суспензия PGCs с тератоми, които са разработени поради трансплантация началото на ембриони, които включват също присъства ESC показа, че ESK независимо от техния произход или взаимодействие с от тези или други обкръжаващи клетки по същия начин реализират туморогенните си свойства. Оказа се, че такива тератоми имат клонална произход, като от тумор ЕСС може да възникне, състояща се от производни на трите зародишни слоя (.Rega, 2001). Трябва да се отбележи, че когато трансплантирани в мишки с имунна недостатъчност клонирани PGCs с нормален кариотип и формира тератоми, състоящи се от различни видове диференцирани соматични клетки. Тези експериментални данни са перфектното доказателство за клоналния произход на тератома. От гледна точка на биологията на развитието, те предполагат, че това не е кратно на ангажираните прогениторни клетки и плурипотентни стволови клетки, идентичност е източникът на диференцирани производни на трите зародишни слоя, тератома компоненти. Въпреки това, в практическите резултати клетъчна трансплантация от тези проучвания са, ако не и непосилни, а след предупредителен знак за опасност, тъй като заразяването ESC или първичните полови клетки в различни тъкани на възрастни мишки с имунна недостатъчност, неизбежно води до развитието на тумори от трансплантираните стволови клетки. Неопластичната дегенерация ектопично трансплантиран ESC придружено от появата на сателитни популации от диференцирани клетки - от частично диференцират определено ЕСС и потомствени клонове посветени линии. Интересно е, че hESCs на трансплантация в клетките на скелетните мускули близо teratokartsinomnymi неврони образуват по-често. Въпреки това, в администриращи PGCs Мейс яйце или бластоцист придружено от пълно интегриране в зародишни клетки, без образуването на злокачествени клетки. В този случай ИСС се вграждат в почти всички органи и тъкани на ембриона, включително и сексуалната рудимент. Такива allofennye животни първо се получават чрез подлагане на тератокарцином клетка 129 в ранните етапи на ембриони при 8-100 клетки. В allofennyh мишки популации geterogenomnyh клетки получени PGCs донори са въведени в костния мозък, червата, кожата, черния дроб и гениталиите, който позволява да се създаде в експеримента дори междувидови клетъчни химери. Колкото по-малко време на началото на ембриони, толкова по-голям процент на клетъчна химеризация, най-високата степен химеризация наблюдава в хематопоетичната система, кожата, нервната система, черния дроб и тънките черва allofennogo ембрион. В организма на възрастен тъканната податлив химеризация защитен от излагане на имунната система на реципиента бариери gistogematicalkie: трансплантация първичната зародишни клетки в паренхима на тестис придружава от вмъкване на донор на стволови клетки в реципиента тъкан germenativny слой. Въпреки това, не се наблюдава ESC трансплантация в образуването на бластоцист химерни primordia гениталии с поколение донори първичната зародишни клетки. ESC плурипотентност при създаването на специални условия и може да се използва за клониране: ESC трансплантация мишки 8-16-клетъчна миши ембрион, клетъчна митоза където tsitokalazinom блокиран, допринася за нормална ембриогенезата с развитието на PGCs ембриона донори.

Следователно алтернатива е трансплантация на алогенни ESC терапевтично клониране на базата на соматични клетки ядрената трансплантация в енуклеирано яйцеклетка да се създаде бластоцист вътрешна клетъчна маса, от която след това се разпределят линия на генетично идентични донорни PGCs соматични ядрото. Технически, тази идея е възможно, тъй като възможността за създаване на линии от hESC бластоцисти, получени след трансплантация на соматични ядра в енуклиран яйцеклетка многократно доказано в експерименти върху лабораторни животни (Nagy, 1990; Munsie, 2000). По-специално при мишки, хомозиготни за мутация на rag2, фибробласти, получени чрез култивиране подкожно тъканни клетки бяха използвани като донори ядра се трансплантират в енуклеирани ооцити. След активирането ооцити "зигота" култивират до образуване на бластоцист, от вътрешната клетъчна маса се изолира PGCs и прехвърлянето им в линия за мутантния ген nullizigotnyh клетки (rag2 ~ / ~). Чрез хомоложна рекомбинация в такива ESC, мутацията на един алелен ген се коригира. В първата серия от експерименти от hESCs рекомбинантен ген извлича се получават ембриоидни тела, трансфектирани клетки от него с рекомбинантен ретровирус (HoxB4i / GFP) и след размножаване в мишки, инжектирани вена rag2 ~ / ~. Във втората серия тетралоидните бластомери се агрегират с генетично модифицирани ESCs и се трансплантират към женските си реципиенти. Родените имунокомпетентни мишки служеха като донори на костен мозък за трансплантация на миши мишки rag2 ~ / ~. В двете серии, резултатът е положителен: 3-4 седмици във всички мишки от нормални зрели миелоидни и лимфоидни клетки са открити в състояние да произвеждат имуноглобулини. По този начин, трансплантация в яйцеклетката ядрата на соматични клетки може да се използва не само за получаване на hESC линии, но също така и за tsitogenoterapii - Корекция на наследствени нарушения използват ESC като вектор за транспорт на коригиране на генетичната информация. Но в тази посока на клетъчната трансплантация освен биоетичните проблеми има и ограничения. Не е ясно как безопасно трансплантацията ще бъде терапевтично клонирани клетки с генотип идентичен генотип на даден пациент, тъй като тези клетки могат да въведат мутации, които създават предразположеност към някои заболявания. Нормални човешки яйца остават недостъпни обект, а дори и при пресаждането соматични ядра в енуклиран животно на овоцити само 15-25% инженерство "зигота" развиват до стадий на бластоцист. Не е определено колко бластоцист се изисква за получаване на единична линия плурипотентни клонирани ESCs. Трябва да се отбележи и високото ниво на финансовите разходи, свързани със сложността на методиката за терапевтично клониране.

В заключение, в плурипотентност геном ESC hypomethylated ДНК се комбинират с високо теломеразна активност и кратка фаза С ^ клетъчния цикъл, което осигурява интензивно и потенциално безкрайна умножение, през който PGCs запазват диплоидни хромозоми и "ювенилен" набор от фенотипни характеристики. Клонираните растеж на PGCs в култура не изключва ги диференцират във всяка специализирана клетка на организма при пролиферация стоп линия и добавяне на подходящи регулаторни сигнали. Ограничаване диференциация на hESCs в съответствие ин витро соматични клетки се осъществява, без участието на мезенхима, заобикаляйки Nohteyaov е органогенезата и без образуване на ембриона. Извънматочна ин виво прилагане PGCs неизбежно води до тератокарцином формация. ESC трансплантация в бластоцист или началото на ембриона придружен от тяхната интеграция с тъканите на ембриона и нейните стабилни химеризацията органи.

Регенеративен и пластмасови технологии на базата на клетъчната трансплантация е точката на пресичане на интересите на членовете на клетъчната биология, биология на развитието, експериментални генетика, имунология, неврология, кардиология, хематология, както и много други области на експериментална и практическа медицина. Най-важните експериментални резултати доказват възможността за препрограмиране на стволовите клетки с посоката на промяна на техните свойства, които отваря перспективи за контролиране цитоделене процеси с растежни фактори - за инфаркт на регенерация, възстановяване на увреждания на ЦНС и нормализиране на функцията на устройството за островчетата на панкреаса. Въпреки това, широко разпространени производни въвеждане трансплантация ESC в медицинската практика е необходимо да се изследва свойствата на човешки стволови клетки в повече подробности и допълнителни експерименти с PGCs в експериментални модели на заболявания.

Биоетиката въпроси и на проблема с отхвърлянето на алогенна трансплантация на клетките биха могли да разрешат наблюдавания пластичността на генома на регионалните стволови клетки. Въпреки това, първоначалната информация е, че при пресаждането на черния дроб изолирани и старателно характеризират автоложни хемопоетични клетки, от които има нови хепатоцити, включващи в чернодробните лобули, в момента се преразглежда и критикуван. Въпреки това, публикувани данни, че трансплантацията на нервните стволови клетки в тимуса е образуването на нови кълнове на донорни Т-и В-лимфоцити и трансплантиране невронни стволови клетки на мозъка, в костния мозък води до образуването на хематопоетични зародиш забавено донор миелоидна и еритропоезата , Следователно, при възрастни органи може да бъде запазена плурипотентни стволови клетки, способни на геном препрограмиране на ESC за капацитет.

Източник на ИСС за медицински цели остава човешки ембрион, което предопределя неизбежността на нов пропускателен пункт на моралните, етични, морални, правни и религиозни въпроси в основата на човешкия живот. Откриването на ИСС даде силен тласък на възобновяването на суровите дискусии за това, къде се крие линията между живите клетки и материята, веществото и личността. В същото време няма универсални норми, правила и закони, касаещи употребата на ИСС в медицината, въпреки многократните опити за тяхното създаване и приемане. Всяка държава в своето законодателство решава този проблем самостоятелно. От своя страна, лекарите от цял свят продължават да се опитват да развият регенеративна пластична медицина извън тези дискусии, главно чрез използването на не-ембрионални стволови клетки и резервите от стволови клетки на възрастен организъм.

Някои от историята на изолиране на ембрионални стволови клетки

Terato- (ембрионални) клетки бяха изолирани от -kartsinomnye спонтанно срещащи тестисите тератоми миши щам 129 / трет-Св, спонтанни яйчниците тератоми миши линии Lt / Sv, и от тератоми, ektopichno източник бяха трансплантирани клетки или ембрионална тъкан. Сред така получените terato- стабилни миши линии (ембрионални) -kartsinomnyh някои клетки са плурипотентни, други се подлагат на диференциация само в клетките на един определен вид, а някои са обикновено неспособни цитоделене.

По времето, когато акцентът беше поставен изследвания, които са показали възможен връщане terato- (плода) -kartsinomnyh клетки към нормалния фенотип след въвеждането им в развиващия се ембрион тъкан, както и работа за създаване на ин витро генетично модифицирани terato- (плода) -kartsinomnyh клетки, с помощта на които мутантни мишки са получени за биологично моделиране на човешката наследствена патология.

Подготвената култивирана суспензия се използва за изолиране на линиите на терато-ембрио-карциномни клетки. В култура terato- (ембрион) -kartsinomnye клетки, като ЕСС, растат до образуване ембриоидни тела и изисква да бъде преведен на линия на свързване дисоциация поддържане плурипотентност на захранващото слой на ембрионални фибробласти или суспензия култивиране в кондиционирана среда. Terato- плурипотентни клетки (ембрионални) - карциномни линии големи, сферични, имат висока активност на алкална фосфатаза, образуват агрегати и са способни на многопосочни диференциация. Когато въвежда в бластоцист се агрегират с морули, което води до образуването на химерни ембриони, в различните органи и тъкани, които производни са намерени terato- (ембрионални) -kartsinomnyh клетки. Въпреки това, по-голямата част от такива химерни ембриони умират в утробата и в органите оцеляване химери новородени чужди клетки и рядко открива с ниска плътност. В същото време честотата на тумори (фибросаркома, рабдомиосаркома и други видове злокачествени подуване и аденом на панкреаса) рязко се увеличава, и неопластични дегенерация често се случва дори в утробата химерни ембриони.

Повечето от клетките терато-ембрио-карцином в микро-средата на нормалните ембрионални клетки почти естествено придобиват злокачествени неопластични характеристики. Смята се, че необратимото злокачествено заболяване се дължи на активирането на прото-онкогени в процеса на структурни пренареждания. Едно изключение са клетъчни линии embriokartsinomnoy SST3, тератома, получен от миши тестис (линия 129 / Sv-тер), които проявяват по-висока способност да се интегрира в тъкан и органи на плода без последващо образуване на тумори в химерни мишки. Производните на терато-ембрио-карциномни клетъчни линии в химерни мишки практически не участват във формирането на първични гоноцити. Очевидно е, че е свързан с висока честота на хромозомни аберации, общи за най terato- (ембрион) -kartsinomnyh линии, при което клетките се наблюдават като анеуплоидия или хромозомна аномалия.

Няколко стабилни terato- линии (ембрионални) -kartsinomnyh човешка клетка се получава при лабораторни условия, характеризиращи плурипотентност, висока пролиферативна активност и способност да се диференцират в култура по време на растежа. По-специално, линията на човешки терато-ембрио-карциномни клетки NTERA-2 се използва за изследване на механизмите на невронно цитодиференциране. След трансплантация на клетки от тази линия в субвентрикуларния участък на предния мозък на новородени плъхове, се наблюдават тяхната миграция и невроногенеза. Има дори опитва да трансплантация невронална terato- получена чрез култивиране на клетки (ембрион) -kartsinomnoy линия NTERA-2, при пациенти с инсулт, които според авторите, което води до клинично подобрение на заболяването. В същото време не са наблюдавани случаи на злокачествени трансплантирани клетки от терато-ембрио-карциномната линия NTERA-2 при пациенти с мозъчен инсулт.

В първия ред на недиференцирани плурипотентни ембрионални стволови клетки на мишки, в началото на 80-те години на миналия век има Еванс и Мартин, като ги изберете от вътрешната клетъчна маса на бластоцист на - embryoblast. Изолираните ESC линии за дълго време запазена плурипотентност и способността да се диференцират в различни типове клетки под влиянието на фактори от специална културална среда.

Терминът "ембрионален плурипотентни стволови клетки" принадлежи Leroy Stevens, че разследването на тютюн катран влияние върху честотата на развитие на тумора обръща внимание на появата на спонтанни тестисите тератокарцином на линейна (129 / обем) на мишки от контролната група. Тестисите тератокарцином клетки се характеризират с висока степен на пролиферация, и в присъствието на течност остава в коремната кухина с образуването на спонтанно диференциация на неврони, кератиноцити, хондроцити, кардиомиоцити, както и косата и костни фрагменти, но без признаци на подредени cytoarchitectonics подходяща тъкан. При засаждане в тератокарцином клетъчна култура отглеждат неприкрепени към субстрата плурипотентни клонове и след това се оформят ембриоидни тела се гаси и се подлага на спонтанно делене безредно се диференцират в неврони, глия, мускулни клетки и кардиомиоцити. Stevens установено, че тератокарцином мишката 129 / об съдържа по-малко от 1% от клетки, способни на диференциране в различни специализирани соматични линия, и се диференциация зависи от фактори, които ги засягат (състав перитонеална течност, продуктите добавено към културата на зрели клетки или тъкани). Leroy Stevenson предположение за наличието сред тератокарцином клетки ембрионални стволови сексуална зародишни клетки беше потвърдено: суспензията embryoblast предимплантационни ембриони клетки при възрастни мишки тъкани образува тератокарцином, и отделени от тях чисти клетъчни линии след интраперитонеално приложение на животни-приемници са диференцирани в неврони, кардиомиоцити и други соматични kletki производни на трите зародишни слоя. В експерименти ин виво трансплантация ESK (получен от embryoblast но не трофобластната) в миши ембриони на различни етапи линии 8-32 бластомер завърши раждане на химерния животното (без образуване на тумори) на органи, която открива зеле донорна тъкан. Химеризмът се наблюдава дори и в линията на полови клетки.

Основно прогениторни зародишни клетки, изолирани от миши ембрион зародиш пол, морфология, имунологично фенотип и функционални характеристики в съответствие с hESCs получени от тератокарцином Stevenson и embryoblast. В химери родени след прилагане на hESCs в бластоцист, allofenny морфогенеза орган характеризиращ мозайка променлив донора и реципиента структурни и функционални единици на черния дроб, белия дроб и бъбреците. В редица случаи е наблюдавано образуването на чревни криптове или лобули на черния дроб, състоящи се едновременно от клетката на получателя и от донора. Обаче, реализацията на морфогенезата винаги се осъществява в съответствие с генетичната програма на видовете, към които принадлежи получателят, и химеризмът е ограничен единствено до клетъчното ниво.

След това, беше установено, че разпространението на hESCs без цитоделене за слой поддържащи клетки, извлечени от мезенхимни клетки (фетални фибробласти) се случва в присъствието на LIF задължителен в селективна хранителна среда, която селективно се предоставят само оцеляване на стволови и потомствени клетки, докато по-голямата част от специализирани клетъчни елементи умира. С помощта на тези техники през 1998 г. От Джеймс Томсън е разпределена на пет увековечени линии на ембрионални стволови клетки от вътрешната клетъчна маса на лице бластоцист на. Същата година, Джон Герхарт е разработила метод за изолиране на безсмъртните ESC линии от сексуална бутер от четири-пет седмици човешки ембриони. Поради уникалните си свойства, само за две години, ембрионални стволови клетки и стволови клетки от окончателни тъкани вече са започнали да се използват в практиката на регенеративна медицина и генна терапия.