Мезенхимни стволови клетки

Сред регионалните стволови клетки мезенхимните стволови клетки (MSCs) заемат специално място, чиито производни представляват стромалната матрица на всички органи и тъкани на човешкото тяло. Приоритет в изследването на MSC принадлежи на представителите на руската биологична наука.

В средата на миналия век в лабораторията на A. Friedenshtein се изолира хомогенна култура на многопотенциални стромални стволови клетки от костен мозък. Мезенхимни стволови клетки, прикрепени към субстрат за дълго време запазват висока скорост на пролиферация, и култури при ниска плътност засяване след фиксиране върху субстрат образува на фибробластен клетъчни клонове, които нямат фагоцитната активност. Спирането на пролиферацията на MSC е прекратено чрез тяхното спонтанно in vitro диференциация в костни, мастни, хрущялни, мускулни или съединителни тъкани. Допълнителни изследвания показват, остеогенен потенциал на фибробластоподобни костен мозък стромални клетки от различни видове бозайници, както и активността на колония-формиращи. В експерименти ин виво е показано, че и двете хетеро- и ортотопичен трансплантация на фибробластен колония образуващи клетка е завършена формиране на костите, хрущялите и влакнест мастна тъкан. Тъй като стромален стволови клетки на костния мозък се характеризира с висок капацитет за самообновяване и диференциация на контраст в същата клетъчна линия, те се наричат мултипотентни мезенхимни клетки предшественици.

Следва да се отбележи, че за 45 години фундаментални изследвания на мезенхимни стволови клетки са създадени реални условия за употребата на техните производни в клиничната практика.

Днес няма съмнение, че всички тъкани на човешкото тяло се формират от стволовите клетки на различни клетъчни линии в резултат на процесите на пролиферация, миграция, диференциация и зреене. Напоследък обаче се вярва, че стволовите клетки в тялото на възрастните са специфични за тъканите, т.е. Способни да произвеждат само специализирани клетъчни линии на тъканите, в които са разположени. Тази концептуална ситуация беше отхвърлена от фактите за трансформация на хематопоетични стволови клетки не само в клетъчните елементи на периферната кръв, но и в овалните чернодробни клетки. В допълнение, и нервните стволови клетки са способни да породят както неврони, така и глиални елементи, както и ранно ангажирани линии на хематопоетични прогениторни клетки. От своя страна, мезенхимни стволови клетки, които обикновено произвеждат клетъчни елементи от костите, хрущялите и мастната тъкан, могат да се превърнат в нервни стволови клетки. Предполага се, че в процеса на растеж, физиологична и репаративна регенерация на тъканите, нежелани прогениторни клетки се генерират от тъканно-специфични стебловидни резерви. Например, възстановяване на мускулната тъкан може да се осъществи чрез мезенхимни стволови клетки, които мигрират от костния мозък към скелетните мускули.

Въпреки че такива напречно взаимозаменяемост стволови клетки разпознават не всички изследователи възможност за клинично използване на мезенхимни стволови клетки като източник за клетъчна трансплантация и клетка вектор на генетична информация не оспорва като мултипотентни строма на костен мозък стволови клетки, които могат да бъдат относително лесно да се изолира и се разпространяват в култура in vitro. В същото време в научната литература продължава да се появяват съобщения за потенциала на плурипотентни стволови клетки от стромата на костния мозък. Като доказателство представени изследователски протоколи, които под въздействието на специфични индуктори на трансдиференциация на MSCs се превръщат в нервните клетки, кардиомиоцити и хепатоцити. Въпреки това, някои учени възможност за повторно активиране и генната експресия по време на ранната ембриогенеза в сериозно съмнение. В същото време, всеки разбира, че ако се намерят условия за разширяване на мултипотентни мезенхимни стволови клетки, за да плурипотент на ИСС в регенеративната медицина и пластична автоматично решен много проблеми на етични, морални, религиозни и правно естество. Освен това, тъй като в този случай източникът на стволови регенеративна способност на пациента са автоложни стромални клетки се решава и проблемът на имунното отхвърляне на клетъчния трансплант. Как реалистични са перспективите близко бъдеще ще покаже.

[1], [2]

Използване на мезенхимни стволови клетки в медицината

Използването клиниката на производни на мезенхимни стволови клетки е свързано главно с намаляването на дефекти тъкан, причинени от обширни и дълбоки термични увреждания на кожата. Се провежда Предклинични експериментална оценка на уместността на алогенни фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки за лечение на дълбоки изгаряния. Показано е, че фибробластоподобни костен мозък мезенхимни стволови клетки образуват монослой в културата, което прави възможно да ги трансплантация за оптимизиране регенерирането на дълбоки рани от изгаряне. Авторите отбелязват, че подобни имоти са ембрионални фибробласти, но клиничното приложение на последните е ограничен до съществуващите етични и правни проблеми. Дълбоко термично изгаряне с увреждане на всички слоеве на кожата беше моделирано върху плъхове Wistar. Площта на изгарянето е 18-20% от общата повърхност на кожата. В първия експерименталната група се състои от плъхове с дълбоко термично увреждане и трансплантация на алогенни фибробласти получени от мезенхимни стволови клетки. Втората група се състои от животни с дълбоко термично изгаряне и трансплантация на алогенни ембрионални фибробласти. Третата група беше представена от контролни плъхове с дълбоко термично изгаряне, които не извършиха клетъчна терапия. Суспензия от фибробласти получени от мезенхимни стволови клетки и ембрионални фибробласти се прилага за изгаряне навита повърхност пипетира в количество от 2 х 10 ⁴ клетки на втори ден след изрязване на горене моделиране и некротична струпей оформен. След трансплантацията, клетки горят повърхност, покрита с марля, напоена с физиологичен разтвор на натриев хлорид с гентамицин. Ограда клетки на костен мозък за получаване MSCs с последващо индуциране на фибробластна линия в мезенхимни стволови клетки, получени при възрастни плъхове Wistar от бедрените кости. Ембрионални фибробласти се получават от белите дробове на ембриони на възраст 14-17 дни. Ембрионалните фибробласти и клетки от костен мозък за да се получи предварително MSCs се култивират в блюда на Петри при 37 ° С в С02 iikubatore, в атмосфера с 5% СО2 при 95% влажност. Ембрионалните фибробласти се култивират в продължение на 4-6 дни, докато за формиране на монослой MSC изисква от 14 до 17 дни. Впоследствие MSCs поддържани от криоконсервация като изходен материал за фибробласти получени от мезенхимни стволови клетки, които се получават чрез размразяване и култивиране MSCs в продължение на 4 дни. Брой на фибробластни генерирани мезенхимни стволови клетки, е повече от 3 пъти броя на ембрионални фибробласти, възникващи по време на същия период на култивиране. За идентифициране на клетки в transtslantirovannyh горят рани в етап култивиране техния геном маркира като се използва вирусен вектор-совалка основава на рекомбинантен аденовирус тип V носители 1 aS-2 гена, кодиращ бета-галактозидаза Е.коли. Живите клетки при различни времена след трансплантацията открити имунохистохимично в криоучастъците с добавен субстрат X-Gal, давайки характеристика синьо-зелен цвят. В резултат на визуално динамична, планиметричен и хистологично състояние оценка на рани от изгаряне, беше установено, че дори и при 3-тия ден след трансплантацията на клетките в изолирани групи се появяват значителни разлики през рана процес лечебни. Особено различно, тази разлика стана на 7-ия ден след клетъчната трансплантация. Животните от първата група, които са трансплантирани фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки, рана придобити равномерно розова интензивен цвят, гранулационна тъкан нараства по цялата си площ на нивото на епидермиса, и изгаря повърхността е значително намален размер. Колагенният филм, образуван на повърхността на раната, е малко изтъняващ, но продължава да покрива цялата област на изгаряне. Животните от втората група, които са трансплантирани ембрионални фибробласти, гранулационна тъкан се повдига на нивото на епидермиса на ръбовете на раната, но само в някои места, като в същото време plazmoreya от раната е по-интензивен, отколкото в група 1, и първоначално формира колаген филм практически изчезна. При животни, които не са получавали терапия със стволови клетки, на 7 дни изгаряне рана беше бледо, костилка, некротична тъкан, покрита с фибрин. На повърхността на изгаряне се забелязва плазморея. Хистологично, животните от групи 1 и 2 показват намаляване на клетъчна инфилтрация и развитие на васкулатурата, тези признаци на начален процес регенератор са по-тежки от плъховете от група 1. В контролната група показа признаци на клетъчна инфилтрация навива, за хистологично модел на новообразуваните кръвоносни съдове отсъства. 15-30-ия ден на наблюдение на животните от повърхността на първата група горене е значително по-малки в сравнение с плъховете на други групи и гранулираща повърхност е по-развита. При животните от изгаряне повърхност на втори група също се намалява в сравнение с размера на рани от изгаряне в контролната група плъхове, че се дължи на пределната епителизация. В контролната група сайтове повърхностни изгаряния остават бледо гранулати с редки, показва него разширени вени, островчета са фибринозен плака продължи умерено plazmoreya в горя повърхност, нещо, което е трудно подвижни краста остава. По принцип животните от третата група също намалиха размера на раната, но краищата на раната останаха подбити.

По този начин, по време на сравнително изследване на заздравяване на рани проценти използват фибробласти получени от мезенхимни стволови клетки и фетални фибробласти, и без използване на клетъчна терапия маркиран ускоряване на зарастването на горене повърхност в резултат на трансплантация на фибробласти получени от мезенхимни стволови клетки и ембрионални фибробласти. Въпреки това, в случай на използване на алогенни мезенхимни стволови клетки от фибробласти рана скорост лечебни е по-висока, отколкото в трансплантацията на ембрионални фибробласти. Това се изразява в ускоряване промяна на регенериране фази на процеса - за намаляване на клетъчни периоди инфилтрация, увеличава скоростта на пролиферация на васкуларни мрежи, както и образуването на гранулационна тъкан.

Резултатите от динамичната планиметрия показват, че честотата на спонтанното излекуване на изгорелите рани (без използването на клетъчна терапия) е най-ниската. На 15-ти и 30-ия ден след трансплантация на алогенни мезенхимни стволови клетки на фибробластите рана скорост изцеление е по-висока, отколкото в трансплантация на ембрионални фибробласти. Хистохимични метод за откриване на бета-галактозидаза показва, че след трансплантация на фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки и ембрионални фибробласти през целия период на наблюдение на повърхността и дълбоки рани регенериране трансплантирани клетки остават жизнеспособни. Авторите предполагат, че по-висок процент на рани регенерация горене, използвайки мезенхимни стволови клетки от фибробласти климатизирани освобождаване от тези клетки по време на съзряването rostostimuliruyushih биоактивни фактори.

Автоложна трансплантация на алогенни или кератиноцити и фибробласти алогенни за лечение на рани от изгаряне и се използва в клиниката. Трябва да се отбележи, че хирургично лечение на деца с обширни дълбоки изгаряния е сложна задача поради високата множественост на травми и хирургични интервенции, значителна загуба на кръв, на различните реакции, използвани инфузия среда. Основните трудности в изпълнението на кожата и пластична хирургия с обширни дълбоки изгаряния, районът над 40% от повърхността на тялото, поради тежестта на състоянието си и липсата на ресурси на донор на кожата. Използването на окото присадки с голям коефициент на перфорация не решава проблема, тъй като изображението след epiteliziruyutsya клетка перфорация е много бавно и често го правят присаждане на кожа се лизират или суха. Такива покрития горят рани като ksenokozha, трупни алографти, синтетични филмови покрития не винаги са достатъчно ефективни, за развитие на нови методи за затваряне на горене повърхностни слоеве от култивирани кератиноцити и фибробласти. По-специално, до метод за затваряне на горене повърхности използват култивирани allofibroblastov осигуряване по време на трансплантация изразен стимулиращ ефект върху epidermotsitov на пролиферация запазена в границата на раната при изгаряния, и в кератиноцитите присадки окото платна. В Budkevich L. И сътр (2000) показва резултатите от прилагането на този метод за лечение на изгаряния при деца. 31 деца с термична травма на възраст между 1 и 14 години са били наблюдавани. В три деца обща площ изгори рани IIIA-B - IV степен е 40%, 25 - 50-70%, дори по три - 71-85% от повърхността на тялото. Ранни хирургически некректомия комбинира с трансплантация на култивирани allofibroblastov и autodermaplasty. В първото третиране етап се провежда некротична тъкан ексцизия, а вторият - на трансплантацията на култивирани allofibroblastov носител филм, третият (48 часа след трансплантацията на култивирани allofibroblastov) - отстраняване на матрицата и кожни крила с autodermoplasty съотношение перфорация на 1: 4. Трима пациенти, приети в болница с тежки изгаряния заболяване, култивирани allofibroblasty бяха трансплантирани на гранулиране рани. Трансплантация на култивирани allofibroblastov извършва веднъж в 18 деца, два пъти - на 11, три - двама пациенти. Площта на повърхността на раната, покрита от клетъчната култура, е от 30 до 3500 ст2. Ефикасността на култивирани allofibroblastov оценена от общия процент на присаждане на кожа клапи, време на лечение на изгаряния и броят на смъртните случаи тежка термично увреждане. Присаждането на трансплантанти е завършено при 86% от пациентите. При 14% от случаите се наблюдава частично неразположение на кожните клапи. Въпреки продължаващото лечение, шест (19,3%) деца умряха. Общата площ на лезията на кожата в тях е от 40 до 70% от повърхността на тялото. Трансплантацията на култивирани ало-фибробласти не е свързана с фаталния изход от изгаряне при всеки пациент.

Анализ на резултатите от лечението, авторите отбелязват, че предишните изгаряния несъвместими с живота, за лечение на дълбока термично увреждане на кожния участък от 35-40% от повърхността на тялото (за малки деца - до 3 години - са критични дълбоки изгаряния, с площ от 30%, за по-големи деца възраст - над 40% от телесната повърхност). Когато хирургическа трансплантация на култивирани некректомия allofibroblastov autodermaplasty и последващо присаждане на кожа с големи изгаряния, перфорация фактор IIIB - IV степен остава критично, но в момента има перспективи в много случаи, за да спаси живота на още такива жертви. Хирургически некректомия във връзка с трансплантация на култивирани allofibroblastov и autodermaplasty при деца с дълбоки изгаряния оказа особено ефективно при пациенти с напреднали лезии на кожата с дефицит от донори сайтове. Активно хирургична тактика и трансплантиране култивирани allofibroblastov насърчаване бързо стабилизиране на общото състояние на такива пациенти, намаляване на броя на инфекциозните усложнения на горене заболяване, създаване на благоприятни условия за присаждането, намаляване на времето за възстановяване на загубените кожата и продължителността на болнично лечение, намаляване на честотата на смъртни случаи при пациенти с обширни изгаряния. Така, трансплантация на култивирани allofibroblastov последвано autodermaplasty кожни клапи постига възстановяване при деца с тежки изгаряния, които преди това са били считани обречено.

Общопризнато е, че основната цел на лечението на заболяване от изгаряне е да се максимизира пълното и бързо възстановяване на увредената кожа, за да се предотвратят получените токсични ефекти, инфекциозни усложнения и дехидратация на тялото. Резултатите от приложението на култивираните клетки до голяма степен зависят от готовността за трансплантация на самата рана. В случаи на трансплантация на култивирани кератиноцити към повърхността на раната след хирургическа некректомия prizhivlyaetsya средно 55% (по област) на трансплантирани клетки, като за гранулиране раните присаждане скорост се намалява до 15%. Следователно, успешното лечение на дълбоки изгаряния на кожата изисква, на първо място, активна хирургическа тактика. При наличие на степен на изгаряне IIIB-IV, повърхността на изгаряне се освобождава незабавно от некротичните тъкани, за да се намалят ефектите от интоксикацията и да се намали броят на усложненията на заболяването. Използването на тази тактика е ключът към намаляване на времето, от времето на изгаряне, затваряне на раната, и продължителността на престоя на пациенти с обширни изгаряния в болница, но също така значително намалява броя на смъртните случаи.

Първите доклади за успешното използване на култивирани кератиноцити за покриване на горящата повърхност се появяват в началото на 80-те години на миналия век. Впоследствие тази манипулация се осъществява с помощта на слоеве от култивирани кератиноцити, получени най-често от автостроуктури, много по-рядко от алокеератоцити. Технологията на автокератоцитопластиката обаче не позволява създаването на клетъчна банка, докато времето, необходимо за получаване на достатъчна присадка от кератиноцитите, е голямо и възлиза на 3-4 седмици. През този период рискът от развитие на инфекциозни и други усложнения при заболявания на изгаряния се увеличава рязко, което значително удължава продължителността на престоя на пациентите в болницата. Освен това, на практика няма autokeratinotsity prizhivlyayutsya трансплантация за гранулиране на рани от изгаряне, и високата цена на специализирани растежна среда и биологично активни стимуланти кератиноцитен растежен значително ограничава тяхното клинично използване. Други биотехнологични методи като kollagenoplastika трансплантация ksenokozhi криоконсервирана както и използването на различни покрития биополимерни повишаване на ефективността на повърхностна обработка на широки, но не дълбоки изгаряния. Методът за покриване на повърхността на раната с култивирани фибробласти е фундаментално различен по това, че основният компонент на култивирания клетъчен пул е не кератиноцити, а фибробласти.

Предпоставка за развитието на метода служи като доказателство, че перицитни които обграждат малките кръвоносни съдове са про- genitornymi мезенхимни клетки могат да се трансформират в фибробласти, които произвеждат много фактори на растежа и осигуряват зарастване на рани поради силния стимулиращ ефект върху разпространението и адхезията на кератиноцитите. Използвайки култивирани фибробласти за затваряне на рани повърхности веднага идентифицирани редица значителни предимства на този метод при използване на култивирани кератиноцити. В частност, изготвянето на фибробласти в културата не изисква използването на специални хранителни среди и растежни стимулатори, което намалява разходите за трансплантация на повече от 10 пъти разходите за получаване на кератиноцитите. Фибробластите са лесно подлагат на пасажи, през който те частично губят повърхност хистосъвместими антигени, което от своя страна дава възможност да се използват за производството на алогенни трансплантанти на клетки и създаване на техните банки. Съкращава получаващи трансплантанти, готови за употреба в клиника, от 3 седмици (кератиноцити) 1-2 дни (за фибробласти). Първични култури от фибробласти могат да бъдат получени чрез култивиране на клетки от кожни фрагменти взети autodermoplasty и клетъчно посяване плътност при получаване субкултури от човешки фибробласти е само 20 х 10 ³ на 1 cm ².

За да се изследва ефекта на фибробласти и техните регулаторни протеини в пролиферацията и диференциацията на кератиноцити, сравнителен анализ на характеристиките и морфологията на кератиноцит пролиферация на субстрати на колаген тип I и III и фибронектин в ко-културата с човешки фибробласти. Човешки кератиноцити са изолирани от фрагменти от кожата на пациенти с изгаряния, взети по време на операцията на автодермапластика. Плътността на кератиноцитите е 50 х 103 клетки на cm2. Клиничната ефикасност на трансплантацията на култивирани фибробласти се оценява при 517 пациенти. Всички пациенти са разделени на две групи: 1 - възрастни, засегнати от изгаряния IIA, B - IV степен; 2-ро - деца с дълбоки изгаряния IIIB-IV степен. Оценка на динамиката на структурна и функционална организация на еднослойна култура на фибробласти по отношение на ролята на процеса на регенерация на гликозаминогликани, фибронектин, колаген, и се оставя на авторите за определяне на третия ден като най-благоприятни условия за използване на фибробластни култури за производство на трансплантации. Изследване на въздействието на фибробластна пролиферация и диференциация на кератиноцити показа, че при ин витро фибробласти имат изразен стимулиращ ефект, предимно на кератиноцитни процеси адхезия, увеличаване на броя на адхерентни клетки и степента на определяне на повече от 2 пъти. Стимулирането на адхезионните процеси се придружава от повишаване на интензивността на ДНК синтеза и нивото на пролиферация на кератиноцитите. Освен това, беше установено, че присъствието на фибробласти и извънклетъчна матрица, образувана от тях е предпоставка за образуването tonofibrillyarnogo апарат кератиноцитни междуклетъчните връзки и, в крайна сметка, за кератиноцитна диференциация и образуването на базалната мембрана. При лечение на деца с дълбоки изгаряния установена клиничната ефикасност на трансплантация allofibroblastov култура, особено при пациенти с обширни поражения на местата на кожата донори в дефицит. Комплексно проучване morfofunktcionalnoe показа, че присадени характеризиращ фибробласти активен ДНК синтез, както и колаген, фибронектин и гликозаминогликани, които са създадени в клетките на извънклетъчната матрица. Авторите показват висок процент на присаждане на трансплантирани фибробласти (до 96%), рязко намаляване по отношение на тяхното получаване (в рамките на 2-3 часа, вместо 24-48 седмици в случай на кератиноцити), значително ускоряване на епителизацията на повърхността на изгаряне, и значително намаляване на цената (в 10 пъти) на технологията за отглеждане на присадката от фибробласти в сравнение с кератиноцитна трансплантация. Използването на трансплантация на култивирани allofibroblastov дава възможност да се спаси живота на деца с критични изгаряния - топлинни увреждания над 50% от повърхността на тялото, които по-рано се смяташе, несъвместими с живота. Забележително е, че алогенната трансплантация на ембрионални фибробласти и убедително доказва не само по-бързо възстановяване на рани и пациенти възстановителни с различна степен на горене и област, но също така значително намаляване на смъртността.

Автологични фибробласти се използват в такава сложна и пластична хирургия като повреда замяна корекция гласните струни. Обикновено се използва за тази цел говежди колаген, продължителност на действие, което е ограничено от неговата имуногенност. Като чужди протеини, говежди колаген, колагеназа чувствителен към получателя и може да предизвика имунна реакция, за да се намали риска, които са били разработени технологията на колаген препарати, омрежен с глутаралдехид. Предимството е по-голяма стабилност и ниска имуногенност, която е намерил практическо приложение при отстраняването на дефекти и атрофия на гласните връзки. Инжекциите на автоложния колаген са използвани за първи път през 1995 г. Методи предвидени запазване на първичната структура на автоложни колагенови влакна, включително ензимно катализирани междумолекулни напречни връзки. Фактът, че естествените колагенови фибри са по-устойчиви на разграждане от протеази от възстановени колагенови телопептиди където нарязани. Интегритет телопептиди важно за четвъртичната структура на колагенови влакна и омрежване между съседни колагенови молекули. За разлика от препаратите от говежди колаген, автоложна колаген не предизвиква имунен отговор в реципиента, но не е достатъчно ефективен като запълва агент. Устойчиви корекция може да бъде постигната благодарение на местно производство на автоложна трансплантация на колаген от фибробласти. Въпреки това разследването на ефективност на автоложна трансплантация на фибробласти в клиника разкри някои трудности. В началото на периода след трансплантацията фибробластен клиничен ефект е по-слаб в сравнение с тази след прилагане на говежди колаген. Когато култивирани автоложни фибробласти не могат да изключват възможността за преобразуване на нормални фибробласти в ненормално, така наречените мио фибробластите, отговорни за развитието на фиброза и белези, както се вижда от намаляването на колагенов гел, поради специфичното взаимодействие на фибробласти и колагенови фибрили. Освен това, след серийни пасажи на фибробласти ин витро губят способността им да синтезират извънклетъчни матрични протеини.

Въпреки това, в момента експериментална техника усъвършенства култивиране на човешки фибробласти автоложни, която елиминира посочените по-горе недостатъци и води до онкогенна трансформация на нормални фибробласти. Автоложните фибробласти, получени по този метод, се използват за запълване на дефектите на меките тъкани на лицето. В проучване на Х. Келер и съавтори (2000) 20 пациенти на възраст от 37 до 61 години с бръчки и атрофични белези са лекувани. Кожните биопсии (4 mm) BTE област се транспортира до лабораторията в стерилни епруветки, съдържащи 10 мл културална среда (Dulbecco антибиотик mikoseptikom, пируват и фетален говежди серум). Материалът се поставя в 3-5 културални чинии с диаметър 60 mm и се инкубира в термостат с атмосфера, съдържаща 5% СО2. След 1 седмица клетките се отстраняват от съдовете чрез трипсинизация и се поставят в 25 cm2 флакони. Клетките се прилагат на пациенти в количество от 4 х 107. Значителна и дълготрайна клиничен ефект се наблюдава при пациенти с корекция назолабиалните гънки, както и при пациенти с белези след 7 и 12 месеца след трансплантацията на третия автоложни фибробласти. Според поточната цитометрия, култивираните фибробласти произвеждат голямо количество колаген тип I. В in vitro проучвания е показана нормалната контрактилност на инжектируемите фибробласти. Два месеца след подкожно приложение на култивирани фибробласти в доза от 4 х 107 клетки, голи мишки не се откриват. Инжекционните фибробласти не причиняват образуване на белези и дифузна фиброза при пациенти. Според автора имплантираните автолозни фибробласти са в състояние постоянно да произвеждат колаген, което ще даде козметичен подмладяващ ефект. В този случай, тъй като продължителността на живот на диференцираните клетки е ограничена, фибробластите, взети от млад пациент, са по-ефективни от тези, получени при възрастни хора. В бъдеще възможността за криоконсервация на фибробластна култура, взета от млад донор, се предполага, че по-късно трансплантира на възрастен пациент свои собствени млади клетки. В заключение, това не е съвсем правилен извод, че автоложни фибробласти, при условие че тяхната функционална безопасност са идеални за корекция на лицеви дефекти на меките тъкани. В същото време самият автор отбелязва, че в процеса на изследването са възникнали и някои проблемни ситуации, свързани с използването на автоложна фибробласто-колагенна система. Клиничният ефект е често по-слаб, отколкото при използването на говежди колаген, което предизвиква разочарование при пациентите.

Като цяло, литературните данни за перспективите за клинична употреба на мезенхимни стволови клетки изглеждат доста оптимистични. Опитите са да се използват автоложни мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки на костен мозък за лечение на дегенеративни ставни лезии. Провеждат се първите клинични проучвания на култивирани мезенхимни прогениторни клетки при лечението на сложни фрактури на костите. Автоложни и алогенни мезенхимни клетки, строма на костен мозък костни използвани за генериране на хрущялната тъкан за трансплантация в коригиране на дефекти на ставния хрущял вследствие на травма, или автоимунни заболявания. Практикува методи за клинично приложение на мултипотентни мезенхимни клетки предшественици за коригиране на костни дефекти при деца с напредъка остеогенеза, причинена от мутации на тип I ген колаген. След mieloabelyatsii децата-реципиенти на трансплантиран костен мозък от HLA-съвместим здрав донор като нефракциониран костен мозък може да съдържа достатъчно количество от мезенхимни стволови клетки за попълване тежка костна дефект. След трансплантацията, алогенен костен мозък такива деца отбелязани положителни хистологични промени в трабекуларната кост, увеличаване на скоростта на растежа и намаляване на честотата на костни фрактури. В някои случаи се постига положителен клиничен резултат чрез трансплантиране на тясно свързан алогенни костен мозък и остеобласти. За лечението на вродена крехкост на костите поради дисбаланс на остеобласти и остеокласти в костната тъкан се използва и MSK трансплантация. Възстановяването на костно образуване в този случай се постига благодарение на химеризиране на групата от стволови и прогениторни стромални клетки в костната тъкан на пациентите.

Методите за генетична модификация на донорните мезенхимни стволови клетки се подобряват, за да се коригират генетичните дефекти на стромалните тъкани. Предполага се, че мезенхимни клетки предшественици, скоро ще бъдат използвани в неврологията за посока химеризацията мозъчни клетки и да се създаде група от здрави клетки, способни да генерират недостатъчната ензимна или фактор, отговорен за клиничните прояви на болестта. Трансплантацията на мезенхимни стволови клетки могат да бъдат използвани за възстановяване на строма на костен мозък при пациенти с рак след радиотерапия и химиотерапия, и в комбинация с костно-мозъчни клетки - за възстановяване на хематопоеза. Развитие на заместителна терапия, насочена към премахване на дефекти на опорно-двигателния апарат с помощта на мезенхимни стволови клетки насърчаване инженерство в биоматериали на дизайн матрица или biomimics образуващи скелета, обитаващи потомството на мезенхимни стволови клетки.

Източници на мезенхимни стволови клетки

Основният източник на мезенхимни стволови клетки е от костен мозък на хемопоетични стволови клетки, които при бозайниците е постоянно се диференцират в кръвните клетки и имунната система, като има предвид, стволови клетки, мезенхимни представени малки популации на фибробластоподобни стромата на костния мозък и спомагат за поддържане на недиференцирано състояние на хемопоетични стволови клетки. При определени условия, мезенхимни стволови клетки се диференцират в клетки на хрущяла и костта. Когато посяват върху хранителна среда при ниска плътност на засаждане на костен мозък мононуклеарни клетки от строма образуват колонии на адхерентни клетки, които в действителност са фибробластни мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки. Някои автори предполагат, че костния мозък депозиран неангажирани мезенхимни стволови клетки, които, благодарение на възможността за самостоятелно подновят и висока диференциация потенциални, осигуряват всички тъкани на тялото предшественици мезенхимни стромални клетки през целия живот организъм на бозайник.

В костния мозък елементите на стромалните клетки образуват мрежа, която запълва пространството между синусоидите и костната тъкан. Съдържанието на пасивен MSC в костния мозък на възрастен е сравнимо с броя на хематопоетичните стволови клетки и не надвишава 0,01-0,001%. Мезенхимните стволови клетки, изолирани от костен мозък и не са подложени на култивиране, са лишени от адхезивни молекули. Такива MSCs не експресират CD34, ICAM, VCAM, тип I и III колаген, CD44 и CD29. Следователно, ин витро мезенхимни стволови клетки, които не са фиксирани върху субстрат култура, и по-напреднали прогениторни получен мезенхимни стволови клетки, са оформени компоненти цитоскелетни и рецептор апарат на клетъчни адхезионни молекули. Стромални клетки с фенотип CD34 се намират дори в периферна кръв, въпреки че те са много по-малко в костния мозък от CD34-позитивните мононуклеарни клетки. CD34 клетките, изолирани от кръвта и прехвърлени в културата, се прикрепят към субстрата и образуват колонии от фибробласт подобни клетки.

Известно е, че в ембрионалния период стромалната база на всички органи и тъкани на бозайници и хора произхожда от общ басейн от мезенхимни стволови клетки преди и на етапа на органогенезата. Поради това се смята, че в зрялото тяло, повечето мезенхимни стволови клетки трябва да бъдат в съединителната и костната тъкан. Установено е, че по-голямата част от клетъчните елементи на стромата на свободната съединителна и костна тъкан са представени от ангажирани прогениторни клетки, които обаче запазват способността да пролиферират и да образуват клонинги in vitro. С въвеждането на такива клетки в кръвния поток за повече от 20% от мезенхимни прародителски клетки, имплантирани хематопоетични стромални елементи между тъкани и паренхимните органи.

Потенциален източник на мезенхимни стволови клетки е мастна тъкан, сред които от извършените стволови клетки са намерени в различни степени на адипоцитни предшественици. Най-малко зрели стволови елементи на мастната тъкан - стромални-съдови клетки, което е същото като мултипотентни мезенхимни прогенитори на костния мозък могат да се диференцират в адипоцити под действие на глюкокортикоидите, инсулин-подобен растежен фактор и инсулин. В културата на стромални съдови клетки се диференцират в адипоцити и хондроцити и мастната тъкан на костен мозък, получени клетки образуване адипоцити и остеобласти.

Мускулите също намерени стромален стволови източници. Първични клетки култури, изолирани от човешки скелетен мускул, разкрива звездообразните клетки и удължени многоядрени клетки. В присъствието на звездовидни клетки конски серум пролиферация ин витро без признаци на цитоделене и след добавяне на дексаметазон към средата на културата на диференциация се характеризира с появата на клетъчни елементи клетки с фенотипа на скелетната и гладък мускул, кост, хрущял, и мастната тъкан. Вследствие на това в човешката мускулна тъкан представени като най-ангажирани и не са поети мултипотентния мезенхимни предци. Показано е, че популацията на прогениторни клетки, намиращи се в скелетните мускули идва от неангажирани мултипотентни костен мозък мезенхимни клетки предшественици, и се различава от миогенни сателитни клетки.

В миокарда на новородени плъхове също така, адхезивни звездовидни клетки, подходящи за потенциала диференциация на мултипотентни мезенхимни прародителски клетки, като под въздействието на дексаметазон те се диференцират в адипоцити, остеобласти, хондроцити, гладкомускулни клетки, развиващи се мускулни клетки на скелетните мускули и сърдечни миоцити. Доказано е, че съдови гладкомускулни клетки (перицити) са получени мултипотентни недиференцирани клетки прекурсори периваскуларно мезенхимни. В културата на периваскуларни мезенхимни стволови клетки експресират а-гладкомускулен актин и тромбоцитен растежен фактор рецептор и са способни да се диференцират поне гладкомускулни клетки.

Специално място по отношение на стволови резерви се хрущял, много ниско репаративна потенциал от които се смята, че се дължи на дефицит на мултипотентни мезенхимни стволови клетки или диференциация и растежни фактори. Предполага се, че мултипотентните мезенхимни прогениторни клетки, предварително дарени на хондро- и остеогенезата, влизат в хрущялната тъкан от други тъканни източници.

Не се установява произход на тъканите и условията за комисиониране на мезенхимни прогениторни клетки в сухожилията. Ekspermentalnye наблюдения предполагат, че в началото на постнатални сухожилни клетки заек Ахил в първични култури в първото преминаване и задържане на експресия на колаген тип I и декорин, но при по-нататъшно култивиране те губят tenotsitov диференциация маркери.

Трябва да се отбележи, че отговорът на въпроса дали наистина локализирани в различни тъкани на мултипотентни мезенхимни стволови клетки, които винаги присъстват в тяхната строма, или тъкан басейн на мезенхимни стволови клетки, се компенсира чрез миграция на стромален костен мозък стволови клетки, тя все още се очаква.

Също костния мозък и други мезенхимни тъкани зони възрастни друг източник на MSCs може да бъде кръв от пъпна връв. Доказано е, че пъпна връв венозна кръв съдържа клетки, които имат сходни морфологични и антигенни характеристики с мултипотентни мезенхимни прародителски клетки са способни на сцепление, и не по-лоши мултипотентни мезенхимни стволови клетки от костния мозък произход чрез диференциране потенциал. В култури от мезенхимни стволови клетки от кръв от пъпната връв открити 5-10% неангажирани мултипотентни мезенхимни предшественици. Оказа се, че техният брой в кръвта на кабела е обратно пропорционална на гестационна възраст, което е косвени доказателства на миграцията на мултипотентни мезенхимни стволови клетки в различни тъкани по време на развитието на плода. Имаше първата информация за клинично приложение на мезенхимни стволови клетки, изолирани от кръв от пъпната връв, както и ембрионални биоматериал, който се основава на способността на известен ембрионални стволови клетки се интегрират и функция prizhivlyatsya в органи и системи тъкан възрастни получатели.

Търсенето на нови източници на мезенхимни стволови клетки

Използването на мезенхимни стволови клетки от ембрионален произход, подобно на други фетални клетки, създава редица етични, правни, правни и законодателни проблеми. Ето защо продължава търсенето на екстраемоничен клетъчен донор. Опит беше успешно клинично приложение на човешки кожни фибробласти, се определя от не само висока финансовия капацитет на технология, но също така бързо диференциацията на фиброцитите във фибробласти, имащи значително по-малко потенциал пролиферация и производство на ограничен брой растежни фактори. По-нататъшен напредък в областта на биологията и MSCs са мултипотентни мезенхимни стволови клетки от костен мозък могат да се разработи стратегия за клиничната употреба на автоложни мезенхимни стволови клетки. Технологията на тяхната изолация, култивиране, размножаване екс виво, и насочена диференциация изисква, на първо място, проучването на спектъра на молекулни маркери на MSCs. Техният анализ показва, че в първичните култури на човешката костна тъкан има няколко типа мултипотентни мезенхимни прогениторни клетки. Proosteoblastov фенотип намерени в клетки, експресиращи прогениторни клетки маркер STRO-1 стромални, но не носи маркер за остеобластната - алкална фосфатаза. Такива клетки се характеризират с ниска способност да образуват минерализирана костна матрица, както и липсата на експресия на остеопонтин и рецептор на паратиреоидния хормон. Производните на STRO-1-позитивни клетки, които не експресират алкална фосфатаза, са представени от междинни и напълно диференцирани остеобласти. Установено е, че клетъчните елементи на клонирани линии на STRO-1 положителни клетки от човешки трабекуларната костна са способни на диференциране в зрели остеоцити и адипоцити. Диференциацията на посоката на тези клетки зависи от излагането на полиненаситени мастни киселини, провъзпалителни цитокини - IL-1b и тумор некрозисен фактор а (TNF-а), както и противовъзпалително и имуносупресивно TGF-Ь.

По-късно е установено, че мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки нямат специфични само до тях, присъщи фенотип, но експресират комплексни маркери, характерни за мезенхимни, ендотелни, епителни и мускулни клетки в отсъствието на експресия на хематопоетични клетки имунофенотипни антигени - CD45, CD34 и CD14. В допълнение, мезенхимни стволови клетки и определящо индуцируемо произвеждат хематопоетични и не-хематопоетични растежни фактори, интерлевкини, хемокини и, и в мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки експресират рецептори за някои растежни фактори и цитокини. Сред стромални клетки основите на човешкото тяло намерени dormantnye или почивка клетки с имунофенотипа, почти идентични с антигенен профил на суров 5-флуороурацил мултипотентни мезенхимни прародителски клетки - тези и други клетки експресират CD117, маркиране "възрастен" стволови клетки.

Следователно, клетъчен маркер уникален за мезенхимни стволови клетки все още не е установен. Предполага се, че в покой клетки са поети популации на мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки, тъй като те не експресират клетъчни маркери на ангажиран с остеоартрит (CBFA-1) или адипогенеза (PPAR-у-2). Продължителното излагане на покой бавно пролифериращи клетки с телешки серум резултати плода в образуването на крайно диференцирани извършени прекурсори, които се характеризират с бърз растеж. Клоналното израстване на такива мезенхимни клетки на стволови клетки се поддържа от FGF2. Оказва се, че генома, получени от стволови клетки на стромата "затворени" стегнат достатъчно е съобщено за липсата на спонтанна диференциация в мезенхимни стволови клетки. - Без специални условия за извършване на дори и те не се превръщат в клетки на мезенхимни серия.

За да се изследва структурата на населението получен мезенхимни стволови клетки се търси диференциация маркерни протеини от клетъчни линии от строма и първични култури. В клонални анализ колония костно-мозъчни клетки ин витро установено, че когато е подложен на първични култури от EGF увеличава средния размер на колониите и намалява клонална експресия на алкална фосфатаза, докато добавянето на хидрокортизон активира експресията на алкална фосфатаза, което е маркер за остеогенна диференциация на MSCs ориентация. Моноклонални антитела срещу STRO-1 направиха възможно да се разделят и подготовка популации на STRO-1-положителни адхерентни клетки в хетерогенна система Dexter култури. Спектърът на цитокини не само регулира пролиферацията и диференциацията на хематопоетични и лимфоидни клетки, но също така участва в образуването, образуването и резорбцията на скелетната тъкан от пара, авто- и ендокринни механизми. Рецептор-медиирано освобождаване на вторичните пратеници като сАМР, диацилглицерол, инозитол трифосфат, и Са2 + се използват също за маркер анализ на различни категории стромални тъкани на клетки, експресиращи съответните рецептори. Използването на моноклонални антитела като маркери оставя да се установи стромални лимфоидни органи, принадлежащи ретикуларни клетки за Т и В-зависими зони.

От известно време продължават научните спорове около въпроса за възможността за произхода на MSC от хемопоетичните стволови клетки. В действителност, когато експлантационните суспензия на клетки от костен мозък в монослойна култура, в която отделни колонии растат фибробласти. Въпреки това, е показано, че присъствието на прекурсори на фибробластни колонии и различни микроби диференциация на хематопоетични тъкани, като част от костния мозък не е доказателство за общ произход от хематопоетични стволови клетки. Използване дискриминантен анализ на костен мозък стволови клетки установява, че микросреда в хетеротопна трансплантация, хематопоетични клетки от костния мозък се прехвърля, което доказва наличието, в костния мозък, независимо от histogenetic MSC популация от хематопоетични клетки.

В допълнение, селективен метод клониране разкрито в монослойни култури от костен мозък стромални клетки на нова категория прекурсорни клетки за определяне на техния брой, за проучване им свойства, пролиферативна и диференциация потенциал. Установено е, че ин витро фибробластоподобни стромални клетки пролиферират и образуват диплоидни колонии, когато обратната трансплантация в тялото гарантира образуването на нови кръвоносни образуващ органи. Резултатите от проучвания на отделните клонинги показват, че има популация от клетки в тяхната пролиферативна и диференциация потенциал могат претенция ролята на стволови клетки от строма тъкан, Gistogeneticheskaja независим от хематопоетични стволови клетки в стромален прогениторни клетки. Клетките от тази популация се характеризират с самоподдържащ се растеж и се разграничават в прогениторни клетки на костна, хрущялна и ретикуларна тъкан на костен мозък.

От изключителен интерес са резултатите от проучвания Chailakhyan R. Et AL (1997-2001), които са били култивирани костен мозък, получени прогениторни клетки от строма зайци, морски свинчета, мишки и на а-МЕМ културална среда, допълнена с фетален телешки серум. Авторите извършват експлантация с начална плътност от 2-4 х 103 клетки на костен мозък на 1 cm2. Както се използва за подаване хомоложен или хетероложен инактивиран чрез облъчване на клетки от костен мозък в задържащо действие доза фидер, но напълно блокира пролиферацията. Двуседмичните първични дискретни колонии на фибробласти бяха трипсинизирани за получаване на моноклонални щамове. Доказателства клонални колонии произход са получени при използване хромозомни маркери в смесени култури от костен мозък на мъжки свине и женски морски, времето изтича стрелба живи култури, както и в смесени култури от костен мозък на сингенни мишки и CBA SVAT6T6. Трансплантация на суспензия от прясно изолирани клетки от костен мозък се отглеждат ин витро или стромални фибробласти при бъбречната капсула е проведено в ivalonovyh порести матрици или желатин, както и инактивиран заек порестата костна матрица. Трансплантация на костен клонове покритие бедрата морско свинче почистената от мека тъкан и периост, изрязани епифизите и старателно промиване им костен мозък. Костта се нарязва на фрагменти (3-5 mm), изсушава се и се облъчва с доза от 60 Gy. В кожните корици бяха поставени и имплантирани интрамускулно отделни фибробластни колонии. За интраперитонеално трансплантация на фибробласти на стромата, отглеждат ин витро, ние използвахме видове дифузионната камера (V = 0015 см 3, з = 0, L mm) и D (V = 0,15 cm 3, з = 2 mm).

При изучаване на динамиката на растеж на клонални щамове Chailakhyan R. И сътр (2001) установяват, че отделните клетки, образуващи колония фибробласти, както и тяхното потомство имат голям пролиферативен потенциал. До десетия пасаж броят на фибробластите в някои щамове е 1.2-7.2 х ¹⁰⁹ клетки. В процеса на тяхното разработване те извършват до 31-34 клетъчни дублирания. Така хетеротопна трансплантация на костен мозък, получени щамове, образувани от стромални прекурсори няколко десетки клонове доведе до прехвърлянето на костен мозък микросреда и образование в новата трансплантацията зона хематопоетични органи. Авторите се повдига въпросът дали индивидуални клонове могат да понасят костен мозък микросреда стромални клетки, или да го изисква сътрудничеството на няколко различни клоногеничния стромален родоначалник? И ако индивидуални клонове ще бъдат в състояние да прехвърли микросредата, независимо дали тя е пълна с трите зародишни кръв, или различни клонинги осигуряват образуването на хемопоетични микросреда за различни микроби? За решаване на тези проблеми е разработена технология на култивиране стромални прогениторни клетки в гела на колаген, който позволява да стреля от повърхността на фибробласти отглеждат колонии за последващо хетеротопна трансплантация. Индивидуални клонове стромални фибробласти, клетки от костен мозък, отгледани от СВА мишки и морски свинчета, нарязани заедно с фрагмент от покритието чрез гел и трансплантирани хетеротопна - под бъбрек капсулата на сингенни мишки или автоложни мускулна корема морски свинчета. При трансплантация в мускулите, колониите на гела се поставят в космените покривки.

Ние открихме, че от 50-90 дни след трансплантацията на костен мозък фибробластен колония в 20% се наблюдават в развитието на трансплантация площ на кост или костен и хематопоетичната тъкан случаи. В 5% от получаващите животни образува джобове на костния с кухина изпълнен с костен мозък. Вътре костни цилиндри тези огнища имат закръглена форма и капсула, изградена от костна тъкан, с остеоцити и добре развито остеобластна слой. Костен мозък кухина съдържа ретикуларната плат с миелоидни и еритроидни клетки, пропорциите на които не се различават от тези в нормална костния мозък. Присадката на бъбреците е типичен медуларен тяло, образувано от нативния трансплантация на костен мозък, където кост капсула покрива само медуларен кухина от бъбречна капсулата. Хемопоезата тъкан включени миелоидна, мегакариоцитна и еритроидни елементи. Stroma на кухината на костния мозък се синусите добре развити и съдържат типични мастни клетки система. В същото време в областта на трансплантацията на костен някои колонии без признаци на хемопоеза беше установено при бъбречната капсула. Изследване на пролиферативно и диференциация активност на отделните клонове се продължи моноклонални щамове заек костен мозък, клетките се ресуспендират в културална среда и в отделен ivalonovoy гъба с тегло 1-2 мг засечено по бъбрек капсулата на донор на заек костен мозък. Такива клетки се подлагат на автотрансплантация 21 моноклонално щам. Резултатите бяха взети предвид след 2-3 месеца. Намерени Авторите, че 14% от трансплантираните щамове мозък моноклонални костните образува тяло съставени от кост и костен мозък кухина изпълнен с хематопоетични клетки. В 33% от случаите трансплантирани щамове образуват компактен кост с различен размер кухини ostootsitami зазидани в остеобластна и развита слой. В някои случаи, гъби трансплантирани клонове разработени ретикулум без кост или хематопоетични клетки. Понякога ретикуларната формация строма случило с добре развита мрежа от хармоници, но не населен кръвните клетки. Така получените резултати са подобни на тези, получени чрез трансплантация на клонинги на колагенов гел. Въпреки това, ако трансплантацията на клонове се отглеждат върху субстрата води до образуването на мозъчна тъкан е 5% от костта - 15% и тъкан ретикуларната - в 80% от случаите, моноклонално трансплантация щамове образуване на костно-мозъчни клетки се наблюдава при 14% от случаите на кост - в 53% и ретикуларен - в 53% от случаите. Според авторите, това показва, че условията за прилагане на пролиферативни и диференциация потенциали на стромални фибробласти при трансплантирани върху порести матрици са по-оптимални от техните трансплантации в костите и обхваща колаген субстрата. Не е изключено, че използването на по-напредналите методи на обработване и трансплантация на обратна връзка клонинги могат да подобрят условията за изпълнение на нейните клонове диференциация потенциали и промяна на тези отношения. По един или друг начин, но основната ценност на изследването се състои в това, че някои от клоновете стромални клетки, способни да формират костната тъкан като същевременно се гарантира стромален хемопоетични микросреда веднага в продължение на три стъбла от костен мозък на кръвта: еротроидния, миелоидна и мегакариоцитични, създаване на достатъчно голям, стъпала хемопоетични тъкан и някаква костна маса.

Освен това, авторите разглеждат въпроса за капацитета за тези видове клетъчна диференциация на отделните Клоногенните прогениторни клетки от строма в затворена система на дифузия камери. Освен това е необходимо да се определи дали отделните клонове на плурипотентни проявяват или дисплей за диференциране потенциал изисква кооперативно взаимодействието на няколко клона с фиксиран цитоделене знак, различно съотношение на който определя преференциално образуването на костите, сухожилията или ретикуларната. Чрез комбиниране на два методологични подходи - моноклонално изолати костни прогениторни клетки от строма на костен мозък и ги трансплантация в камерите за дифузия, Chailakhyan R. И сътр (2001) Получените резултати, които могат да се обърне разбирането на структурната организация на стромата на костен мозък. Трансплантация моноклонални щамове прогениторни клетки от строма на O клетки тип доведе до формирането на костите и хрущялна тъкан, което показва способността на потомство на един образуващи колонии стромални клетки едновременно образуващи кост и хрущял. Предположението, че костната тъкан и хрущялната тъкан произхождат от обикновената стромална прогениторна клетка, се повтаря многократно. Тази хипотеза обаче не е имала правилно експериментално потвърждение. Bone и формиране на хрущяла в дифузионни камери е необходимо да се докаже наличието на стволови клетки включват клетки мозък стромален прекурсорни костни общи за тези два вида тъкан.

След 29 клонални щамове втори и трети пасажи, първични култури, получени от костния мозък на заек се поставят в дифузионни камери и имплантирани интраперитонеално хомоложна животно. Изследванията показват, че 45% от моноклоналните щамове на костния мозък имат остеогенни ефекти. Изключително ретикуларната тъкан, съдържаща камери 9, но с костта и хрущяла тъкан все още присъства в камерите 13, което представлява 76% от всички щамове. В камерите от тип О, където е възможна диференциация както за костната, така и за хрущялната тъкан, бяха изследвани 16 щама. В четири камери (25%) се образува както костната, така и хрущялната тъкан. Отново трябва да се отбележи, че проучванията Chailakhyan R. Et AL (2001) отделните прогениторни клетки са подложени на клетъчен щам, състояща се от 31 до 34 удвоявания и тяхното потомство е 0.9-2.0 х 10 ⁹ клетки. Броят на митозите, на които са били изложени прекурсорните клетки на поликлоналните щамове, е практически същият като този на клетките на моноклоналните щамове. По този начин скоростта на развитие на поликлонални щамове, особено в първата фаза на образуването им, до голяма степен зависи от броя на колониите, използвани за откриване щамове. Диплоидни щамове на човешки ембрионални фибробласти (WI-38) за 12-15 reklonirovanii та удвояване нива също образуват колонии различни диаметър и по тяхното съдържание на клетките. Големи колонии, съдържащи повече от 103 клетки, са само 5-10%. С увеличаването на броя на разделенията делът на големите колонии намалява. Моно- и поликлонални костен мозък стромални фибробласти щамове запазват диплоидна хромозома определя след 20 или повече удвоявания и тенденция на развитие е сравним с динамиката на диплоидни щамове ембрионални фибробласти. Анализ на диференциация потенциал на специфични костен мозък прогениторни клетки от строма, проведени от трансплантация моноклонални щамове в дифузионни камери, показа, че половината от тях остеогенен. Големите колонии представляват 10% от общия им брой. Следователно, броят на клетките, образуващи остеогенни колонии, съответства на приблизително 5% от общата им популация. В общата маса на остеогенните прогениторни клетки, идентифицирани от авторите, имаше клетки, способни да образуват костна и хрущялна тъкан едновременно. За пръв път се установява, че за тези два вида тъкани в организма на възрастен е общ предшественик клетка: 25% от изследваните клонове са създадени от други клетки, и техните номера в общата популация на прогениторни клетки не е по-малко от 2.5%.

Така хетеротопната трансплантация на отделни клонове на фибробласти от костен мозък откри нови аспекти на структурната организация на популацията на мезенхимни прогениторни клетки. Намерено прогениторни клетки от строма, способни да предават специфичен микросреда веднага за всички хемопоетичен стволови който номер сред изследвани клонове по-големи от различни модели е от 5 до 15% (0.5-1.5% от общия брой на прогениторни клетки се отчита). Заедно с клоновете, прехвърляне пълна микросреда костен мозък, има клетки предшественици, детерминирани само за формирането на костите, която форма, когато прехвърля в една отворена система, костите, които не поддържат развитието на кръвообразуването. Техният брой от общия брой на прогениторните клетки е 1,5-3%. Някои от тези клетки могат да образуват костна тъкан с ограничен период на самостоятелно поддържане. Следователно, популацията на стромални прогениторни клетки е хетерогенна в своя диференциращ потенциал. Сред тях е категория клетка, твърдейки, ролята на стромален стволови клетки, способни на диференциране в трите измерения, свързани с костния мозък стромален тъкан, образуване на кости, хрущяли и ретикуларната тъкан. Тези данни ни позволяват да се надяваме, че с помощта на различни клетъчни маркери ще бъде възможно да се определи приноса на всеки вид клетки от стромата в микросредата на конкретната организация и подпомагане на хемопоеза в Dexter култури.

Характеристики на мезенхимни стволови клетки

През последните години, се установява, че в стационарни култури от костен мозък мезенхимни мултипотентни стволови клетки представени ограничена популация на малки agranular клетки (РС-1) клетки, характеризиращи се с ниска способност за колонизация и отсъствие на Ki-67 антиген експресиране специфично за пролифериращи клетки. Антигенни параметри dormantnyh RS-1 клетки са различни от спектъра на извършени антигени бързо пролифериращи прогениторни клетки от строма. Установено е, че висока степен на пролиферация на ангажирани прогениторни клетки се наблюдава само в присъствието на RS-1 клетки. На свой ред, RS-1 клетки се увеличава скоростта на растеж под влияние на фактори, секретирани от най-зрели получени прогениторни клетки мултипотентни мезенхимни. Изглежда, че RS-1-клетките са подклас от несвързани MSC, които са способни да рециклират. Ин витро устойчиви на 5-флуороурацил прогениторни клетки от строма на костен мозък се характеризира с ниско съдържание на РНК и високи нива на експресия на орнитин декарбоксилаза ген - маркер не-пролифериращи клетки.

Интензивното възпроизвеждане на стромални прогениторни клетки започва след фиксиране върху субстрата. Когато това се експресира маркер профил на слабо диференцирани клетки: SH2 (TGF-рецептор (3), SH3 (домейн сигнализация протеин), колаген тип I и III, фибронектин, адхезия рецептор VCAM-1 (CD106) и ICAM (CD54), кадхерин-11 , CD44, CD71 (рецептор на трансферин), CD90, CD 120а и CD124, но без експресия на характеристични маркери на хематопоетични стволови клетки (CD34, CD14, CD45). Клонираните растеж позволява многократно пасира мезенхимни стволови клетки, за получаване на култура на много генетично хомогенни стромален прогениторни плурипотентни клетки. Cerea 2-3 преминаването на техния брой достига 50-300 милион. В културата на достатъчна плътност след спиране на пролиферация на прогениторни клетки от строма, за разлика от фибробласти хематопоетични тъкани диференцират в адипоцити, миоцити, хрущялните клетки и костната тъкан. Комбинацията от регулаторните сигнали три диференциация съдържащ 1-метил-izobutilksantin (индуктор на образуване на междуклетъчен сАМР), дексаметазон (инхибитор на фосфолипаза а и с) и индометацин (инхибитор на циклооксигеназа, тромбоксан понижаваща активност и) се превръща в адипоцити до 95% от прогениторните мезенхимни клетки. Образуване на адипоцитната от незрели стромални клетки потвърждава експресия на липопротеинова липаза ген, хистохимично идентификация на аполипопротеини и peroxysomal рецептори. Клетки от един и същи клон повлиян от TGF-б в среда без серум създава хомогенна популация от хондроцитаната. Клетъчна култура многослоен на хрущяла извънклетъчна матрица се характеризира разработен, състояща се от протеогликан и колаген тип II. Хранителната среда с 10% ембрионален серум ефект диференциация сигнали комплекс, състоящ се от б-глицерофосфат (дарител неорганичен фосфат), аскорбинова киселина и дексаметазон, при същите култура стромални прогениторни прогениторни клетки води до образуването на клетъчни агрегати. В такива клетки, има прогресивно увеличение на активността на алкалната фосфатаза и остеопонтин нива, което показва образуването на костна минерализация, които клетки потвърдени прогресивно увеличаване на вътреклетъчния калций.

Според някои, способността на мезенхимни стволови клетки, за да се разделят за неопределено време и възпроизвеждане на различни видове мезенхимни наследствени клетки, комбинирани с висока степен на пластичност. Когато се прилага в камерите, или бялото вещество мезенхимни стволови клетки мигрират в паренхима на нервната тъкан и се диференцират в невроналната или глиална клетъчна линия, получена. В допълнение, има информация за MSC трансдиференциация в хематопоетични стволови клетки ин витро и ин виво. Един по-задълбочен анализ в някои изследвания определят изключително висока пластичност на MSCs, което се проявява в тяхната способност да се диференцират в астроцити олигодендроцити, неврони, кардиомиоцити, гладкомускулни клетки и скелетните мускулни клетки. В редица изследвания transdifferentsirovochnogo потенциал на MSCs ин витро и ин виво установено, че мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки за произход на костен мозък терминално диференцират в клетъчни линии, които формират костите, хрущялите, мускул, нерв и мастна тъкан, както и сухожилия и стромата, който поддържа хематопоеза ,

Въпреки това, в други проучвания, няма признаци на ограничение плурипотентност геном на мезенхимни стволови клетки и не могат да бъдат открити стромален стволови клетъчни популации, но за проверка възможни плурипотентни стромални клетки се изследва повече от 200 MSC клонинги, изолирани от първична култура. По-голямата част от ин витро клонове запазва способността да се диференцират в остеогенен, хондрогенна и адипогенни посоки. Когато се изключва вероятността за миграция на клетките реципиенти от трансплантация на мезенхимни стволови клетки по капсулата на бъбрека или в дифузионни камери се оказа, че прогениторни клетки от строма на място запазват хетерогенна фенотип, който показва или отсъствието на трансплантация зона рестрикционни фактори или отсъствието на самостоятелно плурипотентни MSCs. В същото време допуска съществуването на рядък вид соматични плурипотентни стволови клетки, които са общи прекурсори на стволовите клетки.

На мулти-, но не е вярно плурипотентни мезенхимни стволови клетки представляват много малка част от клетки от костен мозък и са способни, при определени обстоятелства, когато се култивира ин витро да пролиферират без да влизат в диференциация, както е видно от индуцира тяхната линия ангажимент на клетки в костите, хрущялите, мазнини, мускулна тъкан , както и в теноцитите и стромалните елементи, поддържащи хематопоезата. Обикновено непрекъснато излагане в културална среда с фетален телешки серум провокира изходни MSCs в стромата на извършените прогениторни клетки, потомството на която претърпява спонтанна крайната диференциация. Ин витро възможно да се постигне образуване посока остеобластна чрез добавяне на дексаметазон среда инсталация, бета-глицерофосфат и аскорбинова киселина, като комбинацията на диференциация сигнали дексаметазон и инсулин предизвиква образуването на адипоцити.

Установено, че преди да влезе в етап на терминална диференциация на костен мозък MSCs да създадат определени условия на култивиране първоначално се диференцират в фибробластоподобни мезенхимни стволови клетки. Производни на тези клетки ин виво са включени в образуването на кости, хрущял, сухожилия, мазнини и мускулна тъкан, както и стромален подкрепа хематопоезис. Много автори разбират понятието "мултипотентни мезенхимни клетки предшественици", както всъщност мезенхимни стволови клетки, както и извършените прогениторни клетки от строма и костен мозък мезенхимни тъкани. Клонираните анализ на мезенхимни мултипотентни прогениторни клетки от костен мозък произход показа, че малко повече от една трета от клонингите диференцирани в остеоартрози, hondro- и адипоцити, докато други клонове клетки имат потенциал и остеогеничен форма само hondro- и остеоцитите. Този клон на мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки като ВМУ-9, при подходящи условия микросреда диференцирани в клетки с фенотип и функционални характеристики не само на остеобласти, хондроцити и ADIC potsitov но стромални клетки, които поддържат хематопоеза. Изолирани от ембрионални клетки от костен мозък на плъх клониране RCJ3.1 диференцирани мезенхимни клетки от различни фенотипове. Чрез комбинираното действие на аскорбинова киселина, б-глицерофосфат, и дексаметазон от клетъчни елементи на този клон първо се формира многоядрени миоцити и след това последователно адипоцити, хондроцити и островчета минерализирана кост. Популацията на гранулирани клетки от периоста на фетуси на плъх съответства на свободните мултипотентни мезенхимни прародителски клетки, като се характеризира с ниска степен на пролиферация, не експресират маркери за диференциация и диференцирани в културални условия за образуване hondro-, остео- и адипоцити и гладкомускулни клетки.

По този начин, трябва да се признае, че въпросът за plyuri- или мултипотентност геном на мезенхимни стволови клетки е все още отворен, което съответно се отразява на представянето на потенциала диференциация на стромални клетки предшественици, което също не е напълно инсталирано.

Експериментално е доказано и важна характеристика на мезенхимни стволови клетки е тяхната способност да напусне тъкан нишата и циркулира в общото кръвообращение. За да се активира генетичната програма за диференциация, такива циркулиращи стволови клетки трябва да попаднат в подходящата микросреда. Показано е, че когато се прилага системно в кръвния поток MSCs получатели животните незрели клетки, имплантирани в различни органи и тъкани, след това разделен на кръвни клетки, миоцити, адипоцити, хондроцити и фибробласти. Следователно, в областите на локални тъканни настъпва сигнал регулиране взаимодействие на ангажираните и свободните прогениторни клетки от строма, както и между тях и околните зрели клетки. Предполага се, че индуцирането на диференциране се извършва паракринни регулаторни фактори от мезенхимен произход и nemezenhimalnogo (растежни фактори, ейкозаноиди, екстрацелуларни матриксни молекули), които осигуряват пространствените и времеви отношения в микросредата на различните потенциални мезенхимни предшественици. Следователно, локално увреждане на мезенхимни тъкани следва да доведе до образуването на микросредата зони мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки се различават качествено от сложни регулаторни сигнали интактни тъкани, в които физиологични процеси възникнат вместо репаративна регенерация. Тази разлика е изключително важна от гледна точка на специализацията на клетъчния фенотип в нормалната и предизвикана от увреждане микро-среда.

Според идеите тук се поставят механизмите на фундаменталната разлика на два известни процеси - физиологична регенерация и възпалителна пролиферация. Първата от тях завършва с възстановяването на специализирания клетъчен тъканен състав и неговата функция, докато резултатът от пролиферационния процес е образуването на зрели елементи на съединителната тъкан и загуба на функция на увредената тъканна зона. По този начин, да се развиват оптимални приложни програми мултипотентни мезенхимни клетки предшественици в регенеративната медицина и пластична изисква внимателно проучване на особеностите на факторите на микросредата влияние върху диференцирането на мезенхимни стволови клетки.

Зависимостта на отделението за структура на стволови клетки от пара-клетка и автокринни регулатори, чиято експресия се модулира от външни сигнали, не е един извън съмнение. Сред най-важните функции на регулаторни фактори са управляващи MSCs асиметричен разделяне и експресия на гени, определящи ангажимент стъпка линия и броят на клетъчното делене. Външните сигнали, от които зависи развитието на MSC, се осигуряват от микроклимата им. В незрели MSCs да пролиферират достатъчно дълго време, докато се поддържа възможността да се диференцират в адипоцити линия, миофибробласти, хематогенен стромални тъкани, хрущялни клетки, и костите. Установено е, че ограничен популация от циркулиращи SB34-отрицателни стромални клетъчни елементи от общото кръвообращение се връща строма тъкан на костен мозък, се превръща в линия, където CD34-позитивни хематопоетични стволови клетки. Тези наблюдения показват, че мезенхимни клетки рециркулация прогениторни в кръвта на тъкан осигурява подкрепа за баланса на стромата на стволови клетки в различни органи, като мобилизира общ басейн на незрели стромата на костния мозък. Диференциацията на MSCs в клетки с множество мезенхимни фенотипове и тяхното участие в ремонт или регенериране на кости, хрущял, сухожилия и мастната тъкан ин виво демонстрира от приемните модели трансфер в експериментални животни. Според други автори, отдалечена миграция на MSCs съдово легло се комбинира с местен изместване или korotkodistantnym мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки в тъканта на хрущяла на ремонт, мускулна регенерация, и други редукционни реакции.

Местните резерви произтичат фондации стромални тъкани играят роля източник на клетки в физиологични процеси регенерация на тъканите и се захранват от далечни транспортни мезенхимни стволови клетки, като разходите стромални тъкан стволови ресурси. Въпреки това, има нужда от спешна мобилизиране на клетъчен репаративна капацитет, като множествена травма, в възстановителните процеси на регенериране участва MSCs целия влак и периферията чрез кръвния поток назначени мезенхимни прекурсорни клетки на костен мозък.

Трансплантация на мезенхимни стволови клетки

Съществуват известни паралели между процесите на физиологична регенерация на тъканите и тяхното образуване през периода на вътрематочно развитие. На ембриогенезата на хора и бозайници, образуването на различни видове специализирани клетки, получени от екто, мезо и ендодермален зародиш слоеве басейн, но с участието на задължително мезенхима. Свободната клетъчна мрежа от ембрионална мезенхимна тъкан изпълнява множество регулаторни, метаболитни, скелетни и морфогенни функции. Bookmark условно органи се извършва само след мезенхим на кондензиращ за сметка на растеж клоногенен прогениторни клетки, които произвеждат основната морфогенни сигнали органогенезата. Строма получен ембрионални мезенхим създаде скеле условно органи и са в основата на бъдещата energoplasticheskogo гарантира дължи на растежа на първичния съдовата и лимфните съдове. С други думи, стромалните елементи на микроциркулационната единица на феталните органи се появяват преди формирането на техните структурно-функционални единици. В допълнение, активното миграция на мезенхимни клетки по време на органогенезата осигурява пространствена ориентация разработване органи поради маркировка граници им обем ограничаването хомеотични Hox-tepov. На стромалните настъпва скелет и монтаж на структурни и функционални единици на паренхимни органи, които често включва morphogenetically и функционално много различни клетки. Следователно, в ембриогенезата мезенхим са основна функция и осъществява чрез генериране на регулаторни сигнали активиращи регионално пролиферация и диференциация на стволови епителни клетки. Ембрионалните мезенхим клетки произвеждат растежни фактори като краката, HGF-б, CSF, за които има съответните рецептори на паренхимни прогениторни клетки. Зрелите диференцирани тъкани на мрежата за възрастен организъм стромални клетки също генерира сигнали за запазване на жизнеспособността и пролиферация на прогениторни клетки nemezenhimalnogo произход. Въпреки това спектър стромални регулаторни сигнали в постнаталното онтогенезата друга (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, Flt-3, LIF и т.н.) и има за цел да осигури физиологично възстановяване или ремонт на увредени тъканни зони. Освен това спектралните характеристики на стромалните регулаторни фактори във всеки вид тъкан и дори в рамките на един и същ орган са различни. По-специално, хематопоеза и лимфопоезисно за размножаването и диференциацията на хематопоетични и имунокомпетентни клетки се среща само в някои органи, в рамките на който действа стромален микросреда осигуряване на условия за зреене на хематопоетични и лимфоидни клетки. Тя е до регулаторни фактори микросреда зависи от способността на хематопоетични и лимфоидни клетки, за да населят тялото да пролиферират и зрял в своите микроструктурни ниши.

Сред компонентите на извънклетъчната матрица, които произвеждат мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки, трябва да се отбележи, фибронектин, ламинин, колаген и протеогликани, както и CD44 (хиалуронан и остеопонтин рецептор) получаване на основната част в организацията на междуклетъчната взаимодействието и образуването на извънклетъчната матрица в костния мозък и кост , Доказано е, че костен мозък мезенхимни, мултипотентни клетки създават redshestvenniki стромален микросреда, осигуряване на индуктивни и регулаторни сигнали не само мобилния превключвателен център, но също хематопоетични предшественици и nemezenhimalnye костен мозък стволови клетки. Известно е, че MSCs участващи в хематопоезата измерва чрез тяхната способност да се диференцират в стромални клетки, които поддържат хематопоеза, където активният насоки MSK сигнал, получени директно от хематопоетични стволови клетки. Ето защо културата на мрежови прогениторни клетки от строма е основа за хранене на всички клонинги на хемопоетични клетки.

В зрял организъм интензивност на хемодиализа и лимфопоезисно в състояние на динамично равновесие с "разходи" на зрели кръвни клетки и клетки на имунната система в периферията. От стромата на костния мозък и лимфните органи рядко актуализират, значителни стромални преструктуриране структури не се срещат в тях. Привеждане на системата за динамично равновесие е възможно с помощта на механични повреди на всички органи Хемо или лимфопоеза, което води до един и същи вид на последователни промени, които засягат не само и не толкова на хемопоетични или лимфоидни клетки, както стромални структури повредени органи. В процеса на регенерация репаративна предимно образува рамка строма, който след това заселване хематопоетични или имунни клетки. Това отдавна известен факт прави посттравматичен регенерация удобен модел за изучаване на стромален микросредата на кръвотворните органи. По-специално, за изследване на репаративна регенериране на костен мозък се използва механична изпразване медуларен кухина на дългите кости - кюретаж, което позволява бързо и ефективно да хематопоетичната тъкан от състояние на динамично равновесие. При изучаване на процеса на репаративна регенериране на хематопоетични и строма на костен мозък компоненти след механично изпразване на средната част кухина на пищяла морски свинчета установено, че между показатели регенериране на хематопоетични и стромални клетки (броят на хематопоетични клетки, концентрацията и количеството на прогениторни клетки от строма) няма пряка връзка. В допълнение, беше установено, че увеличаването на населението на стромални прогениторни клетки настъпва при по-ранна дата след кюретаж, и самите стромални фибробласти са fosfatazopolozhitelnymi, което е характерно за остеогенен тъкан. Също така беше установено, че кюретаж 3-5 дългите кости води до растеж на клетъчната популация в костния мозък и не-управляван кост дори в далака, което при морски свинчета е само лимфопойетичен тяло.

Морфологични картина възстановителните процеси в костния мозък kyuretirovannyh тибиални морски свинчета обикновено съответства на литературни данни, получени в експерименти с животни от други видове, динамиката на промените, настъпили след отстраняването на хематопоетичната тъкан е еднакъв за всички видове и разликата се отнася само времевите параметри , Морфологично процедура фаза за възстановяване на хематопоезата на медуларен кухина се изпразва в последователни процеси организиране на образуване на кръвен съсирек на костите груби влакна, нейната резорбция, на хармоници и ретикуларната образуването на строма, който допълнително заселване хематопоетични елементи. Броят на хематопоетични стволови клетки в костния мозък нараства процеса тъканна регенерация паралелно повишаване на съдържанието на хематопоетични стволови клетки.

Герасимов Yu и сътр (2001) спрямо промените в броя на хематопоетични клетки и количеството на стромални клетъчни прекурсори в отделните етапи на процеса на регенерация. Установено е, че количествени промени в костния мозък клетки в костния kyuretirovannoy съответства динамика на морфологични характеристики регенерация. Намаление през първите три дни на съдържанието на клетките в новородени автори приписват загубата на хемопоетични клетки в резултат на неблагоприятните ефекти на микросредата, което създава ретикуларната тъкан расте в останалата костния мозък в епифизата и в последните формират центрове остеоидно и съдови увреждания с кюретаж. 7-12-ия ден на осведомеността yaderosoderzhaschih клетки съвпада с появата на Отделните точки в миелоидни хемопоетични клетки от стромата неразпространение зони. На 20-ия ден са налице значителни части от регенерирана костния мозък и добре развити синусите, което е съпроводено от значително увеличаване на общия брой клетки. Въпреки това, броят на хематопоетични клетки в този период е 68% от контролните нива. Това е в съответствие с по-рано публикувани данни, които показват, че броят на кръвните клетки, образуващи след кюртаж достигне стандартите само 35-40 дни след операцията.

В ранния пост-травматичен период основният клетъчен източник за възстановяване на хемопоезата е клетъчните елементи, запазени при кюретаж. В по-късен момент основният източник на регенерация на костно-мозъчната хемопоетична тъкан са стволовите клетки, които реплоират свободните стромални зони. По отношение на определени категории стромални клетки (ендотелна, ретикуларни и остеогенни), източниците за образованието си в преструктурирането на медуларен кухина, остават неясни. Резултатите от Yu.V. Герасимова и сътр (2001) показват, че в останалите костен мозък след кюретаж клетъчна концентрация на образуващи колонии фибробласти значително по-високи, отколкото в нормален костен мозък. Авторите смятат, че с кюретаж е по-интензивна селективно елуиране на хематопоетични клетки, в сравнение с стромален образуващи колонии клетки, които участват в образуването на строма и по-здраво свързани с основната си вещество от хематопоетични клетки.

Динамиката на промените в броя на клетките, образуващи колонии фибробласти корелира с интензивността на остеогенезата процеси последващо трабекуларната костна резорбция и образуване ретикуларната строма, който се пренесат хематопоетични клетки. Повечето от стволовите прогениторни клетки образуват едра влакнеста костна тъкан и ретикуларна строма в посочените времена на регенерация. За фрактури на бедрената кост в условията на продължително остеосинтеза на 5-ти ден в зоната на регенериране повишава концентрацията на клетките и броят на образуващи колонии фибробласти, и образуването на кост в интензивно техният брой се увеличава от 6 пъти. Известно е, че костно-мозъчните клетки, образуващи фибробластни колонии, притежават остеогенни свойства. Броят на стромалните прогениторни клетки се увеличава преди колонизирането на площта на костния костен мозък с хематопоетични клетки. Това е в добро съгласие с доказателството, че стромалните клетки осигуряват образуването на хематопоетична микросреда. Очевидно е, че за създаването на хематопоетични микросреда съответства на определено ниво на регенерация на стромални тъкани, и увеличава броя на хематопоетични клетки при разширяване стромален предмостие подходящ за хематопоеза.

Най-голям интерес са авторите на данни, които веднага след кюртаж увеличава броя на прекурсори стромални клетки в отдалечени части на скелета. Като се започне от шестия час, и двадесетия ден включително контралатералния пищяла се наблюдава в повече от два пъти повишение в концентрациите и на броя на клетките, образуващи колонии на фибробласти. Механизмът на това явление е вероятно свързан с факта, че масивна увреждане на костния мозък в резултат на образуването на голям брой на кръвни съсиреци, като едновременно унищожаване значителен брой тромбоцити и освобождаване в кръвния получен от тромбоцити растежен фактор (RBSK), което е известно, че причинява пролиферация на клетки, образуващи колонии фибробласти разположени в тялото извън пролиферативния пул. В експерименти върху зайци локално приложение MSCs стимулира възстановяване на хирургически повреден хрущял на коляното, която може да бъде свързана с образуването на хондроцити, получени от MSCs въведени. Въпреки репаративна регенериране на костни дефекти в лабораторни плъхове е значително повишена при използване на мезенхимни стволови клетки, поставени в керамичен конструкция. Следователно, можем да предположим, че ако не RBOK, тогава всеки друг фактор, получен от увредените стромални клетки, има отдалечен стимулиращ ефект върху пролиферацията на мезенхимни клетки предшественици в интактни области на костния мозък и стимулира тяхната миграция в областта на мозъчна тъкан дефект на костите. На свой ред, това противоречи на литературни данни от предишни години, което показва, че стромални клетки са отговорни за микросредата, за разлика от хемопоетични клетки не са в състояние да мигрират и да идват от местни източници.

Въпреки това, резултатите от проучването Герасимов Ю и сътр (2001) показват, че прилагането на механична травма предизвиква не само рязко преструктуриране на стромален тъкан в костите kyuretirovannoy, но също така и значителни промени в съединителната тъкан на отдалечени костите непокътнати, което е, има системен отговор стромална тъкан за локална травма. И когато се прилагат polytrauma - множествена кюртаж - тази реакция се усилва и се наблюдава не само в управлявана кост и отдалечени части на скелета, но и в лимфоидните органи, по-специално на далака. Механизмът на такъв системен отговор на стромалната тъкан на костния мозък и далака към локална травма и политрамус остава неизвестен. Предполага се, че този процес е свързан с действието на хуморален фактор освободен мезенхимни строма медуларен костен мозък кухина. Възможност за вземане стромални клетки на костен мозък и далак organonespetsificheskogo хуморален фактор, отговорен за клетъчна пролиферация, образуващи колония фибробласти показват данни за тяхната колония стимулиращ активност в монослойни култури от костен мозък.

В тази връзка, следва да се отбележи, че когато се прилага системно мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки заселване техни производни не само костния мозък, но също така и други тъкани, които се използват, по-специално за генна терапия. Показано е, че след интравенозно приложение на големи количества MSCs с генома на див тип мишки с мутант колаген ген I донорни клетки замени до 30% от клетките в костната и хрущялна тъкан на реципиента, и трансфектираните мезенхимни стволови миши клетки, секретиращи IL-3 човека, за 9 месеца ефективно подпомагане на хемопоеза при едновременното им прилагане с човешки хематопоетични стволови клетки в имунодефицитни мишки.

[3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]

Генетична модификация на мезенхимни стволови клетки

Допълнителни експериментални успех на генетичната модификация да се отбележи MSCs трансфекция Фактор IX ген в човешки MSCs последвано от прехвърляне на клетка трансфектанти имунодефицитни мишки, което води до появата на кръвното антихемофилен фактор В в продължение на 8 седмици след трансплантация. В този експеримент беше извършена посттранслационна модификация на фактор IX с у-глутамил карбоксилаза в трансфектирани клетки. Трансдукция на MSCs с ретровирусен вектор, кодиращ човешки фактор IX, е по-малко успешни - последващо въвеждане на тези клетки с хемофилия куче в терапевтично ниво на фактор IX, който поддържа нормална интензивност коагулация хемостаза, само за 12 дни.

Трансплантацията на мезенхимни стволови клетки в мозъчния паренхим на животни показва, че незрелите клетки на донора се трансформират както в популацията на неврони, така и в глия. Присадка невронални производни здрав донор мезенхимни тъкани теоретично позволява коригиране на генетични аномалии на мозъка метаболизъм при пациенти с болест на Гоше и други разстройства на липидния метаболизъм, въглехидрати или ганглиозиди.

Продължавайки експериментални условия Вас трансдиференциация на стволови клетки в костния мозък клетки стромален прекурсорни в нервната и чернодробна тъкан. На вниманието на изследователите се фокусира върху комбинацията индукторите на диференциране и специални условни среди. По-специално, за изолиране на първичната култура с 10% фетален телешки серум, костен мозък стромални клетки се промиват и ресуспендират в DMEM / F12 културална среда (1/1) се посяват при плътност от 200 000 / cm2. След 24 часа, неприлепналите клетки се отстраняват и прикрепени към пластмасови фибробластни клетки се култивират в продължение на една седмица. За диференциацията на костния мозък стромални клетки на neuroblasts използвани кондиционирана среда, получена чрез култивиране на три дни култивиране на първични миши ембрионални фибробласти, както и между DMEM / F12 (1/1) с 2% фетален телешки серум и се допълва с 20 нг / мл или 10-6 М LiF ретиноева киселина (neyroinduktory които се прилагат към невронната диференциация на миши ембрионални стволови клетки и човешки). Диференциацията на костен мозък стромални клетки в прогениторни клетки в хепатоцити се индуцира кондиционирана среда, създадена в резултат на три дни култивиране на първична култура на ембрионални миши чернодробни клетки в DMEM / F12 (1/1) среда, допълнена с 10% фетален телешки серум.

Тук трябва отново да се отбележи, че колонообразуващите клетки на стромата на костен мозък са хетероморфни и могат да бъдат разделени на два вида. Първият тип включва фибробласт подобни клетки, които образуват филоподиални клетки с големи ядра и един или два нуклеоли. Вторият тип е представен от малки клетки с форма на шпиндел. В двата вида клетъчна култура в кондиционираната среда, получен на захранващото слой на първичен миши ембрионални фибробласти, и на Z-4-ия ден на културата клетките се появи Подобно neuroblasts. На този етап те често имат вретенообразна форма с един или два дълги процеса, завършващи с филоподии. Пирамидни или стелатни клетки с къси дендрити са по-редки. Дендрити един neuroblasts имат типичен разширение (растеж бъбрек) и разклоняване в дисталния си част, а другата - с различен конуси растеж филоподии, чрез което настъпва растеж дендрит. Подобни морфологични характеристики (конуси растеж бъбрек и филоподии а) присъщ невробластома, се диференцират в неврони, са подробно описани в документи от неврогенезата. Въз основа на това някои автори заключават, че клетките, които откриват в културата, са невробласти. По-специално, Schegelskaya Е. И сътр (2002), след първична култура от стромални клетки, култивирани в продължение на две седмици в сменяем при всеки Z-и-4-тия ден кондиционирана среда установено, че част от пролифериращи клетки, задържане на недиференцирана състояние. Навън такива клетки изглеждаха като фибробласти и бяха идентифицирани в култура заедно с диференциращи невробласти. Повечето от клетките (около 80%) са на различни стадии на диференциация в клетки на нервната тъкан, главно в неврони. Дендритичните процесите на тези клетки в близък контакт един с друг, така че постепенно клетки, образувани върху субстрата порции невронната мрежа под формата на дълги нишки многоклетъчни. Дендритните процеси на невробласти нарастват много по-дълго, някои от тях 8-10 пъти по-големи от дължината на тялото на самия неврон. Постепенно се увеличава делът на пирамидалните и стелатните клетки. Дендритите на стелатните клетки са разклонени. Според авторите, по-късно диференциация на пирамидални и звездовидни клетки в сравнение с вретеновидни съответства на последователността на обичайните етапи на неврогенезата при животни. В резултат на Авторите заключават, че стволовите клетки на костния мозък стромални клетки са изложени индуцирани неврогенезата в който метод ин витро получени neuroblasts от трите основни видове неврони. Прекурсорите на нервни клетки са открити в културата на костен мозък стромални клетки в продължение на 3-4 дни в среда с 2% ембрионален серум и 20 нг / мл LIF. Но в този случай, стволовите клетки се делят много бавно, диференциация на neuroblasts се среща само в 30% от случаите, а те не образуват невронните мрежи. Използване като нервните клетки диференциация индуктори ретиноева киселина, авторите получени в култура до 25-30% на нервните клетки с преобладаване на глиални клетки - астроцити и олигодендроцити. Невроните са само една трета от всички нервни клетки, въпреки че те бяха представени и трите типа: вретеновиден, пирамидални и звездовидни клетки. На шестия ден на култивиране стромални клетки в ретиноева киселина средни нервните клетки стана по диференциран, докато бяха намерени отделните аксони на пирамидалните неврони, които в нормално neuroontogenesis се появи по-късно образуване на дендритни процеси. Според авторите, въпреки ниския добив на нервните клетки, методът за индуциране на ретинолова киселина има предимства: астроцити и олигодендроцити и myelinating работи фуражни функции по време на растежа на аксони и дендрити и са необходими за образуването на нормалната нервната тъкан. Следователно, за да се ремонтират увредените места in vivo, по-добре е да се използва суспензия от неврони, обогатена с глиални клетки.

При втората серия от експерименти, авторите се опитали да индуцира диференциация на костен мозък стромални клетки в чернодробните клетки. След три дни култивиране на костен мозък стромален стволови клетки в кондиционираната среда, получена чрез инкубиране на миши ембрионални хепатоцити, големи, сферична форма клетки са открити, често две ядрени, цитоплазмени включвания с различни размери. Тези клетки са в различни етапи на диференциация, и се различават по размер, броя на ядрата и цитоплазмени включвания. В повечето от тези клетки се открива гликоген, на базата на който авторите ги идентифицират като прогениторни клетки на хепатоцити. От културата без клетки се откриват Подобно neuroblasts, последвано от заключението, че в кондиционираната среда, получена чрез култивиране на ембрионални хепатоцити, няма фактори на диференциация на нервните клетки и, обратно, има фактори, които индуцират диференциация на костен мозък стромални клетки в прогениторни клетки от хепатоцити , Авторите предполагат наличието на плурипотентни клетки от строма на костен мозък, като те се диференцират ин витро в клетки на черния дроб или нервна тъкан в зависимост от конкретните кондиционираната среда, и индуктори.

В някои творби диференциацията на строма на костен мозък в кардиомиоцитни, хрущялни, костни и нервни тъкани е наистина правилно показана. Има информация, че сред клетките на костния мозък има популации от стволови клетки, които могат да се диференцират в хепатоцити. В светлината на тези резултати горните експерименти при мишки все още може да се разглежда като още едно потвърждение на присъствието в костния мозък плурипотентни мезенхимни стволови клетки, които имат способност да се диференцират в клетки от различни тъкани на организма на възрастен.

Трансплантация на мезенхимни стволови клетки

В клиничната трансплантация на човешки мезенхимни стволови клетки, може да се използва за разширяване на хематопоетични стволови клетки и началото на тяхното потомство prekommitirovannyh. По-специално, въвеждането на автоложни хематопоетични стволови клетки и пациенти с рак MSCs след химиотерапия с висока ускорява възстановяването на неутрофилите и тромбоцитите в периферната кръв. Автоложни и алогенна трансплантация на мезенхимни стволови клетки, използвани за лечение на множествена миелома, апластична анемия, тромбоцитопения спонтанно - заболявания, свързани с първичен дефект хематопоетични стромални тъкани. Ефективността на клетъчна терапия на хематологични патологии, в много случаи по-горе, докато въвеждането на строма и хемопоетични стволови клетки, което се проявява намаляване на следоперативно възстановяване период, кръв, намаляване на броя на смъртни случаи поради неселективни унищожаване регионалните и циркулиращи ракови клетки, при което матрицата и неговите собствени прогениторни клетки хематопоетични пациенти. MSCs обещаващи приложения и други мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки в клиничната практика, поради тяхната относителна лекота на получаване аспирати костен мозък, експанзия в култура и трансфекция на терапевтичния ген. По този начин, за да компенсира дефекти местните тъкан могат да използват местен имплантиране на мултипотентни мезенхимни прекурсорни клетки и в системна дисфункция на тъкани от мезенхимен произход не се изключва въвеждането им в общото кръвообращение.

По-предпазливи в своите аргументи на авторите на произведения, в които перспективите на мезенхимни стволови клетки за селищни, системна трансплантация и генна терапия се анализират от гледна точка на биологията стромални клетки на. Постнатална костен мозък традиционно се разглежда като орган, съставен от две основни системи на различни клетъчни линии - всъщност хематопоетична тъкан и свързаната с него подкрепа строма. Следователно, костен мозък мезенхимни стволови клетки, първоначално се разглеждат само като източник на база стромален за производството на регулаторни фактори хематопоетични микросреда. Тогава вниманието на изследователите премина към изучаването на ролята на MSC като източник на скелетни тъкани. Последните данни показват неочакван потенциал на диференциацията на костния мозък стромални клетки да образуват невронни или мускулна тъкан. С други думи, мезенхимни стволови клетки проявяват transgermalnuyu пластичност - способност да се диференцират в клетъчни типове, които фенотипно неоригинални тъканни клетки. Въпреки това, някои аспекти на биологията на костен мозък стромални клетки остават неясни и нерешени цяло биологичен план, и в някои подробности, включително идентификация, характер, произход и развитие и функция ин виво костен мозък стромални клетки, както и допустимото потенциал диференциацията екс виво и възможността терапевтична употреба in vivo. Данните за потенциалните възможности на мезенхимни стволови клетки, както и на резултатите от проучванията на други регенеративната потенциал на стволови клетки, в рязък контраст с установената догма в биологията.

Когато се култивират при условия на ниска плътност, стволовите клетки от костен мозък формират отделни колонии, всеки от които е производно на единична прекурсорна клетка. Процентът на стромални клетъчни прекурсори в костния мозък ядрени клетки дефинирани чрез тяхната способност да образуват колонии голяма степен зависи от условията на култивиране и вида на MSCs принадлежащи. Например, в гризач, до получаване на максималния размер на прогениторните клетки от строма е абсолютно необходимо в присъствието на облъчени захранващото култура на клетки от костен мозък и серум, докато образуване ефективност на човешки мезенхимни стволови клетки колонията е независим от подаващото устройство, или от културалната среда. Броят на известните митогенни фактори, стимулиращи пролиферацията на стромални прогениторни клетки, е ограничен. Те включват PDGF, EGF, FGF, TGF-b, както и IGF1. При оптимални условия, култивиране MSCs поликлонални линии поддържат ин витро за повече от 50 клетъчни деления, което прави възможно да се получи милиарди костен мозък стромални клетки от 1 мл от него аспират.

Въпреки това, населението на костен мозък стромални клетки е хетерогенна, че се проявява като променливостта в размера на колонии, различен размер на тяхното образуване и разнообразие на клетъчната морфология, което включва набор от фибробласт-като шпиндел на големи плоски клетки. С развитието на такива култури след 20 дни се отбелязва фенотипна хетерогенност. Някои колонии са силно изразени чрез алкална фосфатаза, други изобщо не я изразяват, а колониите от тип 3 са положителни за фосфатазата в централния регион и фосфатаза-отрицателни в периферията. Отделни колонии формират нодули от костна тъкан (началото на матричната минерализация се отбелязва, когато се оцветява с червено алисарин или с калций от Van-Koss). В други колонии се получава натрупване на мазнини, идентифицирано чрез G-оцветяване с масло-червено. По-рядко колониите на мезенхимните стволови клетки образуват хрущяли, които са оцветени с алцианово синьо).

След извънматочна трансплантация при експериментални животни поликлонални MGK линии образуват ектопична кост строма с setchatoobraznoy свързани с миелопоезата и адипоцити, както и, но рядко, с хрущялната тъкан. В моноклонално линии трансплантация на костен мозък стромални клетки в някои случаи има химеризъм, където де ново образува костна тъкан се състои от костни клетки, адипоцити включва строма и донорен произход, докато клетъчни линии на хематопоетични и съдовата система са получени от реципиента.

Резултатите от тези изследвания потвърждават стволовата същност на прекурсора на стромалния костен мозък, от който е получена клоналната линия. Те също така показват, че не цялото клониране в културните клетки наистина са многопотенциални стволови клетки. Някои изследователи смятат, и ние споделяме мнението, че най-точна информация за реалния потенциал на диференциация на отделните клонове може да се получи само ин виво след трансплантацията, а не чрез определяне на фенотипа на техните производни ин витро. Експресия в остео- култура фенотипни маркери hondro- или адипогенеза (определено от иРНК или чрез хистохимични техники), и дори производството на минерализирана матрица не отразява степента на плурипотентност единичен клон ин виво. Поради това идентифицирането на стволови клетки в групата на стромални клетки е възможно само след това при подходящи условия на тест за биологично трансплантиране. По-специално, хондрогенеза много рядко се наблюдава в отворени системи за трансплантация, докато образуването на хрущял не е необичайно в затворени системи, като дифузионни камери или в mikromassnyh култури от стромални клетки ин витро, характеризиращ се постига локално ниско напрежение кислород, допринасят за образуването на хрущяла. Следователно, дори техниката на трансплантация, както и неспецифичните условия за култивиране in vitro, значително повлияват обхвата на MSC диференциация.

Експерименталната трансплантация при спазване на дадените експериментални условия е златният стандарт за определяне на потенциала за диференциация на стромалните клетки на костния мозък и ключов елемент за тяхното правилно идентифициране. Исторически изследванията за трансплантация на костен мозък на костен мозък на костен мозък са свързани с общ проблем с трансплантацията на костен мозък. Установено е, че хемопоетичната микросреда се създава чрез трансплантация на стромални клетки от костен мозък и осигурява ектопично развитие на хемопоетичната тъкан в зоната на трансплантация. Произходът на микросредата от донора и хематопоетичната тъкан - от гостоприемника ни позволява да лекуваме ектопичната кост като истинска "обърната" трансплантация на костен мозък. Локалната трансплантация на стромални клетки на костния мозък стимулира ефективната корекция на костните дефекти, по-изразена, отколкото в спонтанната репаративна регенерация. В няколко предклинични изследвания в животински модели убедително доказва възможността за трансплантация на костен мозък стромални клетки в ортопедията, въпреки че за оптимизиране на тези методи, дори и в най-простите случаи, изискват най-внимателно работата и анализ. По-специално, оптимални условия за разширяване екс виво остеогенни стромални клетки, все още не са определени, без отработени структура и състав са идеални носител и броят на клетките, необходими за възстановяване на костния обем.

В допълнение към прилагането размножени екс виво костен мозък стромални клетки на тъканна регенерация на мезенхимен произход неортодоксален пластичност MSC отваря потенциалното използване за регенериране на нервни клетки, или доставката на генни продукти в ЦНС. По принцип това опростява клетъчната терапия при поражение на нервната система, тъй като няма нужда да се получават автоложни нервни стволови клетки от хора. Съобщава се за възможностите за използване на клетки от костен мозък за генерирането на кардиомиоцити и миогенни прекурсорни клетки като истински стромален и външен произход.

Провеждат се експерименти за системна трансплантация на стромални клетки от костен мозък за лечение на общи скелетни заболявания. Няма съмнение, че костен мозък стромални клетки са популация отговорен за генетични заболявания при заболявания на скелета, който е добре илюстрирано чрез трансфер вектор с помощта на генетичната информация на клетките, което води до образуването на патологична костна тъкан в експериментални животни. Въпреки това, способността на стромалните клетки да имплантират, растат, умножават и диференцират в костите на скелета след въвеждането им в общия кръвен поток все още не са доказани.

Това отчасти се дължи на факта, че стандартната процедура на костен мозък стромата не са с трансплантирани хемопоетични тъкан, така строги критерии за оценка успешно присаждане на системно прилагане на стромални клетки все още не са развити. Трябва да се помни, че присъствието на маркерни гени в тъканни екстракти или освобождаване в културата на получени от донор клетки не свидетелства за присаждане на клетки, но само за тяхното оцеляване. Дори интраартериално инжектиране на костен мозък стромални клетки в крайник на мишката може да доведе до почти нулев резултат присаждане, въпреки факта, че получени от донор клетки се откриват в големи количества в рамките на мрежата мозък на микроваскуларни кост. За съжаление, такива клетки обикновено се описват като "присадени" само въз основа на резултатите от определянето на маркери донорни гени при условия на екс виво култура. Освен това е необходимо да се предоставят убедителни доказателства за дългосрочна интеграция в тъканите на диференцирани и функционално активни клетки от донорски произход. В много публикувани произведения, където се съобщава за присаждането на стромални клетки от костен мозък в скелета, липсата на ясни данни от този вид е учудващо. Независимо от това, трябва да се отбележи, че при някои правилни експерименти върху животни обаче е установено ограничено, но реално присаждане на стромални прогениторни клетки след тяхното системно приложение.

Тези данни са в съответствие с резултатите от проучването на възможността за доставяне на миогенни прекурсорни клетки на костния мозък до мускулите през съдовата система. Не трябва обаче да се забравя, че се формират както скелетни, така и мускулни тъкани по време на развитието и растежа въз основа на екстраваскуларни клетъчни движения, които използват миграционни процеси, които не включват циркулация в кръвта. Ако действително съществува независим циркулационен път за доставянето на прекурсорни клетки към тъкани в твърда фаза, възможно ли е да се допусне съществуването на физиологично циркулиращи мезенхимни прогениторни клетки? Какъв е произходът на тези клетки както в развиващия се, така и в постнаталния организъм и как те проникват в съдовата стена? Решаването на тези въпроси е абсолютно необходимо и изисква най-задълбочения предклиничен анализ. Дори и след като се открият отговорите на тези въпроси, проблематичните кинетични аспекти, свързани с растежа на скелета и ремоделирането на съединителната тъкан, остават нерешени. В същото време, лечението на разстройства на остеогенезата чрез заместване на цялата популация от мутирали скелетни прогениторни клетки със здрави стромални клетки изглежда е реална клинична перспектива. В този случай локалните зони на фрактура или деформация поради патологична остеогенеза, както и деструктивни промени в костната тъкан, могат да бъдат коригирани чрез култивирани стволови стволови клетки in vitro. Поради това посоката на бъдещи изследвания трябва да бъде фокусирана върху проблемите на трансформацията или генетичната корекция на автоложни мутирали остеогенни прогениторни клетки ex vivo.

Генното инженерство на клетки, временно или постоянно, става основа на клетъчната и молекулярна биология, източник на много научни данни за ролята на отделните протеини в клетъчния метаболизъм ин витро и ин виво вещества. Използването на молекулярни методи за коригиране на наследствени заболявания и заболявания на човека е много обещаващо за практическо медицина, тъй като свойствата на стромален костен мозък стволови клетки могат да се развиват уникална вериги трансплантация за корекция на генетичните заболявания на скелета. В този случай, на мезенхимни стволови клетки могат да се получат доста лесно от бъдещия получател, те са податливи на генетични манипулации и са в състояние да се размножават в големи количества в един кратък период от време. Използването на мезенхимни стволови клетки избягва ограниченията и рисковете, свързани с доставянето на генетичен информационен материал директно на пациента чрез векторни векторни структури. Тази стратегия е приложима за пи ембрионални стволови клетки, но постнатални автоложни костно-мозъчни стромални клетки - предпочитан материал поради тяхното администриране изключва възможни имунологични posttransplantation усложнения. За да се постигне краткотраен ефект, например, за да се ускори костна регенерация, оптималният метод е генетичната модификация на мезенхимни стволови клетки, използвайки elektroporatsrsh, химически синтез, липофекция, плазмиди и аденовирусни конструкции. По-специално, вирусната трансфекция в стромални BMP-2 клетки на костен мозък е ефективна при ускоряване на регенерацията на костите в експериментална политрамус. Създаването на аденовирусни векторни структури е за предпочитане поради отсъствието на токсичност. Въпреки това генетичната модификация на стромалните клетки на костния мозък в този случай се характеризира с изключително ниска стабилност. Освен това, нормални трансформирани костен мозък стромални клетки изискват използването на вектор носители на генетична информация 10 пъти по-инфекциозен от други видове клетки, което значително увеличава процента на смъртта на трансфектираните клетки.

За лечение на заболявания, причинени от рецесивни слабо или нулево биологична активност на някои гени необходимо продължително или постоянно модификация на мезенхимни стволови клетки, което изисква използването на адено-свързани вируси, ретровируси, лентивируси и адено-ретровирусна химера. Транспортните места на тези вируси са способни да носят големи ДНК трансфекти (до 8 kb). Научната литература вече се е появило информация за биологичната активност на екзогенни стромални клетки на костен мозък, трансфектирани с ретровирусни структури, кодиращи синтеза на регулаторни молекули, и маркери - IL-3, CD2, фактор VIII, и ензими, участващи в синтеза на L-DOPA. Но в тези произведения авторите посочват редица ограничения, които трябва да бъдат преодолени преди практическото приложение на тази технология да започне. Първият проблем е да се оптимизира процесът на модификация ex vivo на МСК. Известно е, че дългосрочно (3-4 седмици) ин витро пролиферация на стромални клетки на костния мозък намалява тяхната трансфектирани. В същото време са необходими няколко цикъла на преливане, за да се постигне високо ниво на генетична модификация на MSC. Вторият проблем е свързан с продължителността на експресията на терапевтичния ген, който все още не надхвърля четири месеца. Естествено намаляване на ефективната генна експресия се дължи на инактивирането на промотори и смъртта на модифицираните клетки. Като цяло перспективи прехвърляне на генетична информация чрез използване на мезенхимни стволови клетки резултатите от предварителните проучвания показват необходимостта от по-нататъшно оптимизиране на методи за трансфекция екс виво, изборът на подходящо промотор регулиране на биологичната активност в правилната посока, и подобряване на способността на модифицирани костен мозък стромални клетки самостоятелно подновяване ин виво след трансплантацията. Трябва да се отбележи, че използването на ретровирусни конструкти за модификацията на костен мозък стромални клетки в желаната посока не винаги изисква тяхното задължително присаждане. Трансфектирани мезенхимни стволови клетки може да изпълнява функцията на коректив на фона на стабилна и пребиваване, без да изисква активна физическа учредяване и функциониране на съединителната тъкан. В този случай, те трябва да се разглежда като биологичен мини-помпа, производство на ин виво фактор, липсата на което определя проява на генетично заболяване.

Използване на трансформирани костен мозък стромални клетки за лечение на доминантен генетичен заболяване, което се характеризира с експресия на гена или анормален патологична биологичната активност, е много по-проблематично, тъй като в този случай е необходимо да се блокира предаването или продажбата на генетичната информация изкривен. Един от методите на генното инженерство - хомоложна рекомбинация на ембрионални стволови клетки за генериране на трансгенни животни. Въпреки това, изключително ниско ниво на хомоложни рекомбинантна, съчетана с проблемите на идентификацията, разделяне и разширяване на такива бинанти е малко вероятно да се насърчи широкото използване на тази техника в близко бъдеще, въпреки че разработването на нови технологични методи. Вторият подход на генна терапия се основава на доминиращата патология автоматично коригиране на повредени ДНК като генетични мутации могат да бъдат коригирани чрез въвеждане на екзогенна ДНК с желаната последователност (кратко ДНК олигонуклеотиди, или химерни РНК / ДНК олигонуклеотиди), които се свързват към хомолози в увредената геном. Третото изпълнение осигурява патологична заключване предаване на информация, която се постига чрез използването на специално предназначени олигонуклеотиди, които се свързват с определен ген за образуване на тройна спираловидна структура, което изключва възможността за транскрипция.

Въпреки, че коригирането на генетични заболявания на нивото на генома е оптимално и предпочитан терапевтичен метод, иРНК е обещаващ вектор (може би дори по-достъпни) за блокиране на доминантен негативен ген. С цел да се инхибира транслация и / или повишаване на разграждане на иРНК са отдавна се използва с протеинови молекули Антисензитивни олигонуклеотидни последователности или пълно блокиране на свързването на иРНК биосинтетичен апарат на клетката. В допълнение, двойноверижна РНК индуцира бързо разграждане на тРНК, механизмът на който остава неясен. Въпреки това е малко вероятно, че самото отстраняване на иРНК транскрибирано от мутантния алел с къси или единични мутации ще насърчава иРНК израз на нормалния алел. Една алтернатива е използването ribozinov чук и фиба на, имат способността да се свързват с високо специфични сайтове на иРНК с последващо индуциране на тяхното разцепване и инактивиране по време на транслация. В момента се проучва възможността за използване на този метод при лечението на патологична остеогенеза. Независимо от това, което точно е целта - геномни или цитоплазмени елементи успеха на нов ген терапия технология ще се определя от ефективността на включването на реагенти в костния мозък стромални клетки екс виво, оптималният избор на даден вектор и стабилен способността на мезенхимни стволови клетки, експресиращи желания фактори ин виво.

По този начин откриването на мезенхимни стволови клетки с техните неочаквани свойства създава нова концептуална схема за развитието на клетъчните линии. Но за да се разбере биологичната роля на стромален стволови клетки, поради своя характер, способността да трансдиференциация или диференцирането, физиологичното им значение в процеса на развитие на ембриона, постнатална растежа, съзряването и стареене, както и в човешки заболявания се нуждаят от допълнително интердисциплинарните изследвания.