Мезенхимни стволови клетки

Сред регионалните стволови клетки специално място заемат мезенхимните стволови клетки (МСК), чиито производни съставляват стромалната матрица на всички органи и тъкани на човешкото тяло. Приоритет в изследванията на МСК принадлежи на представители на руската биологична наука.

В средата на миналия век в лабораторията на А. Фриденщайн за първи път е изолирана хомогенна култура от мултипотентни стромални стволови клетки от костен мозък. Мезенхимните стволови клетки, прикрепени към субстрата, поддържат висока интензивност на пролиферация за дълго време, а в култури с ниска плътност на засяване след фиксиране върху субстрата те образуват клонове на фибробластоподобни клетки, които не притежават фагоцитна активност. Прекратяването на пролиферацията на MSC завършва с тяхната спонтанна диференциация in vitro в клетки на костна, мастна, хрущялна, мускулна или съединителна тъкан. По-нататъшни изследвания позволяват да се установи остеогенният потенциал на фибробластоподобните клетки от стромата на костния мозък на различни видове бозайници, както и тяхната колониообразуваща активност. In vivo експерименти показват, че както хетеро-, така и ортотопната трансплантация на колониообразуващи фибробластоподобни клетки води до образуването на костна, хрущялна, фиброзна и мастна тъкан. Тъй като стромалните стволови клетки от костния мозък се характеризират с висок капацитет за самообновяване и многостранна диференциация в рамките на една клетъчна линия, те се наричат мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки.

Трябва да се отбележи, че в продължение на 45 години фундаментални изследвания на мезенхимните стволови клетки са създадени реални условия за използването на техните производни в клиничната практика.

Днес няма съмнение, че всички тъкани на човешкото тяло се формират от стволови клетки от различни клетъчни линии в резултат на процесите на пролиферация, миграция, диференциация и съзряване. Доскоро обаче се смяташе, че стволовите клетки в един възрастен организъм са тъканно-специфични, т.е. способни да произвеждат линии от специализирани клетки само на онези тъкани, в които се намират. Тази концептуална позиция беше опровергана от фактите за трансформацията на хематопоетичните стволови клетки не само в клетъчни елементи на периферната кръв, но и в овални клетки на черния дроб. Освен това, невронните стволови клетки се оказаха способни да дадат начало както на неврони, така и на глиални елементи, както и на рано ангажирани линии от хематопоетични прогениторни клетки. От своя страна, мезенхимните стволови клетки, които обикновено произвеждат клетъчни елементи на костна, хрущялна и мастна тъкан, са способни да се трансформират в невронни стволови клетки. Предполага се, че в процеса на растеж, физиологична и репаративна регенерация на тъканите, неконтимираните прогениторни клетки се генерират от тъканно-неспецифични стволови резерви. Например, възстановяването на мускулната тъкан може да се осъществи благодарение на мигриращите мезенхимни стволови клетки от костния мозък към скелетните мускули.

Въпреки че подобна кръстосана взаимозаменяемост на стволовите клетки не се признава от всички изследователи, възможността за клинично използване на мезенхимните стволови клетки като източник за клетъчна трансплантация и клетъчен вектор на генетична информация вече не се оспорва от никого, както и мултипотентността на стромалните стволови клетки от костен мозък, които могат да бъдат сравнително лесно изолирани и размножени in vitro култура. В същото време в научната литература продължават да се появяват доклади за потенциалната плурипотентност на стромалните стволови клетки от костен мозък. Като доказателство се цитират изследователски протоколи, в които под въздействието на специфични индуктори на трансдиференциация, МСК се трансформират в нервни клетки, кардиомиоцити и хепатоцити. Някои учени обаче имат сериозни съмнения относно възможността за многократно активиране и експресия на гени от периода на ранната ембриогенеза. В същото време всички разбират, че ако се намерят условия за разширяване на мултипотентността на мезенхимните стволови клетки до плурипотентност на ембрионалните клетки (ЕСК), много етични, морални, религиозни и правни проблеми в регенеративната пластична медицина ще бъдат автоматично решени. Освен това, тъй като в този случай източник на регенеративен стволов потенциал стават автоложните стромални клетки на пациента, проблемът с имунното отхвърляне на клетъчния трансплантат също е решен. Близкото бъдеще ще покаже колко реалистични са тези перспективи.

[ 1 ], [ 2 ]

Използване на мезенхимни стволови клетки в медицината

В клиниката използването на производни на мезенхимни стволови клетки е свързано предимно с възстановяването на тъканни дефекти, възникващи при обширни и дълбоки термични кожни лезии. В предклиничния етап е проведена експериментална оценка на възможността за използване на алогенни фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки за лечение на дълбоки изгаряния. Показано е, че фибробластоподобните мезенхимни стволови клетки от костен мозък образуват монослой в културата, което прави възможно трансплантацията им за оптимизиране на процесите на регенерация на дълбоки изгаряния. Авторите отбелязват, че ембрионалните фибробласти имат подобно свойство, но клиничното им приложение е ограничено от съществуващите етични и правни проблеми. Дълбоко термично изгаряне с увреждане на всички слоеве на кожата е моделирано върху плъхове Wistar. Площта на изгарянето е 18-20% от общата повърхност на кожата. Първата експериментална група включва плъхове с дълбоко термично изгаряне и трансплантация на алогенни фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки. Втората група се състои от животни с дълбоко термично изгаряне и трансплантация на алогенни ембрионални фибробласти. Третата група е представена от контролни плъхове с дълбоко термично изгаряне, които не са подложени на клетъчна терапия. Суспензия от фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки и ембрионални фибробласти е нанесена върху повърхността на раната от изгаряне с помощта на пипета в количество 2 x 10⁴ ^.клетки на 2-рия ден след моделиране на изгарянето и изрязване на получената некротична струпея. След клетъчна трансплантация, повърхността на изгарянето беше покрита с марлена салфетка, навлажнена с изотоничен разтвор на натриев хлорид с гентамицин. Клетки от костен мозък бяха събрани за получаване на МСК с последваща индукция в линия от фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки от възрастни плъхове Wistar от бедрени кости. Ембрионални фибробласти бяха получени от белите дробове на 14-17-дневни ембриони. Ембрионалните фибробласти и клетките от костен мозък за получаване на МСК бяха предварително култивирани в петриеви панички при температура 37°C в CO2 инкубатор, в атмосфера с 5% CO2 при 95% влажност. Ембрионалните фибробласти бяха култивирани в продължение на 4-6 дни, докато образуването на монослой от МСК изискваше от 14 до 17 дни. Впоследствие, МСК бяха криоконсервирани като изходен материал за фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки, получени чрез размразяване и култивиране на МСК в продължение на 4 дни. Броят на образуваните фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки беше повече от 3 пъти по-висок от броя на ембрионалните фибробласти, образувани през същия период на култивиране. За да се идентифицират трансплантираните клетки в рани от изгаряния на етапа на култивиране, техният геном беше маркиран с помощта на вирусен совалков вектор, базиран на рекомбинантен аденовирус тип V, носещ 1ac-2 гена, кодиращ E. coli ß-галактозидаза. Живи клетки в различно време след трансплантацията бяха открити имунохистохимично в криосекции с добавяне на X-Gal субстрат, който дава характерно синьо-зелено оцветяване. В резултат на динамична визуална, планиметрична и хистологична оценка на състоянието на раната от изгаряне беше установено, че още на 3-тия ден след клетъчната трансплантация се появяват значителни разлики в протичането на раневия процес в избраните групи. Тази разлика стана особено отчетлива на 7-ия ден след клетъчната трансплантация. При животните от първата група, на които са трансплантирани фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки, раната е придобила равномерно интензивен розов цвят, гранулационната тъкан е нараснала по цялата си площ до нивото на епидермиса, а повърхността на изгарянето е намаляла значително по размер. Колагеновият филм, образуван върху повърхността на раната, е станал малко по-тънък, но е продължил да покрива цялата площ на изгарянето. При животните от втората група, на които са трансплантирани ембрионални фибробласти, гранулационната тъкан се е издигнала до нивото на епидермиса на краищата на раната, но само на места, докато плазмореята от раната е била по-интензивна, отколкото в първата група, а първоначално образуваният колагенов филм е практически изчезнал. При животните, които не са получили клетъчна терапия, на 7-ия ден раната от изгарянето е била бледа, с ямки, с некротична тъкан, покрита с фибрин. Плазморея е била наблюдавана по цялата повърхност на изгарянето. Хистологично животните от първата и втората група показват намаляване на клетъчната инфилтрация и развитие на съдовата мрежа.и тези признаци на започващ регенеративен процес бяха по-изразени при плъховете от 1-ва група. В контролната група се наблюдаваха признаци на клетъчна инфилтрация на раната, хистологичната картина на новообразуваните съдове отсъстваше. На 15-30-ия ден от наблюдението площта на повърхността на изгарянето при животните от 1-ва група беше значително по-малка, отколкото при плъховете от останалите групи, а гранулиращата повърхност беше по-развита. При животните от 2-ра група площта на повърхността на изгарянето също намаля в сравнение с размера на раните от изгаряне при плъховете от контролната група, което се дължи на маргинална епителизация. В контролната група повърхността на изгарянето остана бледа на места с редки гранулации, по нея се появиха съдови звездички, имаше островчета от фибринозна плака, умерена плазморея продължи по цялата повърхност на изгарянето, а на места остана коричка, която беше трудно отделяща се. Като цяло, при животните от 3-та група размерът на раната също намаля, но краищата на раната останаха подкопани.

По този начин, по време на сравнително проучване на скоростта на заздравяване на рани с използване на фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки и ембрионални фибробласти, както и без използване на клетъчна терапия, е отбелязано ускоряване на скоростта на заздравяване на повърхността на изгаряне в резултат на трансплантация на фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки и ембрионални фибробласти. Въпреки това, в случай на използване на алогенни фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки, скоростта на заздравяване на рани е по-висока, отколкото при трансплантация на ембрионални фибробласти. Това се изразява в ускоряване на смяната на фазите на регенеративния процес - сроковете на клетъчна инфилтрация са намалени, скоростта на растеж на съдовата мрежа се увеличава, както и образуването на гранулационна тъкан.

Резултатите от динамичната планиметрия показват, че скоростта на спонтанно заздравяване на раната от изгаряне (без използване на клетъчна терапия) е била най-ниска. На 15-ия и 30-ия ден след трансплантация на алогенни фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки, скоростта на заздравяване на раната е била по-висока, отколкото при трансплантация на ембрионални фибробласти. Хистохимичният метод за откриване на бета-галактозидаза показа, че след трансплантация на фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки и ембрионални фибробласти, трансплантираните клетки остават жизнеспособни на повърхността и в дълбочината на регенериращите рани през целия период на наблюдение. Авторите смятат, че по-високата скорост на регенерация на рани от изгаряне с използването на фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки се дължи на освобождаването на биологично активни растежно-стимулиращи фактори от тези клетки по време на процеса на зреене.

Трансплантацията на авто- или алогенни кератиноцити и алогенни фибробласти за лечение на изгаряния също е използвана в клиничната практика. Трябва да се отбележи, че хирургичното лечение на деца с обширни дълбоки изгаряния е сложна задача поради високата травматичност и множеството хирургични интервенции, значителната кръвозагуба и различните реакции към използваните инфузионни среди. Основните трудности при извършване на кожни пластични операции при обширни дълбоки изгаряния, с площ над 40% от телесната повърхност, се дължат на тежестта на състоянието на пострадалите и липсата на донорски кожни ресурси. Използването на мрежести трансплантати с висок коефициент на перфорация не решава проблема, тъй като образуваните след перфорация клетки епителизират много бавно, а самите кожни клапи често лизират или изсъхват. Такива покрития на изгаряния като ксенокожа, трупни алографти, синтетични филмови покрития не винаги са достатъчно ефективни, поради което се разработват нови методи за покриване на изгаряните повърхности със слоеве от култивирани кератиноцити и фибробласти. По-специално, предложен е метод за покриване на изгаряни повърхности с помощта на култивирани алофибробласти, които при трансплантация имат изразен стимулиращ ефект върху пролиферацията на епидермоцити, запазени в раната при гранични изгаряния, както и на кератиноцити в септите на мрежести трансплантати. Работата на Л. Будкевич и съавтори (2000) представя резултатите от използването на този метод за лечение на изгаряния при деца. В проучването са включени 31 деца с термична травма на възраст от 1 година до 14 години. При три деца общата площ на изгаряните рани от степен IIIA-B - IV е била 40%, при 25 - 50-70%, при други три - 71-85% от телесната повърхност. Ранната хирургична некректомия е комбинирана с трансплантация на култивирани алофибробласти и автодермопластика. Първият етап от лечението включваше изрязване на некротични тъкани, вторият етап - трансплантация на култивирани алофибробласти върху носещи филми, а третият етап (48 часа след трансплантацията на култивирани алофибробласти) включваше отстраняване на матрицата и автодермопластика с кожни ламба със съотношение на перфорация 1:4. Трима пациенти, приети в клиниката с тежка изгаряща болест, имаха трансплантирани култивирани алофибробласти върху гранулиращи рани. Трансплантацията на култивирани алофибробласти е извършена веднъж при 18 деца, два пъти при 11 деца и три пъти при двама пациенти. Площта на раневата повърхност, покрита с клетъчна култура, варираше от 30 до 3500 cm2. Ефективността на култивираните алофибробласти беше оценена чрез общия процент на присаждане на кожна присадка, времето за заздравяване на изгарянията и броя на смъртните случаи от тежка термична травма. Присаждането на присадката е било пълно при 86% от пациентите. Частично неприсаждане на кожни присадки е наблюдавано в 14% от случаите. Въпреки лечението, шест (19,3%) деца починаха. Общата площ на кожното увреждане при тях варираше от 40 до 70% от телесната повърхност.Трансплантацията на култивирани алофибробласти не е била свързана със смъртност при изгаряне при нито един пациент.

Анализирайки резултатите от лечението, авторите отбелязват, че преди това дълбоките термични увреждания на кожата, покриващи 35-40% от телесната повърхност, са били считани за несъвместими с живота (за по-малки деца - до 3-годишна възраст - дълбоките изгаряния, покриващи 30% от телесната повърхност, са критични, за по-големи деца - над 40% от телесната повърхност). При извършване на хирургична некректомия с трансплантация на култивирани алофибробласти и последваща автодермопластика с кожни клапи с висок коефициент на перфорация, изгарянията от IIIB - IV степен остават критични, но понастоящем има перспективи за спасяване на живота дори на такива пострадали в много случаи. Хирургичната некректомия в комбинация с трансплантация на култивирани алофибробласти и автодермопластика при деца с дълбоки изгаряния се е доказала като особено ефективна при пациенти с широко разпространени кожни лезии с недостиг на донорски места. Активната хирургична тактика и трансплантацията на култивирани алофибробласти допринасят за бързо стабилизиране на общото състояние на такива пациенти, намаляване на броя на инфекциозните усложнения от изгаряния, създаване на благоприятни условия за присаждане на трансплантати, намаляване на времето за възстановяване на загубената кожа и продължителността на стационарното лечение, намаляване на честотата на фаталните изходи при пострадали с обширни изгаряния. По този начин, трансплантацията на култивирани алофибробласти с последваща автодермопластика с кожни клапи позволява възстановяване при деца с тежки изгаряния, които преди това са били считани за обречени.

Общоприето е, че основната цел на лечението на изгаряния е възможно най-пълното и бързо възстановяване на увредената кожа, за да се предотвратят токсични ефекти, инфекциозни усложнения и дехидратация. Резултатите от използването на култивирани клетки до голяма степен зависят от готовността на самата рана от изгаряне за трансплантация. В случаите на трансплантация на култивирани кератиноцити върху повърхността на раната след хирургична некректомия, средно 55% (по площ) от трансплантираните клетки се присаждат, докато при гранулиращи рани процентът на присаждане намалява до 15%. Следователно, успешното лечение на обширни дълбоки кожни изгаряния изисква, на първо място, активна хирургична тактика. При наличие на изгаряния от IIIB-IV степен, повърхността на изгарянето незабавно се освобождава от некротична тъкан, за да се намали интоксикацията и да се намали броят на усложненията на изгарянията. Използването на такава тактика е ключът към намаляване на времето от момента на получаване на изгарянето до затварянето на раните и продължителността на престоя на пациенти с обширни изгаряния в болница, а също така значително намалява броя на фаталните случаи.

Първите съобщения за успешно използване на култивирани кератиноцити за покриване на изгаряния се появяват в началото на 80-те години на миналия век. Впоследствие тази манипулация е извършена с помощта на слоеве от култивирани кератиноцити, най-често получени от автоклетки, много по-рядко от алокератиноцити. Технологията на автокератиноцитопластиката обаче не позволява създаването на клетъчна банка, а времето, необходимо за производство на кератиноцитен трансплантат с достатъчна площ, е дълго и възлиза на 3-4 седмици. През този период рискът от развитие на инфекциозни и други усложнения от изгарянията рязко се увеличава, което значително удължава общото време на престоя на пациентите в болница. Освен това, автокератиноцитите практически не се вкореняват при трансплантация върху гранулиращи изгаряния, а високата цена на специални растежни среди и биологично активни стимулатори на растежа на кератиноцитите значително ограничава клиничното им приложение. Други биотехнологични методи, като колагенопластика, трансплантация на криоконсервирана ксенокожа и използването на различни биополимерни покрития, повишават ефективността на лечението на обширни повърхностни, но не и дълбоки изгаряния. Методът за покриване на повърхността на раната с култивирани фибробласти е коренно различен, тъй като фибробластите, а не кератиноцитите, се използват като основен компонент на култивирания клетъчен слой.

Предпоставка за разработването на метода бяха данните, че перицитите, обграждащи малките съдове, са прогениторни мезенхимни клетки, способни да се трансформират във фибробласти, които произвеждат много растежни фактори и осигуряват заздравяване на рани, благодарение на силен стимулиращ ефект върху пролиферацията и адхезията на кератиноцитите. Използването на култивирани фибробласти за затваряне на раневи повърхности веднага разкри редица значителни предимства на този метод в сравнение с използването на култивирани кератиноцити. По-специално, получаването на фибробласти в култура не изисква използването на специални хранителни среди и стимуланти на растежа, което намалява цената на трансплантацията повече от 10 пъти в сравнение с цената на получаване на кератиноцити. Фибробластите лесно се пасивират, при което частично губят повърхностни антигени на хистосъвместимост, което от своя страна отваря възможността за използване на алогенни клетки за производството на трансплантати и създаването на техните банки. Времето, необходимо за получаване на трансплантати, готови за употреба в клиника, се намалява от 3 седмици (за кератиноцити) до 1-2 дни (за фибробласти). Първична фибробластна култура може да се получи чрез култивиране на клетки от кожни фрагменти, взети по време на автодермопластика, а плътността на засяване на клетките за получаване на човешки фибробластни субкултури е само 20 x 10³ ^на 1 ^cm².

За да се изследва ефектът на фибробластите и техните регулаторни протеини върху пролиферацията и диференциацията на кератиноцитите, е извършен сравнителен анализ на морфологията и пролиферацията на кератиноцитите върху субстрати от колаген тип I и III, както и фибронектин в съвместна култура с човешки фибробласти. Човешки кератиноцити са изолирани от кожни фрагменти на пациенти с изгаряния, взети по време на автодермопластика. Плътността на засяване на кератиноцитите е 50 x 103 клетки на 1 cm2. Клиничната ефикасност на трансплантацията на култивирани фибробласти е оценена при 517 пациенти. Всички пациенти са разделени на две групи: Група 1 - възрастни пострадали с изгаряния от IIA, B - IV степен; Група 2 - деца с дълбоки изгаряния от IIIB - IV степен. Оценката на динамиката на структурната и функционалната организация на монослойните културални фибробласти, като се взема предвид ролята на гликозаминогликаните, фибронектина и колагена в процесите на регенерация, позволи на авторите да определят 3-тия ден като най-благоприятен период за използване на фибробластни култури за извършване на трансплантации. Проучване на ефекта на фибробластите върху пролиферацията и диференциацията на кератиноцитите показа, че in vitro фибробластите имат изразен стимулиращ ефект, предимно върху процесите на адхезия на кератиноцитите, увеличавайки броя на прикрепените клетки и скоростта на тяхното фиксиране повече от 2 пъти. Стимулирането на адхезионните процеси е съпроводено с повишаване на интензивността на синтеза на ДНК и нивото на пролиферация на кератиноцитите. Освен това се оказа, че наличието на фибробласти и образуваната от тях извънклетъчна матрица е необходимо условие за формирането на тонофибриларния апарат на кератиноцитите, междуклетъчните връзки и в крайна сметка за диференциацията на кератиноцитите и образуването на базалната мембрана. При лечението на деца с дълбоки изгаряния е установена висока клинична ефективност на трансплантацията на алофибробластна култура, особено в групата пациенти с обширни кожни лезии при условия на дефицит на донорското място. Цялостно морфофункционално проучване показа, че трансплантираните фибробласти се характеризират с активен синтез на ДНК, както и на колаген, фибронектин и гликозаминогликани, които са част от извънклетъчната матрица, образувана от клетките. Авторите посочват висок процент на присаждане на трансплантирани фибробласти (до 96%), рязко намаляване на времето за получаването им (в рамките на 24-48 часа вместо 2-3 седмици в случай на използване на кератиноцити), значително ускоряване на епителизацията на изгорената повърхност, както и значително намаляване на цената (с 10 пъти) на технологията за отглеждане на трансплантат от фибробласти в сравнение с трансплантацията на кератиноцити. Използването на трансплантация на култивирани алофибробласти прави възможно спасяването на живота на деца с критични изгаряния - термично увреждане на повече от 50% от телесната повърхност,което преди се смяташе за несъвместимо с живота. Трябва да се отбележи, че с трансплантацията на алогенни ембрионални фибробласти е убедително доказано не само по-бърза регенерация на рани и възстановяване на пациенти с различна степен и площ на изгаряния, но и значително намаляване на тяхната смъртност.

Автоложните фибробласти се използват и в такава сложна област на пластичната хирургия като реконструктивната корекция на увреждания на гласните струни. За тази цел обикновено се използва говежди колаген, чиято продължителност на действие е ограничена от неговата имуногенност. Като чужд протеин, говеждият колаген е чувствителен към колагеназата на реципиента и може да предизвика имунни реакции, за да се намали рискът от които са разработени технологии за получаване на колагенови препарати, омрежени с глутаралдехид. Тяхното предимство се състои в по-голямата стабилност и по-ниската имуногенност, което е намерило практическо приложение при елиминиране на дефекти и атрофия на гласните струни. Инжекциите с автоложен колаген са използвани за първи път през 1995 г. Техниката осигурява запазване на първичната структура на автоложните колагенови влакна, включително вътремолекулните ензимно катализирани напречни връзки. Факт е, че естествените колагенови влакна са по-устойчиви на разрушаване от протеази, отколкото реконституирания колаген, в който телопептидите са разрязани. Целостта на телопептидите е важна за кватернерната структура на колагеновите влакна и образуването на напречни връзки между съседни колагенови молекули. За разлика от препаратите от говежди колаген, автоложният колаген не предизвиква имунни реакции у реципиента, но не е достатъчно ефективен като възстановяващ агент. Стабилна корекция може да се постигне чрез локално производство на колаген чрез трансплантация на автоложни фибробласти. Въпреки това, по време на изследването на ефективността на автоложната трансплантация на фибробласти в клиниката, бяха установени някои трудности. В ранния период след трансплантацията на фибробласти клиничният ефект е по-слаб в сравнение с този след въвеждането на говежди колаген. При култивиране на автоложни фибробласти не може да се изключи възможността за трансформация на нормални фибробласти в патологични, така наречените миофибробласти, отговорни за развитието на фиброза и образуване на белези, както се вижда от свиването на колагеновия гел, причинено от специфичното взаимодействие на фибробласти и колагенови фибрили. Освен това, след серийно пасиране in vitro, фибробластите губят способността си да синтезират протеини на извънклетъчния матрикс.

Въпреки това, вече експериментално е разработен метод за култивиране на автоложни човешки фибробласти, който елиминира гореспоменатите недостатъци и не води до онкогенна трансформация на нормални фибробласти. Автоложните фибробласти, получени по този метод, се използват за възстановяване на дефекти в меките лицеви тъкани. В проучване на G. Keller et al. (2000) са лекувани 20 пациенти на възраст от 37 до 61 години с бръчки и атрофични белези. Кожни биопсии (4 mm) от ретроаурикуларната област са транспортирани до лабораторията в стерилни епруветки, съдържащи 10 ml хранителна среда (среда на Eagle с антибиотик, микосептик, пируват и фетален телешки серум). Материалът е поставен в 3-5 хранителни блюда с диаметър 60 mm и е инкубиран в термостат с атмосфера, съдържаща 5% CO2. След 1 седмица клетките са извадени от блюдата чрез трипсинизация и са поставени във флакони с обем 25 cm2. Клетките са инжектирани в пациенти в количество 4 x 107. Значителен и устойчив клиничен ефект е наблюдаван при пациенти по време на корекция на назолабиалните гънки, както и при пациенти с белези 7 и 12 месеца след третата трансплантация на автоложни фибробласти. Според флоуцитометрия, култивираните фибробласти са произвели голямо количество колаген тип I. In vitro проучванията са показали нормална контрактилност на инжектираните фибробласти. Два месеца след подкожното приложение на култивирани фибробласти в доза от 4 x 107 клетки, не са открити тумори при голи мишки. Инжектираните фибробласти не са причинили образуване на белези или дифузна фиброза при пациентите. Според автора, присадените автоложни фибробласти са способни постоянно да произвеждат колаген, което ще осигури козметичен подмладяващ ефект. В същото време, тъй като животът на диференцираните клетки е ограничен, фибробластите, взети от млад пациент, са по-ефективни от тези, получени от възрастни хора. В бъдеще се предполага, че ще бъде възможно криоконсервирането на култура от фибробласти, взети от млад донор, с цел по-късно трансплантация на негови млади клетки на възрастен пациент. В заключение, не е напълно правилно да се заключи, че автоложните фибробласти, при условие че са функционално запазени, са идеално средство за коригиране на дефекти на меките тъкани на лицето. В същото време самият автор отбелязва, че по време на проучването са възникнали някои проблемни ситуации, свързани с използването на автоложната фибробластно-колагенова система. Клиничният ефект често е бил по-слаб, отколкото при използване на говежди колаген, което е предизвиквало разочарование у пациентите.

Като цяло, литературните данни за перспективите за клиничното приложение на мезенхимни стволови клетки изглеждат доста оптимистични. Правят се опити за използване на автоложни мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки от костен мозък за лечение на дегенеративни ставни лезии. Провеждат се първите клинични изпитвания за използването на култивирани мезенхимни прогениторни клетки при лечението на сложни костни фрактури. Авто- и алогенни мезенхимни стромални клетки от костен мозък се използват за създаване на хрущялна тъкан за трансплантация при коригиране на дефекти на ставния хрущял, дължащи се на травма или автоимунни лезии. Разработват се методи за клинично приложение на мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки за елиминиране на костни дефекти при деца с тежка форма на непълна остеогенеза, причинена от мутации в гена за колаген тип I. След миелоаблация, на децата реципиенти се трансплантира костен мозък от HLA-съвместими здрави донори, тъй като нефракционираният костен мозък може да съдържа достатъчен брой мезенхимни стволови клетки, за да компенсира тежък костен дефект. След трансплантация на алогенен костен мозък, такива деца показват положителни хистологични промени в трабекуларните кости, повишаване на скоростта на растеж и намаляване на честотата на костни фрактури. В някои случаи положителен клиничен резултат се постига чрез трансплантация на близкородствени алогенни костен мозък и остеобласти. Трансплантацията на мезенхимни стволови клетки (МСК) се използва и за лечение на вродена костна чупливост, причинена от дисбаланс на остеобластите и остеокластите в костната тъкан. В този случай възстановяването на костното образуване се постига чрез химеризация на пула от стволови и прогениторни стромални клетки в костната тъкан на пациентите.

Продължава усъвършенстването на методите за генетична модификация на донорски мезенхимни стволови клетки с цел коригиране на генетични дефекти на стромалните тъкани. Предполага се, че в близко бъдеще мезенхимните прогениторни клетки ще бъдат използвани в неврологията за целенасочена химеризация на мозъчни клетки и създаване на здрав пул от клетки, способни да генерират дефицитен ензим или фактор, отговорен за клиничните прояви на заболяването. Трансплантацията на мезенхимни стволови клетки може да се използва за възстановяване на стромата на костния мозък при онкологични пациенти след лъче- и химиотерапия, а в комбинация с клетки от костен мозък - за възстановяване на хематопоезата. Развитието на заместителна терапия, насочена към елиминиране на дефекти на опорно-двигателния апарат с помощта на мезенхимни стволови клетки, се насърчава от инженерните разработки в областта на проектирането на матрични биоматериали или биомиметици, образуващи рамки, населени с потомство на мезенхимни стволови клетки.

Източници на мезенхимни стволови клетки

Основният източник на мезенхимни стволови клетки е костният мозък, чиито хематопоетични стволови клетки в тялото на бозайниците постоянно се диференцират в кръвни клетки и клетки на имунната система, докато мезенхимните стволови клетки са представени от малка популация от фибробластоподобни клетки на стромата на костния мозък и допринасят за запазването на недиференцираното състояние на хематопоетичните стволови клетки. При определени условия мезенхимните стволови клетки се диференцират в хрущялни и костнотъканни клетки. Когато се посяват върху хранителна среда при условия на ниска плътност на засяване, мононуклеарните стромални клетки на костния мозък образуват колонии от адхезивни клетки, които всъщност са фибробластоподобни мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки. Някои автори смятат, че в костния мозък се отлагат неангажирани мезенхимни стволови клетки, които поради способността си за самообновяване и високия потенциал за диференциация, осигуряват на всички тъкани на тялото мезенхимни прекурсори на стромални елементи през целия живот на бозайниковия организъм.

В костния мозък стромалните клетъчни елементи образуват мрежа, запълваща пространството между синусоидите и костната тъкан. Съдържанието на латентни МСК в костния мозък на възрастен е сравнимо с количеството хематопоетични стволови клетки и не надвишава 0,01-0,001%. Мезенхимните стволови клетки, изолирани от костен мозък и неподложени на култивиране, са лишени от адхезионни молекули. Такива МСК не експресират CD34, ICAM, VCAM, колаген тип I и III, CD44 и CD29. Следователно, in vitro, не мезенхимните стволови клетки се фиксират върху културалния субстрат, а по-напреднали прогениторни производни на мезенхимните стволови клетки, които вече са формирали компонентите на цитоскелета и рецепторния апарат на клетъчните адхезионни молекули. Стромални клетки с CD34 фенотип се откриват дори в периферната кръв, въпреки че в костния мозък има значително по-малко от CD34-позитивните мононуклеарни клетки. CD34 клетки, изолирани от кръвта и прехвърлени в култура, се прикрепят към субстрата и образуват колонии от фибробластоподобни клетки.

Известно е, че в ембрионалния период стромалната основа на всички органи и тъкани на бозайници и хора възниква от общ набор от мезенхимни стволови клетки преди и на етапа на органогенезата. Следователно се смята, че в зрял организъм по-голямата част от мезенхимните стволови клетки трябва да се намират в съединителната и костната тъкан. Установено е, че основната част от клетъчните елементи на стромата на рехавата съединителна и костна тъкан е представена от ангажирани прогениторни клетки, които обаче запазват способността си да пролиферират и да образуват клонинги in vitro. Когато такива клетки се въведат в общия кръвен поток, повече от 20% от мезенхимните прогениторни клетки се имплантират сред стромалните елементи на хематопоетичната тъкан и паренхимните органи.

Потенциален източник на мезенхимни стволови клетки е мастната тъкан, сред стволовите клетки на която са идентифицирани адипоцитни прекурсори, ангажирани в различна степен. Най-слабо зрелите прогениторни елементи на мастната тъкан са стромално-съдовите клетки, които, подобно на мултипотентните мезенхимни прекурсорни клетки на костния мозък, са способни да се диференцират в адипоцити под влиянието на глюкокортикоиди, инсулиноподобен растежен фактор и инсулин. В култура стромално-съдовите клетки се диференцират в адипоцити и хондроцити, а в мастна тъкан с произход от костния мозък има клетки, които образуват адипоцити и остеобласти.

Стромални стволови клетки са открити и в мускулите. В първичната култура от клетки, изолирани от човешки скелетен мускул, се откриват звездовидни клетки и многоядрени миотуби. В присъствието на конски серум звездовите клетки пролиферират in vitro без признаци на цитодиференциация и след добавяне на дексаметазон към хранителната среда, тяхната диференциация се характеризира с появата на клетъчни елементи с фенотипа на скелетни и гладкомускулни клетки, костна, хрущялна и мастна тъкан. Следователно, в човешката мускулна тъкан присъстват както ангажирани, така и некомитирани мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки. Доказано е, че популацията от прогениторни клетки, присъстващи в скелетните мускули, произхожда от некомитирани мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки на костния мозък и се различава от миогенните сателитни клетки.

Адхезивни звездовидни клетки, съответстващи на мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки по диференциационен потенциал, също са открити в миокарда на новородени плъхове, тъй като под влияние на дексаметазон те се диференцират в адипоцити, остеобласти, хондроцити, гладкомускулни клетки, миотуби на скелетните мускули и кардиомиоцити. Беше показано, че съдовите гладкомускулни клетки (перицити) са производни на недиференцирани периваскуларни мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки. В култура периваскуларните мезенхимни стволови клетки експресират гладкомускулен α-актин и рецептор за тромбоцитен растежен фактор и са способни да се диференцират поне в гладкомускулни клетки.

Специално място, от гледна точка на стволовите резерви, заема хрущялната тъкан, чийто изключително нисък репаративен потенциал се смята, че се дължи на дефицит на мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки или фактори на диференциация и растеж. Предполага се, че мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки, предварително ангажирани с хондро- и остеогенеза, навлизат в хрущялната тъкан от други тъканни източници.

Тъканният произход и условията на ангажиране на мезенхимните прогениторни клетки в сухожилията също не са установени. Експериментални наблюдения показват, че в ранния постнатален период клетките на ахилесовото сухожилие на зайци в първични култури и при първия пасаж запазват експресията на колаген тип I и декорин, но при по-нататъшно култивиране губят маркерите за диференциация на теноцитите.

Трябва да се отбележи, че все още не е получен отговор на въпроса дали мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки, локализирани в различни тъкани, действително постоянно присъстват в тяхната строма или тъканният пул от мезенхимни стволови клетки се попълва от миграцията на стромални стволови клетки от костен мозък.

В допълнение към костния мозък и други мезенхимни тъканни зони на възрастен организъм, кръвта от пъпна връв може да бъде друг източник на МСК. Доказано е, че кръвта от пъпна връвна вена съдържа клетки, които имат сходни морфологични и антигенни характеристики с мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки, способни са на адхезия и не отстъпват на мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки с костен мозък по диференциационен потенциал. В култури от мезенхимни стволови клетки от кръв от пъпна връв са открити от 5 до 10% от неангажираните мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки. Оказа се, че броят им в кръвта от пъпна връв е обратнопропорционален на гестационната възраст, което косвено показва миграцията на мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки към различни тъкани по време на феталното развитие. Появи се първата информация за клиничното приложение на мезенхимни стволови клетки, изолирани от кръв от пъпна връв, както и на такива, получени от ембрионален биоматериал, което се основава на известната способност на феталните стволови клетки да се интегрират, присаждат и функционират в органите и тъканните системи на възрастни реципиенти.

Търсене на нови източници на мезенхимни стволови клетки

Използването на мезенхимни стволови клетки от ембрионален произход, както и на други фетални клетки, създава редица етични, правни, съдебни и законодателни проблеми. Поради това търсенето на екстраембрионален донорски клетъчен материал продължава. Опит за клинично приложение на човешки кожни фибробласти беше неуспешен, което беше предопределено не само от високия финансов капацитет на технологията, но и от бързата диференциация на фибробластите във фиброцити, които имат значително по-нисък пролиферативен потенциал и произвеждат ограничен брой растежни фактори. По-нататъшният напредък в изучаването на биологията на МСК и мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки от костен мозък ни позволи да разработим стратегия за клинично приложение на автоложни мезенхимни стволови клетки. Технологията на тяхното изолиране, култивиране, ex vivo възпроизвеждане и целенасочена диференциация изискваше, на първо място, изучаване на спектъра от молекулярни маркери на МСК. Техният анализ показа, че първичните култури от човешка костна тъкан съдържат няколко вида мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки. Проостеобластният фенотип е открит в клетки, експресиращи маркера на стромални прогениторни клетки STRO-1, но не носещи остеобластния маркер - алкална фосфатаза. Такива клетки се характеризират с ниска способност за образуване на минерализирана костна матрица, както и с липса на експресия на остеопонтин и рецептор за паратиреоиден хормон. Производните на STRO-1-позитивни клетки, които не експресират алкална фосфатаза, са представени от междинно и напълно диференцирани остеобласти. Установено е, че клетъчните елементи на клонирани линии от STRO-1-позитивни човешки трабекуларни костни клетки са способни да се диференцират в зрели остеоцити и адипоцити. Посоката на диференциация на тези клетки зависи от ефекта на полиненаситени мастни киселини, провъзпалителни цитокини - IL-1b и тумор некрозисен фактор a (TNF-a), както и противовъзпалителен и имуносупресивен TGF-b.

По-късно е установено, че мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки нямат специфичен фенотип, присъщ само на тях, но експресират комплекс от маркери, характерни за мезенхимни, ендотелни, епителни и мускулни клетки при липса на експресия на имунофенотипни антигени на хематопоетичните клетки - CD45, CD34 и CD14. Освен това, мезенхимните стволови клетки конститутивно и индуцируемо произвеждат хематопоетични и нехематопоетични растежни фактори, интерлевкини и хемокини, а рецептори за някои цитокини и растежни фактори се експресират върху мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки. Сред клетките на стромалната матрица на човешкото тяло са открити латентни, или почиващи, клетки с имунофенотип, почти идентичен с антигенния профил на нетретираните с 5-флуороурацил мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки - и двете клетки експресират CD117, което маркира „възрастни“ стволови клетки.

Следователно, все още не е идентифициран клетъчен маркер, уникален за мезенхимните стволови клетки. Предполага се, че латентните клетки представляват популация от некондиционирани мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки, тъй като те не експресират маркери на клетки, ангажирани с остео- (Cbfa-1) или адипогенеза (PPAR-γ-2). Продължителното излагане на бавно пролифериращи латентни клетки на фетален говежди серум води до образуването на терминално диференциращи се кондиционирани прогенитори, характеризиращи се с бърз растеж. Клоналната експанзия на такива мезенхимни стволови клетки се поддържа от FGF2. Изглежда, че геномът на стромалните стволови клетки е доста плътно „затворен“. Има съобщения за липса на спонтанна диференциация в MSCs - без специални условия за ангажиране, те не се трансформират дори в клетки от мезенхимния род.

За да се изследва структурата на популацията на производни на мезенхимни стволови клетки, се провежда търсене на диференциационни маркерни протеини върху стромални клетъчни линии и в първични култури. In vitro клонален анализ на колониално-образуващи клетки от костен мозък показва, че EGF увеличава средния размер на колонията и намалява клоналната експресия на алкална фосфатаза, когато се прилага върху първични култури, докато добавянето на хидрокортизон активира експресията на алкална фосфатаза, която е маркер на остеогенната посока на диференциация на MSC. Моноклоналните антитела към STRO-1 правят възможно разделянето и изследването на популацията на STRO-1-позитивни адхезивни клетки в хетерогенна система от Dexter култури. Определен е спектър от цитокини, които регулират не само пролиферацията и диференциацията на хематопоетични и лимфоидни клетки, но и участват във формирането, образуването и резорбцията на скелетните тъкани чрез пара-, авто- и ендокринни механизми. Рецепторно-медиираното освобождаване на такива вторични посредници като cAMP, диацилглицерол, инозитол трифосфат и Ca2+ също се използва за маркерен анализ на различни категории клетки от стромална тъкан, експресиращи съответните рецептори. Използването на моноклонални антитела като маркери позволи да се установи принадлежността на ретикуларните клетки на стромата на лимфоидните органи към Т- и В-зависимите зони.

Известно време продължават научните дебати около въпроса за възможността за произход на МСК от хематопоетични стволови клетки. Всъщност, когато суспензии от клетки от костен мозък се експлантират в монослойни култури, в тях растат отделни колонии от фибробласти. Въпреки това, беше показано, че наличието на прекурсори на фибробластни колонии и различни кълнове на диференциация на хематопоетична тъкан в костния мозък не е доказателство за общия им произход от хематопоетична стволова клетка. Чрез дискриминантен анализ на стволови клетки от костен мозък беше установено, че микросредата по време на хетеротопна трансплантация на костен мозък не се пренася от хематопоетични клетки, което доказва съществуването на популация от МСК в костния мозък, която е хистогенетично независима от хематопоетичните клетки.

Освен това, методът на селективно клониране позволи да се идентифицира нова категория стромални прогениторни клетки в монослойни култури от клетки на костен мозък, да се определи техният брой и да се изследват техните свойства, пролиферативни и диференциращи потенциали. Оказа се, че стромалните фибробластоподобни клетки пролиферират in vitro и образуват диплоидни колонии, които при трансплантация обратно в тялото осигуряват образуването на нови хематопоетични органи. Резултатите от изследването на отделни клонове показват, че сред стромалните прогениторни клетки има популация от клетки, които чрез своя пролиферативен и диференциращ потенциал могат да претендират за ролята на стволови клетки на стромална тъкан, хистогенетично независими от хематопоетичните стволови клетки. Клетките от тази популация се характеризират със самоподдържащ се растеж и се диференцират в прогениторни клетъчни елементи на костната, хрущялната и ретикуларната тъкан на костния мозък.

Голям интерес представляват резултатите от изследванията на Р. Чайлахян и съавтори (1997-2001), които култивират костномозъчни стромални прогениторни клетки от зайци, морски свинчета и мишки върху хранителна среда a-MEM с добавяне на фетален телешки серум. Авторите извършват експлантация с начална плътност от 2-4 x 103 костномозъчни клетки на 1 cm2. Като хранилка са използвани хомоложни или хетероложни радиационно-инактивирани костномозъчни клетки в доза, която запазва ефекта на хранилката, но напълно блокира тяхната пролиферация. Двуседмични първични дискретни колонии от фибробласти са трипсинизирани за получаване на моноклонални щамове. Доказателства за клоналния произход на колониите са получени с помощта на хромозомен маркер в смесени костномозъчни култури на мъжки и женски морски свинчета, time-lapse фотография на живи култури и в смесени култури от сингенен костен мозък на мишки CBA и CBAT6T6. Трансплантация на суспензия от прясно изолирани клетки от костен мозък или in vitro култивирани стромални фибробласти под бъбречната капсула беше извършена в порести скелета от ивалон или желатин, както и в инактивирана гъбеста костна матрица от заек. За трансплантация на клонинги в костна обвивка, бедрените кости на морски свинчета бяха почистени от меки тъкани и периост, епифизите бяха подрязани и костният мозък беше старателно промит. Костта беше нарязана на фрагменти (3-5 mm), изсушена и облъчена с доза от 60 Gy. Отделни колонии от фибробласти бяха поставени в костни обвивки и имплантирани интрамускулно. За интраперитонеална трансплантация на стромални фибробласти, култивирани in vitro, бяха използвани дифузионни камери от тип А (V=0,015 cm3, h=0,1 mm) и О (V=0,15 cm3, h=2 mm).

При изучаване на динамиката на растежа на клонални щамове, R. Chailakhyan et al. (2001) установяват, че отделните клетки, образуващи фибробластни колонии, както и техните потомци, имат огромен пролиферативен потенциал. До 10-ия пасаж броят на фибробластите в някои щамове е бил 1,2-7,2 x 109 ^клетки. По време на развитието си те са извършвали до 31-34 клетъчни удвоявания. В този случай хетеротопната трансплантация на щамове, получени от костен мозък, образувани от стромални прекурсори на няколко десетки клона, е довела до прехвърляне на микросредата на костния мозък и образуване на нов хематопоетичен орган в зоната на трансплантация. Авторите поставят въпроса дали отделните клонове са способни да прехвърлят микросредата на костния мозък на стромалните клетки или за това е необходимо сътрудничество на няколко различни клоногенни стромални прекурсора? И ако отделните клонове са способни да прехвърлят микросредата, ще бъде ли тя пълна за всичките три хематопоетични кълна, или различни клонове осигуряват формирането на микросредата за различните хематопоетични кълнове? За да се решат тези проблеми, е разработена технология за култивиране на стромални прогениторни клетки върху колагенов гел, позволяваща отглежданите колонии от фибробласти да бъдат отстранени от повърхността за последваща хетеротопна трансплантация. Отделни клонове на стромални фибробласти, отгледани от клетки от костен мозък на CBA мишки и морски свинчета, са изрязани заедно с фрагмент от геловото покритие и хетеротопно трансплантирани - под бъбречната капсула на сингенни мишки или в коремния мускул на автоложни морски свинчета. При трансплантация в мускула, колониите върху гела са поставени в костни обвивки.

Авторите установяват, че 50-90 дни след трансплантация на фибробластни колонии от костен мозък, в зоната на трансплантация е наблюдавано развитие на костна или костна и хематопоетична тъкан в 20% от случаите. При 5% от реципиентните животни, образуваните огнища от костна тъкан съдържат кухина, запълнена с костен мозък. Вътре в костните цилиндри такива огнища имат заоблена форма и капсула, изградена от костна тъкан с остеоцити и добре развит остеобластен слой. Кухината на костния мозък съдържа ретикуларна тъкан с миелоидни и еритроидни клетки, чието пропорционално съотношение не се различава от това в нормалния костен мозък. В бъбрека трансплантатът е типичен костномозъчен орган, образуван по време на трансплантация на естествен костен мозък, като костната капсула покрива кухината на костния мозък само от страната на бъбречната капсула. Хематопоетичната тъкан включва миелоидни, еритроидни и мегакариоцитни елементи. Стромата на кухината на костния мозък има добре развита синусова система и съдържа типични мастни клетки. В същото време в зоната на трансплантация на някои колонии под бъбречната капсула е открита костна тъкан без признаци на хематопоеза. Изследването на пролиферативния и диференциращ потенциал на отделни клонове е продължено върху моноклонални щамове костен мозък на зайци, чиито клетки са ресуспендирани в хранителна среда и в отделна ивалонова гъба с маса 1-2 mg са трансплантирани под бъбречната капсула на донор на костен мозък от заек. Клетки от 21 моноклонални щама са подложени на такава автотрансплантация. Резултатите са взети предвид след 2-3 месеца. Авторите установяват, че в 14% от случаите трансплантираните моноклонални щамове образуват костномозъчен орган, състоящ се от костна тъкан и костномозъчна кухина, изпълнена с хематопоетични клетки. В 33% от случаите трансплантираните щамове образуват компактна кост с различен размер с остеоцити, вградени в кухините, и развит остеобластен слой. В някои случаи в гъбите с трансплантирани клонове се развива ретикуларна тъкан без костни или хематопоетични елементи. Понякога се образува ретикуларна строма с добре развита мрежа от синусоиди, но не е заселена с хематопоетични клетки. По този начин, получените резултати са подобни на данните, получени по време на трансплантация на клонове върху колагенов гел. Ако обаче трансплантацията на клонове, отглеждани върху субстрат, е довела до образуване на костномозъчна тъкан в 5% от случаите, костна тъкан в 15% и ретикуларна тъкан в 80% от случаите, то при трансплантация на моноклонални щамове образуването на костномозъчни елементи е наблюдавано в 14% от случаите, костна тъкан в 53% и ретикуларна тъкан в 53% от случаите. Според авторите, това показва, че условията за реализиране на пролиферативния и диференциращ потенциал на стромалните фибробласти по време на трансплантация върху порести скелета са били по-оптимални, отколкото по време на трансплантацията им в костни обвивки и върху колагенов субстрат.Възможно е използването на по-усъвършенствани методи за култивиране и обратна трансплантация на клонинги да подобри условията за реализиране на техния диференциационен потенциал от клонингите и да промени тези съотношения. По един или друг начин, но основното значение на проведените изследвания е, че някои клонинги на стромални клетки са способни да образуват костна тъкан и едновременно с това да осигуряват стромална хематопоетична микросреда за три кълнове на костномозъчната хематопоеза едновременно: еритроидно, миелоидно и мегакариоцитно, създавайки доста големи платформи от хематопоетична тъкан и известна костна маса.

След това авторите разглеждат въпроса за способността на отделните клоногенни стромални прогениторни клетки да претърпяват тези видове клетъчна диференциация в затворена система от дифузионни камери. Освен това е необходимо да се определи дали отделните клонове притежават полипотентност или дали проявата на диференциационен потенциал изисква кооперативно взаимодействие на няколко клона с фиксирана цитодиференцираща черта, чиито различни съотношения определят преференциалното образуване на костна, ретикуларна или хрущялна тъкан. Чрез комбиниране на два методологични подхода - получаване на моноклонални щамове на стромални прогениторни клетки от костен мозък и трансплантирането им в дифузионни камери - Р. Чайлахян и съавтори (2001) получават резултати, които им позволяват да се доближат до разбирането на структурната организация на стромата на костния мозък. Трансплантацията на моноклонални щамове на стромални прогениторни клетки в О-тип камери води до образуването както на костна, така и на хрущялна тъкан, което показва способността на потомците на една единствена стромална колониообразуваща клетка едновременно да образуват костна и хрущялна тъкан. Предположението, че костната и хрущялната тъкан произхождат от обща стромална прогениторна клетка, е многократно изтъквано. Тази хипотеза обаче нямаше правилно експериментално потвърждение. Образуването на кост и хрущял в дифузионни камери беше необходимото доказателство за съществуването на обща прогениторна клетка за тези два вида тъкан сред стромалните стволови клетки на костния мозък.

След това 29 клонални щама от втория до третия пасаж, получени от първични култури от костен мозък на заек, бяха поставени в дифузионни камери и имплантирани интраперитонеално в хомоложни животни. Проучванията показаха, че 45% от моноклоналните щамове от костен мозък притежават остеогенен потенциал. Девет камери съдържаха изключително ретикуларна тъкан, но тя присъстваше заедно с костна и хрущялна тъкан в още 13 камери, което представляваше 76% от всички щамове. В камери тип О, където беше възможна диференциация както на костна, така и на хрущялна тъкан, бяха изследвани 16 щама. В четири камери (25%) се образуваха както костна, така и на хрущялна тъкан. Трябва да се отбележи още веднъж, че в изследванията на R. Chailakhyan et al. (2001) отделните прогениторни клетки претърпяха от 31 до 34 удвоявания в рамките на клетъчен щам, а тяхното потомство се състоеше от 0,9-2,0 x 109 ^клетки. Броят на митозите, които прогениторните клетки на поликлоналните щамове претърпяха, беше практически идентичен с този на моноклоналните щамове. Скоростта на развитие на поликлонални щамове, особено в първата фаза на тяхното формиране, зависи до голяма степен от броя на колониите, използвани за инициирането на щамовете. Диплоидните щамове на човешки ембрионални фибробласти (WI-38), когато са реклонирани на 12-15-то ниво на удвояване, също образуват колонии, които се различават по диаметър и клетъчно съдържание. Големите колонии, съдържащи повече от 103 клетки, съставляват само 5-10%. С увеличаване на броя на деленията процентът на големите колонии намалява. Моно- и поликлоналните щамове на костномозъчни стромални фибробласти запазват диплоиден набор от хромозоми след 20 или повече удвоявания, а тенденцията на тяхното развитие е сравнима с динамиката на развитие на диплоидните щамове на ембрионални фибробласти. Анализът на потенциала за диференциация на отделни костномозъчни стромални прогениторни клетки, извършен чрез трансплантиране на моноклонални щамове в дифузионни камери, показва, че половината от тях са остеогенни. Големите колонии представляват 10% от общия им брой. Следователно, броят на остеогенните колонии-образуващи клетки съответства на приблизително 5% от общата им популация. Общата маса на остеогенните прогениторни клетки, идентифицирани от авторите, включва клетки, способни едновременно да образуват костна и хрущялна тъкан. Освен това за първи път е установено, че тези два вида тъкани във възрастен организъм имат обща прогениторна клетка: 25% от тестваните клонинги са създадени от такива клетки, а броят им сред общата популация от прогениторни клетки е най-малко 2,5%.

По този начин, хетеротопната трансплантация на отделни клонове на фибробласти от костен мозък разкри нови аспекти на структурната организация на популацията от мезенхимни прогениторни клетки. Открити са стромални прогениторни клетки, способни да пренасят специфична микросреда за всички хематопоетични кълнове едновременно, броят на които сред изследваните големи клонове в различни модели варира от 5 до 15% (0,5-1,5% от общия брой открити прогениторни клетки). Наред с клоновете, които пренасят пълната микросреда на костния мозък, съществуват прогениторни клетки, определени само за остеогенеза, които, когато се пренасят в отворена система, образуват костна тъкан, която не подпомага развитието на хематопоезата. Техният брой от общия брой прогениторни клетки е 1,5-3%. Някои от тези клетки са способни да образуват костна тъкан с ограничен период на самоподдържане. Следователно, популацията от стромални прогениторни клетки е хетерогенна по своя диференциационен потенциал. Сред тях има категория клетки, които твърдят, че са стромални стволови клетки, способни да се диференцират и в трите посоки, характерни за стромалната тъкан на костния мозък, образувайки костна, хрущялна и ретикуларна тъкан. Представените данни ни позволяват да се надяваме, че с помощта на различни клетъчни маркери ще бъде възможно да се определи приносът на всеки тип стромални клетки за организирането на специфична микросреда и поддържането на хематопоезата в Dexter култури.

Характеристики на мезенхимните стволови клетки

През последните години е установено, че в стационарни култури от костен мозък, мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки са представени от ограничена популация от малки агранулирани клетки (RS-1 клетки), характеризиращи се с нисък капацитет за образуване на колонии и липса на експресия на Ki-67 антигена, специфичен за пролифериращите клетки. Антигенните параметри на латентните RS-1 клетки се различават от спектъра на антигените на бързо пролифериращите ангажирани стромални прогениторни клетки. Установено е, че висока скорост на пролиферация на ангажирани прогениторни клетки се наблюдава само в присъствието на RS-1 клетки. От своя страна, RS-1 клетките увеличават скоростта си на растеж под влиянието на фактори, секретирани от най-зрелите производни на мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки. Изглежда, че RS-1 клетките са подклас на некомитирани MSCs, способни на рециклиране. In vitro, 5-флуороурацил-резистентните стромални прогениторни клетки от костен мозък се характеризират с ниско съдържание на РНК и висока експресия на гена орнитин декарбоксилаза, маркер на непролифериращи клетки.

Интензивната пролиферация на стромални прогениторни клетки започва след фиксирането им върху субстрата. В този случай се експресира маркерният профил на слабо диференцираните клетки: SH2 (TGF-(3) рецептор), SH3 (сигнален протеинов домейн), колаген тип I и III, фибронектин, адхезионни рецептори VCAM-1 (CD106) и ICAM (CD54), кадхерин-11, CD44, CD71 (трансферинов рецептор), CD90, CD120a и CD124, но без експресията на характерни маркери на хематопоетичните стволови клетки (CD34, CD14, CD45). Клоналният растеж прави възможно многократното пасиране на мезенхимни стволови клетки с образуването на множество генетично хомогенни стромални прогениторни плурипотентни клетки в културата. След 2-3 пасажа броят им достига 50-300 милиона. В култура с достатъчна плътност, след като пролиферацията е спряла, стромалните прогениторни клетки, за разлика от фибробластите на хематопоетичната тъкан, се диференцират в адипоцити, миоцити, хрущялни и костни клетки. Комбинация от три регулаторни диференциационни сигнала, включително 1-метил-изобутилксантин (индуктор на вътреклетъчно образуване на цАМФ), дексаметазон (инхибитор на фосфолипази А и С) и индометацин (инхибитор на циклооксигеназа, който също намалява активността на тромбоксан синтазата), превръща до 95% от прогениторните мезенхимни клетки в адипоцити. Образуването на адипоцити от незрели стромални елементи се потвърждава от експресията на гена на липопротеин липазата, хистохимичното откриване на аполипопротеини и пероксизомни рецептори. Клетките от един и същ клон под влиянието на TGF-b в безсерумна среда създават хомогенна популация от хондроцити. Многослойната клетъчна култура на тази хрущялна тъкан се характеризира с развита междуклетъчна матрица, състояща се от протеогликан и колаген тип II. В хранителна среда с 10% ефектът на диференциационен сигнален комплекс, състоящ се от b-глицерофосфат (неорганичен донор на фосфат), аскорбинова киселина и дексаметазон в една и съща култура от стромални прогениторни клетки, води до образуването на клетъчни агрегати. В такива клетки се наблюдава прогресивно повишаване на активността на алкалната фосфатаза и нивата на остеопонтин, което показва образуването на костна тъкан, минерализацията на клетките на която се потвърждава от прогресивно повишаване на вътреклетъчното съдържание на калций.

Според някои данни, способността на мезенхимните стволови клетки към неограничено делене и размножаване на различни видове клетки от мезенхимната диференциационна линия се съчетава с висока степен на пластичност. Когато бъдат въведени в камерите или бялото вещество на мозъка, мезенхимните стволови клетки мигрират към паренхима на нервната тъкан и се диференцират в производни на глиалната или невронната клетъчна линия. Освен това има информация за трансдиференциацията на МСК в хематопоетични стволови клетки както in vitro, така и in vivo. По-задълбочен анализ в някои изследвания е определил изключително висока пластичност на МСК, която се проявява в способността им да се диференцират в астроцити, олигодендроцити, неврони, кардиомиоцити, гладкомускулни клетки и скелетни мускулни клетки. Редица изследвания върху трансдиференциационния потенциал на МСК in vitro и in vivo са установили, че мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки с произход от костен мозък се диференцират терминално в клетъчни линии, които образуват костна, хрущялна, мускулна, нервна и мастна тъкан, както и сухожилия и строма, които поддържат хематопоезата.

Други проучвания обаче не успяха да разкрият никакви признаци на ограничаване на плурипотентността на генома на мезенхимните стволови клетки и прогениторните популации на стромални клетки, въпреки че повече от 200 клона на МСК, изолирани от една първична култура, бяха изследвани, за да се тества възможната плурипотентност на стромални клетки. По-голямата част от клонингите in vitro запазиха способността си да се диференцират в остеогенна, хондрогенна и адипогенна посоки. При изключване на вероятността от миграция на реципиентните клетки чрез трансплантация на мезенхимни стволови клетки под бъбречната капсула или в дифузионни камери, се оказа, че стромалните прогениторни клетки in situ запазват хетерогенен фенотип, което показва или липса на рестрикционни фактори в зоната на трансплантация, или липса на плурипотентност на МСК като такава. В същото време се допуска съществуването на рядък тип соматични плурипотентни стволови клетки, които са общи предшественици на всички възрастни стволови клетки.

Мулти-, но не и плурипотентността на истинските мезенхимни стволови клетки, които съставляват много малка част от клетките на костния мозък и са способни да пролиферират при определени условия по време на in vitro култивиране без да се диференцират, се доказва от индуцираното им ангажиране с костни, хрущялни, мастни, мускулни тъканни клетки, както и с теноцити и стромални елементи, които поддържат хематопоезата. Като правило, продължителното излагане на хранителна среда с фетален телешки серум провокира освобождаването на MSCs в ангажирани стромални прогениторни клетки, чието потомство претърпява спонтанна терминална диференциация. In vitro е възможно да се постигне целенасочено образуване на остеобласти чрез добавяне на дексаметазон, ß-глицерофосфат и аскорбинова киселина към кондициониращата среда, докато комбинация от дексаметазон и инсулинови диференциационни сигнали индуцира образуването на адипоцити.

Установено е, че преди да навлязат в етапа на терминална диференциация, костномозъчните мезенхимни стволови клетки (МСК) първоначално се диференцират във фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки при определени условия на култивиране. Производните на тези клетки in vivo участват във формирането на кости, хрущяли, сухожилия, мастна и мускулна тъкан, както и на стромата, която поддържа хематопоезата. Много автори разбират термина „мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки“ както самите МСК, така и ангажирани стромални прогениторни клетки от костен мозък и мезенхимни тъкани. Клоновият анализ на мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки с произход от костен мозък показа, че малко повече от една трета от всички клонове се диференцират в остео-, хондро- и адипоцити, докато клетките на останалите клонове имат само остеогенен потенциал и образуват само хондро- и остеоцити. Клон от мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки, като BMC-9, при подходящи условия на микросредата, се диференцира в клетки с фенотипа и функционалните характеристики не само на остеобласти, хондроцити и адипоцити, но и на стромални клетки, които поддържат хематопоезата. Клон от RCJ3.1 клетки, изолирани от костен мозък на плъши фетус, се диференцират в мезенхимни клетки с различни фенотипове. Под комбинираното действие на аскорбинова киселина, b-глицерофосфат и дексаметазон, клетъчните елементи на този клон първо образуват многоядрени миоцити, а след това последователно адипоцити, хондроцити и островчета от минерализирана костна тъкан. Популацията от гранулирани клетки от периоста на плъши фетуси съответства на некоммитирани мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки, тъй като се характеризира с ниска скорост на пролиферация, не експресира маркери за диференциация и при условия на култивиране се диференцира, за да образува хондро-, остео- и адипоцити, както и гладкомускулни клетки.

Следователно, трябва да се признае, че въпросът за плури- или мултипотентността на генома на мезенхимните стволови клетки остава отворен, което съответно влияе и върху представите за диференциационния потенциал на стромалните прогениторни клетки, който също не е окончателно установен.

Експериментално доказана и важна характеристика на мезенхимните стволови клетки е способността им да напускат тъканната ниша и да циркулират в общия кръвен поток. За да се активира програмата за генетична диференциация, такива циркулиращи стволови клетки трябва да попаднат в подходяща микросреда. Доказано е, че при систематично въвеждане на МСК в кръвния поток на реципиентните животни, незрелите клетки се имплантират в различни органи и тъкани, като след това се диференцират в кръвни клетки, миоцити, адипоцити, хондроцити и фибробласти. Следователно, в локалните тъканни зони протичат сигнално-регулаторни взаимодействия между некомитирани и комитирани стромални прогениторни клетки, както и между тях и околните зрели клетки. Предполага се, че диференциацията се индуцира от паракринни регулаторни фактори с мезенхимен и немезенхимен произход (растежни фактори, ейкозаноиди, молекули на извънклетъчния матрикс), които осигуряват пространствени и времеви връзки в микросредата на мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки. Следователно, локалното увреждане на мезенхимната тъкан би трябвало да доведе до образуването на зони от микросредата на мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки, които са качествено различни от комплекса от регулаторни сигнали на непокътнатите тъкани, в които протичат физиологични, а не репаративни процеси на регенерация. Тази разлика е изключително важна от гледна точка на специализацията на клетъчния фенотип в нормалната и индуцираната от увреждане микросреда.

Според концепциите, именно тук са заложени механизмите на фундаменталната разлика между двата известни процеса - физиологичната регенерация и възпалителната пролиферация. Първият от тях завършва с възстановяване на специализирания клетъчен състав на тъканта и нейната функция, докато резултатът от осъществяването на процеса на пролиферация е образуването на зрели елементи на съединителната тъкан и загубата на функция на увредената тъканна зона. Следователно, за да се разработят оптимални програми за използване на мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки в регенеративно-пластичната медицина, е необходимо задълбочено проучване на особеностите на влиянието на факторите на микросредата върху диференциацията на МСК.

Зависимостта на структурата на компартмента на стволовите клетки от клетъчни пара- и автокринни регулатори, чиято експресия се модулира от външни сигнали, е без съмнение. Сред функциите на регулаторните фактори най-важни са контролът на асиметричното делене на МСК и експресията на гени, определящи етапите на ангажираност и броя на клетъчните деления. Външните сигнали, от които зависи по-нататъшното развитие на МСК, се осигуряват от тяхната микросреда. В незряло състояние МСК пролиферират дълго време, като същевременно запазват способността си да се диференцират в линии от адипоцити, миофибробласти, хематогенна тъканна строма, хрущялни и костни клетки. Установено е, че ограничена популация от CD34-негативни стромални клетъчни елементи, циркулиращи в кръвта, се връща от общия кръвен поток в стромата на костния мозък, където се трансформира в линии от CD34-позитивни хематопоетични стволови клетки. Тези наблюдения показват, че рециркулацията на прогениторни мезенхимни клетки в кръвния поток поддържа тъканния баланс на стромалните стволови клетки в различни органи чрез мобилизиране на общ пул от незрели стромални елементи на костния мозък. Диференциацията на МСК в клетки с множество мезенхимни фенотипове и тяхното участие в регенерацията или възстановяването на кости, хрущяли, мастна тъкан и сухожилия in vivo е доказана с помощта на модели на адоптивен трансфер при експериментални животни. Според други автори, далечната миграция на МСК по съдовото легло е комбинирана с късо разстояние или локално движение на мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки в тъканта по време на възстановяване на хрущяли, мускулна регенерация и други възстановителни процеси.

Локалните стволови резерви на основата на стромалната тъкан действат като източник на клетки в процесите на физиологична тъканна регенерация и се попълват чрез дистанционен транспорт на мезенхимни стволови клетки (МСК), тъй като ресурсите на стромално-тъканния ствол се изразходват. Въпреки това, в условия на необходимост от спешна мобилизация на репаративния клетъчен потенциал, например при политравма, целият ешелон от МСК участва в процесите на репаративна регенерация, а мезенхимните прогениторни клетки на костния мозък се привличат към периферията чрез общия кръвен поток.

Трансплантация на мезенхимни стволови клетки

Могат да се проследят определени паралели между процесите на физиологична регенерация на тъканите и тяхното формиране по време на вътрематочното развитие. В ембриогенезата на човека и бозайниците, образуването на различни видове специализирани клетки протича от екто-, мезо- и ендодермалния пул на зародишните слоеве, но със задължителното участие на мезенхима. Рехавата клетъчна мрежа от ембрионална мезенхимна тъкан изпълнява множество регулаторни, метаболитни, рамкови и морфогенетични функции. Полагането на провизорните органи става едва след кондензацията на мезенхима поради клоногенния растеж на прогениторните клетки, които генерират първичните морфогенетични сигнали на органогенезата. Стромалните производни на ембрионалния мезенхим създават клетъчната рамка на провизорните органи и формират основата за бъдещото им енергийно-пластично снабдяване поради растежа на първичните кръвоносни и лимфни съдове. С други думи, стромалните елементи на микроциркулаторната единица на феталните органи възникват преди формирането на техните структурни и функционални единици. Освен това, активната миграция на мезенхимните клетки по време на органогенезата осигурява пространствена ориентация на развиващите се органи, като маркира техните обемни граници чрез ограничаване на хомеотичните Hox-типове. Стромалната рамка служи и като основа за сглобяването на структурни и функционални единици на паренхимни органи, които често включват морфогенетично и функционално напълно различни клетки. Следователно, по време на ембриогенезата, функциите на мезенхима са първични и се реализират чрез генериране на регулаторни сигнали, които активират регионалната пролиферация и диференциация на прогениторни епителни клетки. Ембрионалните мезенхимни клетки произвеждат растежни фактори като HGF-b, HGF-b, CSF, за които паренхимните прогениторни клетки имат съответните рецептори. В диференцираната зряла тъкан на възрастен организъм, стромалната мрежа от клетки също генерира сигнали за поддържане на жизнеспособността и пролиферацията на прогениторни клетки с немезенхимен произход. Спектърът на стромалните регулаторни сигнали в постнаталната онтогенеза обаче е различен (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF и др.) и е насочен към осигуряване на физиологична регенерация или възстановяване на увредени тъканни зони. Освен това, спектралните характеристики на стромалните регулаторни фактори във всеки тип тъкан и дори в рамките на един орган са различни. В частност, хематопоезата и лимфопоезата с пролиферация и диференциация на хематопоетични и имунокомпетентни клетки се срещат само в определени органи, в чиито граници функционира стромалната микросреда, осигуряваща условия за узряване на хематопоетичните и лимфоидните клетки. Способността на хематопоетичните и лимфоидните клетки да репопулират даден орган, да пролиферират и да узряват в неговите микроструктурни ниши зависи от регулаторните фактори на микросредата.

Сред компонентите на извънклетъчната матрица, които произвеждат мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки, трябва да се отбележат фибронектин, ламинин, колаген и протеогликани, както и CD44 (хиалуронан и остеопонтинов рецептор), които играят основна роля в организирането на междуклетъчните взаимодействия и формирането на извънклетъчната матрица в костния мозък и костната тъкан. Доказано е, че мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки от костния мозък създават стромална микросреда, която осигурява индуктивни и регулаторни сигнали не само на МСК, но и на хематопоетични прогенитори и други немезенхимни стволови клетки на костния мозък. Известно е, че участието на МСК в хематопоезата се определя от способността им да се диференцират в стромални клетки, които поддържат хематопоезата, и този инструктивн сигнал се получава от МСК директно от хематопоетични стволови клетки. Ето защо в културата мрежата от стромални прогениторни клетки служи като захранваща база за развитието на всички клонове на хематопоетични клетки.

В зрял организъм интензивността на хемо- и лимфопоезата е в състояние на динамично равновесие с „разхода“ на зрели кръвни клетки и клетки на имунната система в периферията. Тъй като стромалните клетки на костния мозък и лимфоидните органи се обновяват изключително рядко, значително преструктуриране на стромалните структури в тях не настъпва. Системата може да бъде извадена от динамично равновесие чрез механично увреждане на който и да е от органите на хемо- или лимфопоезата, което води до равномерни последователни промени, които засягат не само и не толкова хематопоетичните или лимфоидните елементи, колкото стромалните структури на увредения орган. В процеса на репаративна регенерация първо се формира стромалната основа, която след това се репопулира от хематопоетични или имунокомпетентни клетки. Този отдавна известен факт прави посттравматичната регенерация удобен модел за изучаване на стромалната микросреда на хематопоетичните органи. По-специално, механичното изпразване на медуларната кухина на тръбните кости се използва за изучаване на репаративната регенерация на костния мозък - кюретаж, което позволява бързо и ефективно извеждане на хематопоетичната тъкан от състояние на динамично равновесие. При изучаване на процесите на репаративна регенерация на хематопоетичните и стромалните компоненти на костния мозък след механично изпразване на медуларната кухина на пищяла на морски свинчета е установено, че няма пряка корелация между показателите за регенерация на хематопоетичните и стромалните клетки (броят на хематопоетичните клетки, концентрацията и броят на стромалните прогениторни клетки). Освен това се оказа, че увеличаването на популацията на стромалните прогениторни клетки настъпва по-рано след кюретаж, а самите стромални фибробласти стават фосфатазо-позитивни, което е типично за остеогенната тъкан. Установено е също, че кюретажът на 3-5 тръбни кости води до растеж на тази клетъчна популация в костния мозък на неоперирани кости и дори в далака, който при морските свинчета е изключително лимфопоетичен орган.

Морфологичната картина на репаративните процеси в костния мозък на кюретирани тибии на морски свинчета като цяло съответства на данните, описани в литературата, получени при експерименти върху животни от други видове, а динамиката на промените, настъпващи след отстраняване на хематопоетична тъкан, е еднаква за всички животински видове и разликата се отнася само до времевите параметри. Морфологично, фазовият ред на възстановяване на хематопоезата в изпразнената костномозъчна кухина се състои от последователни процеси на организация на кръвен съсирек, образуване на груба фиброзна костна тъкан, нейната резорбция, развитие на синусоиди и образуване на ретикуларна строма, която впоследствие се репопулира от хематопоетични елементи. В този случай броят на прогениторните хематопоетични клетки в процеса на регенерация на костномозъчната тъкан се увеличава паралелно с увеличаването на съдържанието на хематопоетични стволови клетки.

Ю. Герасимов и съавтори (2001) сравняват промените в броя на хематопоетичните клетки и броя на стромалните прогениторни клетки в отделни фази на процеса на регенерация. Оказва се, че количествените промени в клетките на костния мозък в кюретирана кост съответстват на динамиката на морфологичните характеристики на регенерацията. Авторите свързват намаляването на клетъчното съдържание в регенерата през първите три дни със смъртта на хематопоетичните клетки поради неблагоприятния ефект на микросредата, създадена от пролифериращата ретикуларна тъкан в запазения костен мозък в областта на епифизата, както и с образуването на огнища на остеоидна тъкан в последния и съдово увреждане по време на кюретаж. На 7-12-ия ден повишаването на нивото на ядрените клетки съвпада с появата на отделни огнища на миелоидна хематопоеза в зоните на пролиферация на стромални елементи. На 20-ия ден се появяват значителни области от регенериран костен мозък и добре развити синуси, което е съпроводено със значително увеличение на общия брой клетки. Въпреки това, броят на хематопоетичните елементи през този период е 68% от контролното ниво. Това е в съответствие с публикувани по-рано данни, че броят на хематопоетичните клетки след кюретаж достига нормата едва на 35-ия-40-ия ден след операцията.

В ранния посттравматичен период основният източник за възстановяване на хематопоезата са локалните клетъчни елементи, запазени по време на кюретаж. В по-късни етапи основният източник на регенерация на хематопоетичната тъкан на костния мозък са стволовите клетки, репопулиращи свободните стромални зони. Що се отнася до отделните категории стромални клетки (ендотелни, ретикуларни и остеогенни), източниците, които осигуряват тяхното образуване по време на реорганизацията на костномозъчната кухина, остават неясни. Резултатите от изследването на Ю. В. Герасимов и съавтори (2001) показват, че в костния мозък, запазен след кюретаж, концентрацията на клетки, образуващи колонии от фибробласти, е значително по-висока, отколкото в нормалния костен мозък. Авторите смятат, че кюретажът води до по-интензивно селективно отмиване на хематопоетичните клетки в сравнение с колониите, образуващи стромални клетки, които участват във формирането на стромата и са по-силно свързани с основното ѝ вещество, отколкото хематопоетичните клетки.

Динамиката на промяната в броя на клетките, образуващи фибробластни колонии, корелира с интензивността на процесите на остеогенеза, последващата резорбция на костни трабекули и образуването на ретикуларна строма, която е населена от хематопоетични клетки. Повечето от стромалните прогениторни клетки в посочените срокове на регенерация образуват груба фиброзна костна тъкан и ретикуларна строма. При фрактури на бедрената кост при условия на продължителна остеосинтеза, на 5-ия ден в зоната на регенерация концентрацията и броят на клетките, образуващи фибробластни колонии, се увеличават, а по време на периода на интензивно костообразуване броят им се увеличава 6 пъти. Известно е, че клетките на костния мозък, образуващи фибробластни колонии, имат остеогенни свойства. Броят на стромалните прогениторни клетки се увеличава преди заселването на кюретираната територия на костния мозък от хематопоетични клетки. Това е в добро съответствие с данните, че стромалните клетки осигуряват образуването на хематопоетична микросреда. Очевидно създаването на хематопоетична микросреда съответства на определено ниво на регенерация на стромалната тъкан, а броят на хематопоетичните клетки се увеличава с разширяването на стромалната платформа, подходяща за хематопоеза.

Най-голям интерес представляват данните на авторите, че веднага след кюретаж броят на стромалните прогениторни клетки в отдалечените части на скелета се увеличава. Започвайки от шестия час и до двадесетия ден включително, в контралатералната тибия се наблюдава повече от два пъти по-голямо увеличение както на концентрацията, така и на броя на клетките, образуващи фибробластни колонии. Механизмът на това явление вероятно е свързан с факта, че масивното увреждане на костния мозък води до образуването на голям брой кръвни съсиреци с едновременно разрушаване на значителен брой тромбоцити и освобождаване на тромбоцитен растежен фактор (PDGF) в кръвта, за който е известно, че причинява пролиферация на клетки, образуващи фибробластни колонии, разположени в тялото извън пролиферативния пул. В експерименти върху зайци локалното приложение на МСК насърчава възстановяването на хрущялната тъкан на хирургично увредената колянна става, което може да бъде свързано с образуването на хондроцити, произхождащи от инжектираните МСК. Репаративната регенерация на костните дефекти при лабораторни плъхове обаче се подобрява значително чрез използване на мезенхимни стволови клетки, затворени в керамична рамка. Следователно може да се предположи, че ако не RBOC, то някакъв друг фактор, произхождащ от увредени стромални клетки, упражнява отдалечен стимулиращ ефект върху пролиферацията на мезенхимни прогениторни клетки в интактни зони на костен мозък и стимулира тяхната миграция към зоната на дефекта на костния мозък. От своя страна, това противоречи на литературни данни от предходни години, показващи, че стромалните клетки, отговорни за микросредата, за разлика от хематопоетичните клетки, не са способни на миграция и произхождат от локални източници.

Въпреки това, резултатите от изследването на Ю. Герасимов и съавтори (2001) показват, че механичната травма причинява не само рязко преструктуриране на стромалната тъкан в кюретираната кост, но и значителни промени в стромата в отдалечени непокътнати кости, т.е. има системен отговор на стромалната тъкан към локална травма. Освен това, при нанасяне на политравма - множествен кюретаж - тази реакция се засилва и се наблюдава не само в оперираната кост и отдалечени части на скелета, но и в лимфоидните органи, по-специално в далака. Механизмът на такъв системен отговор на стромалната тъкан на костния мозък и далака към локална травма и политравма остава неизвестен. Предполага се, че този процес е свързан с действието на хуморален фактор, секретиран от мезенхимната строма на медуларната кухина на костния мозък. Възможността за производство от стромални клетки на костния мозък и далака на органно-неспецифичен хуморален фактор, отговорен за пролиферацията на клетки, образуващи фибробластни колонии, се доказва от данни за тяхната колониостимулираща активност в монослойни култури от костен мозък.

В тази връзка е важно да се отбележи, че при системно приложение на мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки, техните производни репопулират не само костния мозък, но и други тъкани, което се използва, по-специално, за генна терапия. Доказано е, че при интравенозно приложение на големи количества МСК с див тип геном на мишки с мутация в гена на колаген I, донорските клетки заместват до 30% от клетките в костната и хрущялната тъкан на реципиентите, а трансфектираните миши мезенхимни стволови клетки, секретиращи човешки IL-3, ефективно поддържат хематопоезата в продължение на 9 месеца при едновременното им приложение с човешки хематопоетични стволови клетки на имунодефицитни мишки.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Генетична модификация на мезенхимни стволови клетки

Сред успехите на експерименталната генетична модификация на МСК, заслужава да се отбележи трансфекцията на гена на фактор IX в човешки МСК с последващо прехвърляне на трансфектиращи клетки към имунодефицитни мишки, което води до появата на антихемофилен фактор B в кръвта в продължение на 8 седмици след трансплантацията. В този експеримент е извършена посттранслационна модификация на фактор IX чрез γ-глутамил карбоксилаза в трансфектираните клетки. Трансдукцията на МСК с ретровирусен вектор, кодиращ човешки фактор IX, е по-малко успешна - последващото приложение на тези клетки на куче с хемофилия B осигурява терапевтично ниво на фактор IX, поддържащо нормална интензивност на коагулационната хемостаза, само за 12 дни.

Трансплантацията на мезенхимни стволови клетки в мозъчния паренхим на животни показва, че незрелите клетки на донорите се трансформират както в невронни, така и в глиални популации. Присаждането на невронни производни на здрава донорска мезенхимна тъкан теоретично прави възможно коригирането на генетични аномалии на мозъчния метаболизъм при пациенти с болест на Гоше и други нарушения на липидния, ганглиозидния или въглехидратния метаболизъм.

Експерименталното търсене на условия за трансдиференциация на стромални стволови клетки от костен мозък в прогениторни клетки от нервна и чернодробна тъкан продължава. Вниманието на изследователите е фокусирано върху комбинации от индуктори на диференциация и специални кондиционирани среди. По-специално, за да се изолира първичната култура от стромални клетки, клетки от костен мозък, измити и ресуспендирани в DMEM/F12 (1/1) хранителна среда с 10% фетален телешки серум, се посяват при плътност 200 000/cm2. След 24 часа неприлепналите клетки се отстраняват и фибробластоподобни клетки, прикрепени към пластмасата, се култивират в продължение на една седмица. За диференциация на стромални клетки от костен мозък в невробласти се използва кондиционирана среда, получена чрез тридневно култивиране на първичната култура от миши ембрионални фибробласти, както и среда DMEM/F12 (1/1) с 2% фетален телешки серум и добавяне на 20 ng/ml NF или 10-6 M ретиноева киселина (невроиндуктори, които се използват за неврална диференциация на миши и човешки ембрионални стволови клетки). Диференциацията на стромални клетки от костен мозък в хепатоцитни прекурсорни клетки се индуцира в кондиционирана среда, създадена в резултат на тридневно култивиране на първичната култура от миши ембрионални чернодробни клетки в среда DMEM/F12 (1/1) с добавяне на 10% фетален телешки серум.

Тук трябва да се отбележи още веднъж, че колониообразуващите клетки на стромата на костния мозък са хетероморфни и могат да бъдат разделени на два типа. Първият тип включва фибробластоподобни клетки, които образуват филоподии с големи ядра и едно или две ядърца. Вторият тип е представен от малки вретеновидни клетки. При култивиране на клетки от двата типа в кондиционирана среда, получена върху захранващ слой от първични миши ембрионални фибробласти, клетки, подобни на невробластите, се появяват в културата на 3-тия до 4-тия ден. На този етап те най-често имат вретеновидна форма с един или два дълги израстъка, завършващи с филоподии. По-рядко се срещат пирамидални или звездовидни клетки с къси дендрити. Дендритите на някои невробласти имат характерни разширения (растежни пъпки) и разклонения в дисталната си част, докато други имат отчетливи растежни конуси с филоподии, през които дендритите растат. Подобни морфологични характеристики (пъпки и растежни конуси с филоподии), присъщи на невробластите, диференциращи се в неврони, са описани подробно в изследвания върху неврогенезата. Въз основа на това някои автори заключават, че клетките, които са открили в културата, са невробласти. По-специално, Е. Шчегелская и съавтори (2002) след култивиране на първична култура от стромални клетки в продължение на две седмици в кондиционирана среда, сменяна на всеки 3-ти до 4-ти ден, установяват, че някои от клетките пролиферират, като същевременно запазват недиференцирано състояние. Външно такива клетки наподобяват фибробласти и са открити в културата заедно с диференциращи се невробласти. По-голямата част от клетките (около 80%) са в различни етапи на диференциация в клетки на нервната тъкан, предимно в неврони. Дендритните израстъци на тези клетки са в тесен контакт помежду си, така че клетките постепенно образуват участъци от нервната мрежа върху субстрата под формата на дълги многоклетъчни нишки. Дендритните израстъци на невробластите стават значително по-дълги, някои от тях надвишават дължината на самото тяло на неврона 8-10 пъти. Делът на пирамидалните и звездовидните клетки постепенно се увеличава. Дендритите на звездовидните клетки се разклоняват. Според авторите, по-късната диференциация на пирамидалните и звездообразните клетки в сравнение с вретеновидните клетки съответства на последователността от етапи на нормалната неврогенеза при животните. В резултат на това авторите заключават, че стромалните стволови клетки от костен мозък претърпяват индуцирана неврогенеза, по време на която и трите основни типа неврони се образуват от невробласти in vitro. Прекурсори на нервните клетки са открити и по време на култивиране на стромални клетки от костен мозък в продължение на 3-4 дни в среда с 2% фетален серум и 20 ng/ml LIF. Но в този случай стволовите клетки се делят много бавно, диференциацията на невробластите се наблюдава само в 30% от случаите и те не образуват невронни мрежи. Използвайки ретиноева киселина като един от индукторите на диференциацията на нервните клетки, авторите са получили до 25-30% от нервните клетки в културата,с преобладаващо глиални елементи - астроцити и олигодендроцити. Невроните съставляват само една трета от всички нервни клетки, въпреки че са представени и от трите вида: вретеновидни, пирамидални и звездовидни клетки. На 6-ия ден от култивирането на стромални клетки в среда с ретиноева киселина, нервните клетки стават по-диференцирани и в отделни пирамидални неврони са открити аксони, които при нормална невроонтогенеза се появяват по-късно от образуването на дендритни израстъци. Според авторите, въпреки ниския добив на нервни клетки, методът на индуциране с ретиноева киселина има своите предимства: олигодендроцитите и астроцитите изпълняват миелинизиращи и хранителни функции по време на растежа на дендрити и аксони и са необходими за нормалното образуване на нервната тъкан. Следователно, за възстановяване на увредените ѝ области in vivo е по-добре да се използва суспензия от неврони, обогатена с глиални клетки.

Във втората серия от експерименти авторите се опитват да индуцират диференциация на стромални клетки от костен мозък в чернодробни клетки. След три дни култивиране на стромални стволови клетки от костен мозък в кондиционирана среда, получена чрез инкубиране на миши ембрионални хепатоцити, са открити големи, сферични клетки, често двуядрени, с цитоплазмени включвания с различни размери. Тези клетки са в различни етапи на диференциация и се различават по размер, брой ядра и включвания в цитоплазмата. В повечето от тези клетки е открит гликоген, въз основа на което авторите ги идентифицират като прекурсорни клетки на хепатоцити. Тъй като в културата не са открити клетки, подобни на невробластите, е направено заключението, че кондиционираната среда, получена в резултат на култивиране на ембрионални хепатоцити, не съдържа фактори на диференциация на нервните клетки и, обратно, съдържа фактори, индуциращи диференциация на стромални клетки от костен мозък в прекурсорни клетки на хепатоцити. В заключение авторите предполагат наличието на плурипотентност в стромалните клетки от костен мозък, тъй като те се диференцират in vitro в нервни или чернодробни тъканни клетки в зависимост от използваната специфична кондиционирана среда и индуктори.

Някои изследвания наистина са показали правилно диференциацията на стромалните клетки на костния мозък в кардиомиоцити, хрущялни, костни и нервни тъканни клетки. Има доказателства, че сред клетките на костния мозък има популации от стволови клетки, способни да се диференцират в хепатоцити. В светлината на тези данни, резултатите от горните експерименти върху мишки все още могат да се считат за допълнително потвърждение за наличието в костния мозък на плурипотентни мезенхимни стволови клетки, способни да се диференцират в клетки на различни тъкани на възрастен организъм.

Трансплантация на мезенхимни стволови клетки

В клиничната трансплантология, човешките мезенхимни стволови клетки могат да се използват за осигуряване на разширяването на хематопоетичните стволови клетки, както и на техните ранно предварително ангажирани потомци. По-специално, въвеждането на автоложни хематопоетични стволови клетки и МСК при онкоболни след високодозова химиотерапия ускорява възстановяването на броя на неутрофилите и тромбоцитите в периферната кръв. Ало- и автоложните трансплантации на мезенхимни стволови клетки се използват за лечение на множествен миелом, апластична анемия и спонтанна тромбоцитопения - заболявания, свързани с първичен дефект в стромата на хематопоетичната тъкан. Ефективността на клетъчната терапия при онкохематологична патология в много случаи е по-висока при едновременно въвеждане на стромални и хематопоетични стволови клетки, което се проявява с намаляване на следоперативния период на възстановяване на хематопоезата, намаляване на броя на фаталните случаи поради неселективно унищожаване на регионалните и циркулиращите ракови клетки, при които умират и собствените прогениторни хематопоетични клетки на пациента. Перспективите за използване на МСК и други мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки в клиничната практика се дължат на относителната лекота на получаването им от аспирати на костен мозък, разширяването в култура и трансфекцията на терапевтични гени. В същото време, локалната имплантация на мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки може да се използва за компенсиране на локални тъканни дефекти, а в случай на системни дисфункции на тъкани с мезенхимен произход, не е изключено въвеждането им в общия кръвен поток.

Авторите на трудове, в които се анализират перспективите за използване на МСК за локална, системна трансплантация и генна терапия от гледна точка на биологията на стромалните клетки, са по-предпазливи в разсъжденията си. Постнаталният костен мозък традиционно се разглежда като орган, състоящ се от две основни системи от ясно дефинирани клетъчни линии - самата хематопоетична тъкан и свързаната с нея поддържаща строма. Следователно, мезенхимните стволови клетки от костен мозък първоначално са били разглеждани изключително като източник на стромална основа за производството на регулаторни фактори на хематопоетичната микросреда. След това вниманието на изследователите се насочи към изучаване на ролята на МСК като стволов източник на скелетни тъкани. Последните данни показват неочакван потенциал за диференциация на стромални клетки от костен мозък с образуването на неврална или мускулна тъкан. С други думи, мезенхимните стволови клетки проявяват трансгерминална пластичност - способността да се диференцират в клетъчни типове, фенотипно несвързани с клетките на оригиналната тъкан. В същото време, някои аспекти на биологията на стромалните клетки от костен мозък остават неясни и неразрешени както в общобиологичен план, така и в отделни детайли, включително идентифицирането, природата, произхода, развитието и функцията in vivo на стромалните клетки от костен мозък, както и допустимия потенциал за диференциация ex vivo и възможностите за терапевтично приложение in vivo. Получените данни за потенциала на мезенхимните стволови клетки (МСК), както и резултатите от изследванията на регенеративния потенциал на други стволови клетки, са в рязко противоречие с догмите, установени в биологията.

Когато се култивират при ниска плътност, стромалните стволови клетки от костен мозък образуват отделни колонии, всяка от които произлиза от една единствена прогениторна клетка. Процентът на стромалните прогениторни клетки в ядрените клетки от костен мозък, определен от способността им да образуват колонии, силно зависи както от условията на култивиране, така и от вида MSC. Например, при гризачи наличието на облъчени костномозъчни хранителни клетки и серум в културата е абсолютно необходимо за получаване на максималния брой стромални прогениторни клетки, докато при хората ефективността на мезенхимните стволови клетки при образуване на колонии е независима както от хранителната, така и от културалната среда. Броят на известните митогенни фактори, които стимулират пролиферацията на стромални прогениторни клетки, е ограничен. Те включват PDGF, EGF, FGF, TGF-b и IGF1. При оптимални условия на култивиране, поликлоналните MSC линии могат да издържат на повече от 50 клетъчни деления in vitro, което прави възможно получаването на милиарди костномозъчни стромални клетки от 1 ml от техния аспират.

Популацията на стромални клетки от костен мозък обаче е хетерогенна, което се проявява както с вариабилност в размера на колониите, различна скорост на тяхното образуване, така и с разнообразие от клетъчна морфология, която обхваща диапазона от фибробластоподобни вретеновидни до големи плоски клетки. По време на развитието на такива култури се наблюдава и фенотипна хетерогенност след 20 дни. Някои колонии се характеризират с висока експресия на алкална фосфатаза, други изобщо не я експресират, а колониите от третия тип са фосфатазо-позитивни в централната област и фосфатазо-отрицателни в периферията. Отделните колонии образуват нодули от костна тъкан (началото на минерализация на матрикса се маркира чрез оцветяване с ализариново червено или за калций според Ван Кос). В други колонии се наблюдава натрупване на мазнини, идентифицирано чрез G-оцветяване с маслено червено. По-рядко колониите от мезенхимни стволови клетки образуват хрущяли, оцветени с алцианово синьо).

След ектопична трансплантация в опитни животни, поликлоналните MGK линии образуват ектопична кост с ретикуларна строма, свързана с миелопоеза и адипоцити, и по-рядко с хрущялна тъкан. При трансплантация на моноклонални линии от костномозъчни стромални клетки в някои случаи се наблюдава химеризъм, при който de novo костта се състои от клетки от костна тъкан, съдържа строма и адипоцити от донорски произход, докато клетките от хематопоетичния произход и съдовата система са получени от реципиента.

Резултатите от тези проучвания потвърждават стволовия характер на костномозъчните стромални прогениторни клетки, от които е получена клоналната линия. Те също така показват, че не всички клетки, клоногенни в култура, са наистина мултипотентни стволови клетки. Някои изследователи смятат, а ние споделяме тяхното мнение, че най-надеждната информация за реалния потенциал за диференциация на отделните клонове може да се получи само in vivo след трансплантация, а не чрез определяне на фенотипа на техните производни in vitro. Експресията в културата на фенотипни маркери на остео-, хондро- или адипогенеза (определени чрез mRNA или чрез хистохимични техники) и дори производството на минерализирана матрица не отразяват степента на плурипотентност на отделен клон in vivo. Следователно, идентифицирането на стволови клетки в група от стромални клетки е възможно само a posteriori, при подходящи условия на биологичен трансплантационен анализ. По-специално, хондрогенезата се наблюдава много рядко в отворени трансплантационни системи, докато образуването на хрущял далеч не е необичайно в затворени системи като дифузионни камери или in vitro микромасови култури на стромални клетки, където се постига локално ниско кислородно налягане, което насърчава образуването на хрущялна тъкан. Следователно, дори техниката на трансплантация, както и неспецифичните условия на in vitro култивиране, влияят значително върху обхвата на диференциация на MSC.

Експерименталната трансплантация при определени експериментални условия е златният стандарт за определяне на потенциала за диференциация на стромалните клетки от костен мозък и ключов елемент в тяхната идентификация. В исторически план изследванията върху трансплантацията на стромални клетки от костен мозък са свързани с общия проблем на трансплантацията на костен мозък. Установено е, че хематопоетичната микросреда се създава чрез трансплантация на стромални клетъчни линии от костен мозък и осигурява ектопично развитие на хематопоетична тъкан в зоната на трансплантация. Произходът на микросредата от донора и хематопоетичната тъкан от гостоприемника ни позволява да разглеждаме ектопичната кост като истинска „обърната“ трансплантация на костен мозък. Локалната трансплантация на стромални клетки от костен мозък насърчава ефективна корекция на костните дефекти, по-изразени, отколкото при спонтанна репаративна регенерация. Няколко предклинични проучвания върху експериментални модели убедително демонстрираха възможността за използване на трансплантации на стромални клетки от костен мозък в ортопедията, въпреки че са необходими най-внимателни усилия и анализи за оптимизиране на тези методи, дори в най-простите случаи. В частност, оптималните условия за разширяване на остеогенни стромални клетки ex vivo все още не са установени, структурата и съставът на идеалния носител, както и броят на клетките, необходими за обемна костна регенерация, остават неразвити.

В допълнение към използването на ex vivo разширени костномозъчни стромални клетки за регенерация на тъкани с мезенхимен произход, неортодоксалната пластичност на мезенхималните стволови клетки (МСК) открива потенциални приложения за регенерация на невронни клетки или доставяне на генни продукти до ЦНС. По принцип това опростява клетъчната терапия за увреждане на нервната система, тъй като няма нужда от получаване на автоложни човешки невронни стволови клетки. Съобщава се за потенциални приложения на костномозъчни клетки за генериране на кардиомиоцити и миогенни прогениторни клетки както от истински стромален, така и от екстрастромален произход.

Провеждат се експерименти върху системна трансплантация на стромални клетки от костен мозък за лечение на често срещани скелетни заболявания. Няма съмнение, че стромалните клетки от костен мозък са популацията, отговорна за генетичните нарушения при скелетните заболявания, което е добре илюстрирано от векторния трансфер на генетична информация с помощта на тези клетки, което води до образуването на патологична костна тъкан при опитни животни. Способността на стромалните клетки да се имплантират, присаждат, пролиферират и диференцират в скелетните кости след въвеждане в общия кръвен поток обаче все още не е доказана.

Това е отчасти така, защото при стандартната трансплантация на костен мозък стромата не се трансплантира заедно с хематопоетичната тъкан, така че все още не са разработени строги критерии за оценка на успешното присаждане на системно приложени стромални клетки. Трябва да се помни, че наличието на маркерни гени в тъканни екстракти или изолирането на клетки от донорен произход в култура не показва присаждане на клетките, а само тяхното оцеляване. Дори интраартериалното инжектиране на стромални клетки от костен мозък в крайник на мишка може да доведе до практически нулево присаждане, въпреки факта, че клетки от донорен произход се намират в голям брой в микросъдовата система на костния мозък. За съжаление, такива клетки обикновено се описват като „присадени“ просто въз основа на откриването на маркерни гени за донорски клетки в ex vivo култура. Освен това трябва да се предоставят убедителни доказателства за дългосрочна интеграция на диференцирани и функционално активни клетки от донорен произход в изследваните тъкани. В много публикувани статии, докладващи за присаждането на стромални клетки от костен мозък в скелета, липсата на ясни данни от този вид е поразителна. Трябва да се отбележи обаче, че някои коректни експерименти с животни наистина са установили ограничено, но реално присаждане на стромални прогениторни клетки след системното им приложение.

Тези данни са в съответствие с резултатите от проучвания върху възможността за доставяне на миогенни прогениторни клетки от костен мозък до мускулите чрез съдовата система. Не бива обаче да се забравя, че както скелетната, така и мускулната тъкан се формират по време на развитието и растежа въз основа на екстраваскуларни клетъчни движения, които използват миграционни процеси, които не включват кръвообращение. Ако съществува независим кръвоносен път за доставяне на прогениторни клетки до тъкани в твърда фаза, възможно ли е да се предположи съществуването на физиологично циркулиращи мезенхимни прогениторни клетки? Какъв е произходът на тези клетки както в развиващия се, така и в постнаталния организъм и как проникват през съдовата стена? Решението на тези въпроси изглежда абсолютно необходимо и изисква най-внимателен предклиничен анализ. Дори след като бъдат намерени отговори на тези въпроси, проблемните кинетични аспекти, свързани с растежа на скелета и ремоделирането на съединителната тъкан, ще останат нерешени. В същото време лечението на нарушенията на остеогенезата чрез заместване на цялата популация от мутирали скелетни прогениторни клетки със здрави стромални елементи изглежда реална клинична перспектива. В този случай, локални фрактурни зони или деформации, дължащи се на патологична остеогенеза, както и деструктивни промени в костната тъкан, могат да бъдат коригирани с помощта на стромални стволови клетки, култивирани in vitro. Поради това е препоръчително бъдещите изследвания да се съсредоточат върху проблемите на трансформацията или генетичната корекция на автоложни мутирали остеогенни прогениторни клетки ex vivo.

Генното инженерство на клетките, краткосрочно или постоянно, се е превърнало в основата на клетъчната и молекулярната биология, източник на много научни открития, отнасящи се до ролята на отделните протеини в клетъчния метаболизъм in vitro и in vivo. Използването на молекулярни технологии за коригиране на наследствена патология и човешки заболявания е многообещаващо за практическата медицина, тъй като свойствата на стромалните стволови клетки от костен мозък позволяват разработването на уникални трансплантационни схеми за коригиране на генетични заболявания на скелета. В същото време мезенхимните прекурсорни клетки могат лесно да бъдат получени от бъдещия реципиент, те са податливи на генетична манипулация и са способни да се размножават в големи количества за кратък период от време. Използването на мезенхимни стволови клетки позволява да се избегнат ограниченията и рисковете, свързани с доставянето на генетичен информационен материал директно на пациента чрез интраваскуларни векторни конструкции. Подобна стратегия е приложима и за ембрионалните стволови клетки, но автоложните постнатални стромални клетки от костен мозък са по-предпочитан материал, тъй като въвеждането им изключва възможни имунологични усложнения след трансплантация. За постигане на краткосрочен ефект, например за ускоряване на костната регенерация, най-оптималният метод е генетичната модификация на мезенхимни стволови клетки, използваща електропорация, химическо сливане, липофекция, плазмиди и аденовирусни конструкции. По-специално, вирусната трансфекция в стромални клетки на костен мозък BMP-2 е доказано ефективна за ускоряване на костната регенерация при експериментална политравма. Създаването на аденовирусни векторни конструкции е за предпочитане поради липсата на токсичност. Генетичната модификация на стромални клетки на костен мозък в този случай обаче се характеризира с изключително ниска стабилност. Освен това, нормално трансформираните стромални клетки на костен мозък изискват използването на векторни носители на генетична информация, които са 10 пъти по-инфекциозни от други клетъчни типове, което значително увеличава процента на смърт на трансфектираните клетки.

Лечението на рецесивни заболявания, причинени от ниска или нулева биологична активност на определени гени, изисква дългосрочна или трайна модификация на мезенхимни стволови клетки, което изисква използването на аденоасоциирани вируси, ретровируси, лентивируси или адено-ретровирусни химери. Транспортните региони на тези вируси са способни да пренасят големи ДНК трансфекти (до 8 kb). В научната литература вече е съобщено за екзогенната биологична активност на стромални клетки от костен мозък, трансфектирани с ретровирусни конструкции, кодиращи синтеза на регулаторни и маркерни молекули - IL-3, CD2, фактор VIII, както и ензими, участващи в синтеза на L-DOPA. Въпреки това, дори в тези изследвания, авторите посочват редица ограничения, които трябва да бъдат преодолени преди практическото приложение на тази технология. Първият проблем е оптимизирането на процеса на модификация на MSC ex vivo. Известно е, че дългосрочната (3-4 седмици) пролиферация на стромални клетки от костен мозък in vitro намалява тяхната трансфекция. В същото време, за да се постигне високо ниво на генетична модификация на MSC, е необходимо да се проведат няколко цикъла на трансфекция. Вторият проблем е свързан с продължителността на терапевтичната генна експресия, която все още не надвишава четири месеца. Естественото намаляване на ефективната генна експресия се дължи на инактивиране на промотора и смърт на модифицираните клетки. С общите перспективи за трансфер на генетична информация с помощта на мезенхимни стволови клетки, резултатите от предварителните проучвания показват необходимостта от по-нататъшна оптимизация на методите за ex vivo трансфекция, избор на адекватен промотор, регулиращ биологичната активност в желаната посока, и повишаване на способността на модифицираните стромални клетки от костен мозък за самоподдържане in vivo след трансплантация. Трябва да се отбележи, че използването на ретровирусни конструкции за модифициране на стромални клетки от костен мозък в желаната посока не винаги изисква задължителното им присаждане. Трансфектираните мезенхимни стволови клетки могат да изпълняват коригираща функция на фона на стабилно пребиваване и без задължително активно физическо включване и функциониране в съединителната тъкан. В този случай те трябва да се разглеждат като биологична мини-помпа, произвеждаща in vivo фактор, чийто дефицит определя проявата на генетична патология.

Използването на трансформирани стромални клетки от костен мозък за лечение на доминантна генетична патология, която се характеризира с експресията на ген с патологична или анормална биологична активност, е много по-проблематично, тъй като в този случай е необходимо да се блокира пренасянето или внедряването на изкривена генетична информация. Един от методите на генното инженерство е хомоложната рекомбинация на ембрионални стволови клетки с цел създаване на трансгенни животни. Изключително ниската степен на хомоложна рекомбинация в комбинация с проблемите на идентифицирането, разделянето и разширяването на такива рекомбинанти обаче е малко вероятно да допринесе за широкото използване на този метод в близко бъдеще, дори ако бъдат разработени нови технологични методи. Вторият подход в генната терапия на доминантната патология се основава на автоматичната корекция на увредената ДНК, тъй като генетичните мутации могат да бъдат коригирани чрез въвеждане на екзогенна ДНК с желаната последователност (къси ДНК олигонуклеотиди или химерни РНК/ДНК олигонуклеотиди), която се свързва с хомолози в увредения геном. Третият вариант включва блокиране на предаването на патологична информация, което се постига чрез използването на специално проектирани олигонуклеотиди, които се свързват със специфичен ген, за да образуват тройна спирална структура, която елиминира възможността за транскрипция.

Въпреки че корекцията на генетично заболяване на геномно ниво остава най-оптималният и предпочитан терапевтичен метод, mRNA е и обещаващ вектор (вероятно дори по-достъпен) за блокиране на доминантен негативен ген. Протеинови молекули с антисенс олигонуклеотид или пълни последователности, които блокират свързването на mRNA с клетъчния биосинтетичен апарат, отдавна се използват за инхибиране на транслацията и/или увеличаване на разграждането на mRNA. Освен това, двуверижната РНК индуцира бързо разграждане на mRNA, чийто механизъм остава неясен. Малко вероятно е обаче самото елиминиране на mRNA, транскрибирани от мутантен алел с кратки или единични мутации, да насърчи експресията на mRNA на нормалния алел. Алтернатива е използването на рибосинтези тип „чукчеста глава“ и „фиби“, които имат способността да се свързват с високоспецифични региони на mRNA с последваща индукция на тяхното разцепване и инактивиране по време на транслацията. Възможността за използване на този метод в терапията на патологична остеогенеза в момента се проучва. Независимо от това каква точно е целта - геномни или цитоплазмени елементи, успехът на новите технологии за генна терапия ще се определя от ефективността на включването на реагенти в стромални клетки от костен мозък ex vivo, оптималния избор на специфичен вектор и стабилната способност на мезенхимните стволови клетки да експресират необходимите фактори in vivo.

По този начин, откриването на мезенхимни стволови клетки с техните неочаквани свойства създава нова концептуална схема за развитието на клетъчни линии. Необходими са обаче по-нататъшни интердисциплинарни изследвания, за да се разбере биологичната роля на стромалните стволови клетки, тяхната природа, способността им да трансдиференцират или дедиференцират, тяхното физиологично значение по време на ембрионалното развитие, постнаталния растеж, съзряването и стареенето, както и при човешки заболявания.