Невронни стволови клетки

Експериментални доказателства за възможността за регенерация на клетките на ЦНС са получени много по-рано от откриването на ембрионални стволови клетки в изследвания, които показват наличието на клетки в неокортекса, хипокампуса и обонятелните луковици на мозъка на възрастни плъхове, които улавят 3H-тимидин, т.е. са способни на протеинов синтез и делене. Още през 60-те години на миналия век се приема, че тези клетки са предшественици на неврони и участват пряко в процесите на учене и памет. Малко по-късно е разкрито наличието на синапси върху неврони, образувани de novo, и се появяват първите трудове по използването на ембрионални стволови клетки с цел индуциране на неврогенеза in vitro. В края на 20-ти век експерименти с насочена диференциация на ембрионални стволови клетки (ESC) в невронни прогениторни клетки, допаминергични и серотонинергични неврони довеждат до преразглеждане на класическите представи за способността на нервните клетки на бозайниците да се регенерират. Резултатите от многобройни изследвания убедително доказват както реалността на преструктурирането на невронните мрежи, така и наличието на неврогенеза през целия период на постнаталния живот на организма на бозайниците.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Източници на неврални стволови клетки

Човешките невронни стволови клетки се изолират по време на операции върху субвентрикуларната област на страничните вентрикули и зъбната извивка на хипокампуса, чиито клетки образуват невросфери (невронни сфери) в култура, а след дисперсия и преформиране на последните - всички основни клетъчни типове на централната нервна система или, в специална среда, нови микросфери. В суспензионни култури от дисоциирана тъкан, изолирана от перивентрикуларните области на ембрионалния мозък, също възникват невросфери.

Маркерите на незрели мозъчни клетки включват нестин, бета-тубулин III (маркер на невронната линия), виментин, GFAP и NCAM, които се идентифицират имуноцитохимично с помощта на моноклонални антитела. Нестин (междинен неврофиламентен протеин тип IV) се експресира от мултипотентни невроектодермални клетки. Този протеин се използва за идентифициране и изолиране на мултипотентни невроепителни прогениторни клетки от ЦНС, използвайки моноклонални антитела Rat-401, които могат да открият до 95% от клетките на невралната тръба в ембриони на плъхове на единадесетия ден от бременността. Нестин не се експресира върху диференцирани потомци на неврални стволови клетки, но присъства в ранните неврални прогениторни клетки, постмитотични неврони и ранни невробласти. Този маркер е използван за идентифициране на невроепителни прогениторни клетки и за доказване на съществуването на стволови клетки в ЦНС. Виментин (междинен неврофиламентен протеин тип III) се експресира от неврални и глиални прогениторни клетки, както и от неврони, фибробласти и гладкомускулни клетки. Следователно, и двата имуноцитохимични маркера нямат специфичността, необходима за отделно идентифициране на невралните стволови и прогениторните клетки. Бета-тубулин III установява невронната посока на диференциация на стволовите клетки, докато астроцитите тип I се идентифицират чрез експресия на GFAP, а олигодендроцитите специфично експресират галактоцереброзид (Ga!C).

FGF2 и EGF служат като митогени за невралните прогениторни клетки, подпомагайки пролиферацията на недиференцирани прогениторни клетки в култура с образуването на невросфери. Скоростта на делене на невралните стволови клетки се увеличава значително под влиянието на FGF2, както и с използването на комбинация от FGF2 + EGF. Пролиферативните ефекти на FGF2 се медиират от FGF2-R1 рецептори. Хепаринът повишава афинитета на свързване с FGF2 рецептора и драстично засилва митогенния му ефект върху невроепителните клетки. В ранните етапи на ембриогенезата, FGF2 рецепторите се експресират в теленцефалона на плъха, докато в по-късните етапи тяхната локализация е ограничена до вентрикуларната зона. Пикът на експресията на FGF2-R1 от постмитотичните клетки се наблюдава след завършване на ранния период на неврогенеза. Началният период на развитие на теленцефалона се характеризира с ниско ниво на експресия на EGF рецептора, главно в клетките на вентралната област. В по-късните етапи на ембриогенезата, експресията на EGF-R се увеличава в дорзална посока. В мозъка на гризачи, EGF има висок афинитет към рецептора на трансформиращия растежен фактор бета (TGF-β-R), с който се свързва преференциално. Косвени доказателства за функционалната роля на EGF-R се предоставят от данни за кортикална дисгенезия на предния мозък, която се проявява в късния период на ембриогенезата и постнаталната онтогенеза, намалена функция на предния мозък, смърт на кортикалните клетки и хипокампална ектопия при мишки с нокаутиран ген на EGF рецептора. Освен това, наличието на TGF-α в хранителната среда е абсолютно необходимо за образуването на невросфери. След отстраняването на растежните фактори от кондиционираната среда, клетките спират да се делят и претърпяват спонтанна диференциация с образуването на неврони, астроцити и олигодендробласти.

Като се има предвид това, реагрегацията на дисоциирани стволови клетки и култивирането на невросфери се извършват в хранителни среди, съдържащи EGF и основен FGF или FGF2, но без добавяне на серум. Доказано е, че EGF индуцира пролиферация на стволови клетки от субепендималната зона на страничните вентрикули, а основният FGF насърчава пролиферацията на стволови клетки от стриатума, хипокампуса, неокортекса и зрителния нерв на зрелия мозък. Комбинацията от EGF и основен FGF е абсолютно необходима за активна пролиферация на стволови клетки, изолирани от епендимата на третия и четвъртия вентрикул на предния мозък, както и от гръбначния канал на гръдния и лумбалния отдел на гръбначния мозък.

След дисоциация, суспензията от невронни стволови клетки се култивира в пластмасови блюда или многоямкови плаки без адхезивен субстрат, за да се увеличи размерът на образуваните нови невросфери, което обикновено отнема около 3 седмици. Методът на многократно диспергиране и размножаване на невросферите позволява получаването на достатъчен брой линейни клонове на мултипотентни стволови клетки за интрацеребрална трансплантация. Този принцип е и основата за създаване на банка от стволови клетки, изолирани от човешкия ембрионален мозък. Тяхното дългосрочно (в продължение на няколко години) клониране дава възможност за получаване на стабилни линии от невронни стволови клетки, от които по време на индуцираната диференциация се образуват катехоламинергични неврони.

Ако невросферите не се диспергират и не се отглеждат върху адхезивни субстрати в среди, лишени от растежни фактори, пролифериращите стволови клетки започват спонтанно да се диференцират, за да образуват невронни и глиални прекурсорни клетки, експресиращи маркери на всички видове нервни клетки: MAP2, Tau-1, NSE, NeuN, бета-тубулин III (неврони), GFAP (астроцити) и CalC, 04 (олигодендроцити). За разлика от клетките на мишки и плъхове, невроните представляват повече от 40% от всички диференцирани клетки в човешките невронни стволови клетъчни култури (от 1 до 5% при гризачи), но се образуват значително по-малко олигодендроцити, което е много важно от гледна точка на клетъчната терапия на демиелинизиращи заболявания. Проблемът се решава чрез добавяне на хранителна среда B104, която стимулира образуването на миелин-продуциращи клетки.

При култивиране на неврални прогениторни клетки от мозъка на човешки ембриони в среда, съдържаща EGF, основен FGF и LIF, броят на прекурсорните клетки от невралната линия се увеличава 10 милиона пъти. Клетките, размножени in vitro, запазват способността си да мигрират и да се диференцират в неврални и глиални елементи след трансплантация в мозъка на зрели плъхове. In vivo обаче броят на деленията на мултипотентните прекурсорни клетки е ограничен. Многократно е отбелязвано, че границата на Хейфлик за „възрастна“ неврална стволова клетка (около 50 митози) все още е недостижима дори в експеримент - клетките под формата на невросфери запазват свойствата си само 7 месеца и само след 8 пасажа. Смята се, че това се дължи на особеностите на методите им на дисперсия по време на пасиране (трипсинизация или механично действие), което рязко намалява пролиферативната активност на клетките поради нарушаване на междуклетъчните контакти. Всъщност, ако вместо дисперсия се използва методът на разделяне на невросферите на 4 части, жизнеспособността на клетките по време на пасиране се увеличава значително. Този метод позволява човешките неврални стволови клетки да се култивират в продължение на 300 дни. След този период обаче клетките губят митотична активност и претърпяват дегенерация или навлизат в етап на спонтанна диференциация с образуването на неврони и астроцити. На тази основа авторът смята, че 30 митози е максималният брой деления за култивираните невронни стволови клетки.

Когато човешките невронни стволови клетки се култивират in vitro, се образуват предимно GABAергични неврони. Без специални условия, невронните прогениторни клетки дават началото на допаминергични неврони (необходими за клетъчна терапия на болестта на Паркинсон) само в първите пасажи, след което всички неврони в културата се състоят изключително от GABAергични клетки. При гризачите IL-1 и IL-11, както и фрагменти от мембрани на нервни клетки, LIF и GDNF, причиняват индуцирането на допаминергични неврони in vitro. Този методологичен подход обаче се е доказал като неуспешен при хората. Въпреки това, когато GABAергичните неврони се трансплантират интрацеребрално in vivo, под влияние на фактори на микросредата, възникват нервни клетки с различни медиаторни фенотипове.

Търсенето на комбинации от невротрофични фактори показа, че FGF2 и IL-1 индуцират образуването на допаминергични невробласти, които обаче не са способни да произвеждат допаминергични неврони. Диференциацията на хипокампалните стволови клетки във възбуждащи глутаматергични и инхибиторни GABA-ергични неврони протича под влиянието на невротрофини, а EGF и IGF1 индуцират образуването на глутаматергични и GABA-ергични неврони от невронни прогениторни клетки на човешки ембриони. Последователното добавяне на ретиноева киселина и невротрофин 3 (NT3) към културата значително увеличава диференциацията на зрелите мозъчни хипокампални стволови клетки в неврони с различен медиаторен характер, докато комбинация от мозъчно-производен невротрофичен фактор (BNDF), NT3 и GDNF може да произведе пирамидални неврони в хипокампални и неокортикални култури.

По този начин, резултатите от многобройни изследвания показват, че, първо, стволовите клетки от различни мозъчни структури под влияние на локални специфични тъканни фактори са способни да се диференцират in vivo в невронни фенотипове, присъщи на тези структури. Второ, целенасочената индуцирана диференциация на невронни стволови клетки in vitro чрез клониране на прогениторни клетки прави възможно получаването на нервни и глиални клетки със специфични фенотипни характеристики за интрацеребрална трансплантация при различни форми на мозъчна патология.

Няма съмнение, че плурипотентните стволови клетки, изолирани от ембриони или от ЦНС на възрастни, могат да се разглеждат като източник на нови неврони и да се използват в клиниката за лечение на неврологична патология. Основната пречка пред развитието на практическата клетъчна невротрансплантация обаче е фактът, че повечето невронни стволови клетки не се диференцират в неврони след имплантиране в неневрогенни зони на зрялата ЦНС. За да се заобиколи тази пречка, е предложен много оригинален иновативен метод, който позволява in vitro получаване на чиста популация от неврони от човешки фетални невронни стволови клетки след трансплантация в ЦНС на зрял плъх. Авторите доказват, че диференциацията на клетките, имплантирани по този метод, завършва с образуването на неврони с холинергичен фенотип, което се дължи на влиянието на фактори от околната микросреда. Предложената технология представлява интерес от гледна точка на разработването на нови видове терапия, базирана на стволови клетки, и заместване на неврони, увредени поради травма или невродегенеративно заболяване, тъй като холинергичните неврони играят водеща роля в развитието на двигателните, паметовите и учебните функции. По-специално, холинергичните неврони, изолирани от човешки стволови клетки, могат да бъдат използвани за заместване на моторни неврони, загубени при амиотрофична латерална склероза или увреждания на гръбначния мозък. Понастоящем няма информация за методи за производство на значителен брой холинергични неврони от популация от митоген-преформирани стволови клетки. Авторите предлагат сравнително прост, но ефективен метод за стимулиране на митоген-преформирани първични човешки ембрионални невронни стволови клетки да се развият в практически чисти неврони след имплантиране както в неневрогенни, така и в неврогенни зони на ЦНС на зрял плъх. Най-важният резултат от тяхната работа е превръщането на достатъчно голям брой трансплантирани клетки в холинергични неврони, когато се имплантират в средната мембрана и гръбначния мозък.

Освен това, за предварителното формиране на невронни стволови клетки от 8-седмична човешка ембрионална мозъчна кора в холинергични неврони in vitro, се предлага използването на различни комбинации от следните трофични фактори и химични елементи: рекомбинантен основен FGF, EGF, LIF, миши амино-терминален звуков пептид (Shh-N), транс-ретиноева киселина, NGF, BDNF, NT3, NT4, естествен ламинин и миши хепарин. Оригиналната линия от човешки невронни стволови клетки (K048) е поддържана in vitro в продължение на две години и е издържала 85 пасажа без промени в пролиферативните и диференциращите свойства, като същевременно е запазила нормален диплоиден кариотип. Недиспергирани невросфери от пасажи 19–55 (седмици 38–52) са поставени върху поли-d-лизин и ламинин и след това са третирани с гореспоменатите фактори в различни концентрации, комбинации и последователности. Комбинацията от основен FGF, хепарин и ламинин (съкратено FHL) дава уникален ефект. След един ден култивиране на ембрионални невронни стволови клетки в FHL среда със или без Shh-N (комбинацията от Shh-N + FHL в съкращението SFHL), се наблюдава бърза пролиферация на големи планарни клетки. Всички други еднодневни протоколи (като основен FGF + ламинин), напротив, водят до ограничено радиално разпространение на вретеновидни клетки и тези клетки не напускат ядрото на невросферите. След 6 дни активиране и последващи 10 дни диференциация в среда, съдържаща B27, големи мултиполярни невроноподобни клетки са открити в края на FHL-активираните сфери. В други протоколни групи повечето невроноподобни клетки остават малки и биполярни или униполярни. Имуноцитохимичният анализ показва, че малките (< 20 μm) биполярни или униполярни клетки са или GABAергични, или глутаматергични, докато повечето големи мултиполярни клетки, локализирани в края на FHL-активираните невросфери, са холинергични, експресирайки маркери, характерни за холинергичните неврони (Islet-1 и ChAT). Някои от тези неврони едновременно експресират синапсин 1. В резултат на пет серии независими експерименти, авторите установяват, че общата популация от клетки в еднослойните зони се диференцира в TuJ1+ неврони с 45,5%, докато холинергичните (ChAT^) неврони съставляват само 27,8% от клетките на същата популация. След 10 дни допълнителна диференциация in vitro, освен холинергичните неврони, в FHL-активираните невросфери са открити значителен брой малки неврони - глутаматергични (6,3%), GABA-ергични (11,3%), както и астроцити (35,2%) и нестин-позитивни клетки (18,9%). При използване на други комбинации от растежни фактори, холинергичните неврони отсъстваха, а маргиналните клетки на невросферите образуваха или астроцити, или малки глутаматергични и GABA-ергични неврони. Мониторингът на резервните и активните потенциали, използвайки техниката на затягане на цели клетки, показа, че след седем дни активиране на FHL, повечето големи полиполярни клетки имат потенциал на покой от -29,0±2,0 mV при липса на акционен потенциал. След 2 седмици потенциалът на покой се увеличава до -63.6±3,0 mV, а акционни потенциали са наблюдавани в момента на индуциране на деполяризиращи токове и са блокирани от 1 M тетродотоксин, което показва функционалната активност на холинергичните незрели неврони.

Авторите допълнително установяват, че активирането на FHL или SFHL in vitro per se не води до образуване на зрели неврони и се опитват да установят дали предварително формираните FHL- или SFHL-стволови клетки са способни да се диференцират в холинергични неврони, когато са трансплантирани в ЦНС на зрели плъхове. За тази цел активираните клетки са инжектирани в неврогенната зона (хипокампус) и в няколко неневрогенни зони, включително префронталния кортекс, средната мембрана и гръбначния мозък на възрастни плъхове. Имплантираните клетки са проследени с помощта на CAO-^^p вектора. Известно е, че OCP маркира както клетъчната ултраструктура, така и клетъчните процеси (молекулярно ниво) без изтичане и може да бъде директно визуализиран. Освен това, OCP-маркираните невронни стволови клетки поддържат профил на невронна и глиална диференциация, идентичен с този на нетрансформираните стволови клетки на ембрионалния мозък.

Една до две седмици след имплантирането на 5 x 10⁴ ^{активирани} и белязани неврални стволови клетки, те са открити в гръбначния мозък или мозъка на плъхове, като OCD+ клетките са разположени главно близо до мястото на инжектиране. Процесите на миграция и интеграция са наблюдавани още един месец след трансплантацията. Границите на миграция варират в зависимост от мястото на инжектиране: при инжектиране в префронталния кортекс, OCD+ клетките са разположени на 0,4-2 mm от мястото на инжектиране, докато при имплантиране в средната мембрана, хипокампуса или гръбначния мозък, клетките мигрират на много по-големи разстояния - до 1-2 cm. Трансплантираните клетки са локализирани във високо организирани структури на ЦНС, включително фронталния кортекс, средната мембрана, хипокампуса и гръбначния мозък. OCD-белязаните невронни елементи са видими още през първата седмица след трансплантацията, като броят им значително се увеличава един месец след операцията. Стереологичният анализ показва по-висок процент на преживяемост на имплантираните клетки в различни структури на мозъка, в сравнение с гръбначния мозък.

Известно е, че в повечето тъкани на възрастния бозайников организъм е запазена популация от регионални стволови клетки, чиято трансформация в зрели клетки се регулира от специфични тъканни фактори. Пролиферацията на стволови клетки, диференциацията на прогениторни клетки и формирането на невронни фенотипове, специфични за дадена мозъчна структура in vivo, са изразени в много по-голяма степен в ембрионалния мозък, което се определя от наличието на високи концентрации на морфогенетични фактори на локалната микросреда - невротрофини BDNF, NGF, NT3, NT4/5 и растежни фактори FGF2, TGF-a, IGF1, GNDF, PDGF.

Къде се намират невронните стволови клетки?

Установено е, че невронните стволови клетки експресират глиален киселинен фибриларен протеин, който сред зрелите клетки от невронната линия се задържа само върху астроцитите. Следователно, астроцитните клетки може да са стволовият резерв в зрялата ЦНС. Всъщност, неврони, произхождащи от GFAP-позитивни прекурсори, са идентифицирани в обонятелните луковици и зъбната гируса, което противоречи на традиционните представи за прогениторната роля на радиалната глия, която не експресира GFAP в зъбната гируса в зряла възраст. Възможно е да има две популации от стволови клетки в ЦНС.

Въпросът за локализацията на стволовите клетки в субвентрикуларната зона също остава неясен. Според някои автори, епендималните клетки образуват сферични клонове в култура, които не са истински невросфери (като клонове на субепендимални клетки), тъй като са способни да се диференцират само в астроцити. От друга страна, след флуоресцентно или вирусно маркиране на епендимални клетки, маркерът се открива в клетките на субепендималния слой и обонятелните луковици. Такива маркирани клетки in vitro образуват невросфери и се диференцират в неврони, астроцити и олигодендроцити. Освен това е показано, че около 5% от клетките в епендимата експресират стволови маркери - нестин, Notch-1 и Mussashi-1. Предполага се, че механизмът на асиметричната митоза е свързан с неравномерното разпределение на мембранния рецептор Notch-1, в резултат на което последният остава върху мембраната на дъщерната клетка, локализирана в епендималната зона, докато майчината клетка, мигрираща към субепендималния слой, е лишена от този рецептор. От тази гледна точка, субепендималната зона може да се разглежда като колектор на прогениторни прекурсори на неврони и глия, образувани от стволови клетки на епендималния слой. Според други автори, в каудалните части на субвентрикуларната зона се образуват само глиални клетки, а източник на неврогенеза са клетките на рострално-латералната част. При третия вариант, на предната и задната част на субвентрикуларната зона на страничните вентрикули се придава еквивалентен неврогенен потенциал.

Четвъртият вариант на организация на стволовия резерв в централната нервна система изглежда за предпочитане, според който в субвентрикуларната зона се разграничават три основни типа неврални прогениторни клетки - А, В и С. А-клетките експресират ранни невронни маркери (PSA-NCAM, TuJl) и са заобиколени от В-клетки, които се идентифицират като астроцити чрез експресията на антигени. С-клетките, нямащи антигенни характеристики на неврони или глия, имат висока пролиферативна активност. Авторът убедително е доказал, че В-клетките са предшественици на А-клетки и de novo неврони на обонятелните луковици. По време на миграцията А-клетките са заобиколени от нишки от неврални прогениторни клетки, което се различава значително от механизма на миграция на постмитотичните невробласти по радиалната глия в ембрионалния мозък. Миграцията завършва в обонятелните луковици с митотично делене както на А, така и на В клетки, чиито производни се включват в гранулираните клетъчни слоеве и в гломерулния слой на обонятелната зона на мозъка.

Развиващият се ембрионален мозък няма диференцирани епендимални клетки, а вентрикуларните стени съдържат пролифериращи стволови клетки от вентрикуларните герминативни и субвентрикуларни зони, където мигрират първичните невро- и глиобласти. Въз основа на това някои автори смятат, че субепендималната област на зрелия мозък съдържа редуцирана ембрионална герминативна неврална тъкан, състояща се от астроцити, невробласти и неидентифицирани клетки. Истинските неврални стволови клетки съставляват по-малко от 1% от клетките в герминативната зона на латералната вентрикуларна стена. Отчасти поради тази причина, а също и във връзка с данните, че астроцитите от субепендималната зона са предшественици на невралните стволови клетки, не се изключва възможността за трансдиференциация на астроцитни глиални елементи с придобиване на невронни фенотипни характеристики.

Основната пречка пред окончателното решение на проблема с локализацията на невралните стволови клетки in vivo е липсата на специфични маркери за тези клетки. Въпреки това, много интересни от практическа гледна точка са съобщенията, че невралните стволови клетки са изолирани от региони на ЦНС, които не съдържат субепендимални зони - третата и четвъртата камера на предния мозък, гръбначния канал на гръдната и лумбалната област на гръбначния мозък. От особено значение е фактът, че увреждането на гръбначния мозък увеличава пролиферацията на епендимални стволови клетки на централния канал с образуването на прогениторни клетки, мигриращи и диференциращи се в астроцити на глиомезодермалния белег. Освен това, в неувредения гръбначен мозък на възрастни плъхове са открити и прекурсорни клетки на астро- и олигодендроцити.

По този начин, литературните данни убедително демонстрират наличието в ЦНС на възрастни бозайници, включително хора, на регионален стволов резерв, чийто регенеративно-пластичен капацитет, за съжаление, е способен да осигури само процесите на физиологична регенерация с образуването на нови невронни мрежи, но не отговаря на нуждите на репаративната регенерация. Това поставя задачата за търсене на възможности за увеличаване на стволовите ресурси на ЦНС по екзогенен път, което е нерешимо без ясно разбиране на механизмите на формиране на ЦНС в ембрионалния период.

Днес знаем, че по време на ембрионалното развитие, стволовите клетки на невралната тръба са източник на три клетъчни типа - неврони, астроцити и олигодендроцити, т.е. невроните и невроглията произхождат от една единствена клетка-предшественик. Диференциацията на ектодермата в клъстери от неврални прогениторни клетки започва под влиянието на продуктите на проневралните гени от семейството bHLH и се блокира от експресията на рецепторни трансмембранни протеинови производни на гените от семейството Notch, които ограничават детерминацията и ранната диференциация на невралните прекурсорни клетки. От своя страна, лигандите на Notch рецепторите са трансмембранните Delta протеини на съседните клетки, поради извънклетъчния домен на който се осъществяват директни междуклетъчни контакти с индуктивно взаимодействие между стволовите клетки.

По-нататъшното прилагане на програмата за ембрионална неврогенеза е не по-малко сложно и, изглежда, би трябвало да бъде видово специфично. Резултатите от изследванията на невроксенотрансплантацията обаче показват, че стволовите клетки имат изразен еволюционен консерватизъм, поради който човешките невронни стволови клетки са способни да мигрират и да се развиват, когато са трансплантирани в мозъка на плъх.

Известно е, че ЦНС на бозайниците има изключително нисък капацитет за репаративна регенерация, който се характеризира с липсата на каквито и да е признаци за поява на нови клетъчни елементи в зрелия мозък, които да заместят невроните, загинали в резултат на нараняване. В случай на трансплантация на невробласти обаче, последните не само се присаждат, пролиферират и диференцират, но и са способни да се интегрират в мозъчните структури и функционално да заместят загубените неврони. При трансплантация на ангажирани невронни прогениторни клетки терапевтичният ефект е значително по-слаб. Доказано е, че такива клетки имат нисък капацитет за миграция. Освен това, невронните прогениторни клетки не възпроизвеждат архитектурата на невронните мрежи и не са функционално интегрирани в мозъка на реципиента. В тази връзка активно се изучават въпросите на репаративно-пластичната регенерация по време на трансплантация на непреформирани мултипотентни невронни стволови клетки.

В изследването на М. Александрова и др. (2001), в първия вариант на експериментите, реципиентите са полово зрели женски плъхове, а донорите са 15-дневни ембриони. От реципиентите е отстранен участък от тилната кора на мозъка и в кухината е трансплантирана механично суспендирана тъкан от предполагаемата ембрионална кора, съдържаща мултипотентни стволови клетки от камерната и субвентрикуларната област. Във втория вариант на експериментите, неврални стволови клетки от 9-седмичен човешки ембрион са трансплантирани в мозъка на полово зрели плъхове. Авторите изолират парчета тъкан от перивентрикуларната област на ембрионалния мозък, поставят ги в хранителна среда F-12 и чрез многократно пипетиране получават клетъчна суспензия, след което ги култивират в специална NPBM среда с добавяне на растежни фактори - FGF, EGF и NGF. Клетките се култивират в суспензионна култура до образуване на невросфери, които се диспергират и отново се засаждат в културата. След 4 пасажа с общ период на култивиране от 12-16 дни, клетките са използвани за трансплантация. Реципиентите са били десетдневни малки плъхове и полово зрели двумесечни плъхове Wistar, на които са инжектирани 4 μl от суспензията от човешки неврални стволови клетки в латералния вентрикул на мозъка без имуносупресия. Резултатите от работата показват, че дисоциираните клетки от вентрикуларната и субвентрикуларната зона на ембрионалния анлаж на мозъчната кора на плъха продължават своето развитие по време на алотрансплантация в зрелия мозък, т.е. факторите на микросредата на диференцирания мозък на реципиента не блокират растежа и диференциацията на невралните стволови клетки на ембриона. В ранните етапи след трансплантацията мултипотентните клетки продължават митотичното си делене и активно мигрират от зоната на трансплантация към мозъчната тъкан на реципиента. Трансплантирани ембрионални клетки с огромен миграционен потенциал са открити в почти всички слоеве на мозъчната кора на реципиента по протежение на трансплантационния път и в бялото вещество. Дължината на миграционния тракт на нервните клетки винаги е била значително по-къса (до 680 μm) от тази на глиалните елементи (до 3 mm). Кръвоносните съдове и влакнестите структури на мозъка служат като структурни вектори за миграция на астроцити, което е отбелязано и в други изследвания.

Преди това се смяташе, че натрупването на белязани астроцити в областта на увреждане на мозъчната кора на реципиента може да е свързано с образуването на глиална бариера между тъканите на трансплантата и реципиента. Изследване на структурата на компактно разположени клетъчни трансплантати обаче показа, че тяхната цитоархитектура се характеризира с хаос, без никакво слоесто разпределение на трансплантираните клетки. Степента на подреденост на трансплантираните неврони се доближава до тази на нормалните клетки на мозъчната кора само при липса на глиална бариера между тъканите на донора и реципиента. В противен случай структурата на трансплантираните клетки е атипична, а самите неврони са подложени на хипертрофия. Чрез невроимунохимично типизиране на трансплантирани клетки са открити инхибиторни GABA-ергични неврони в трансплантатите и е открита експресия на PARV, CALB и NPY протеини. Следователно, зрелият мозък запазва фактори на микросредата, способни да поддържат пролиферацията, миграцията и специфичната диференциация на невронните мултипотентни клетки.

В културата на човешки стволови клетки, изолирани от перивентрикуларната област на мозъка на 9-седмични ембриони, М. Александрова и др. (2001) откриват голям брой нестин-позитивни мултипотентни клетки в четвъртия пасаж, някои от които вече са претърпели in vitro диференциация и се развиват според невроналния тип, което съответства на резултатите от изследвания на други автори. След трансплантация в мозъка на възрастни плъхове, култивираните човешки стволови клетки митотично се делят и мигрират в тъканта на ксеногенния мозък на реципиента. При клетъчните трансплантации авторите наблюдават две популации от клетки - малки и по-големи. Последните мигрират както в паренхима, така и по влакнестите структури на мозъка на реципиента на незначителни разстояния - в рамките на 300 μm. Най-голямата дължина на миграционния път (до 3 mm) е характерна за малки клетки, някои от които се диференцират в астроцити, което е установено с помощта на моноклонални антитела към GFAP. И двата клетъчни типа са открити в стената на латералния вентрикул, което показва, че трансплантираните клетки са навлезли в ростралния миграционен тракт. Астроцитните производни на невралните стволови клетки както от хора, така и от плъхове мигрират предимно през кръвоносните капиляри и влакнестите структури на мозъка на реципиента, което съвпада с данните на други автори.

Анализът на диференциацията на човешки стволови клетки in vivo с помощта на моноклонални антитела към GFAP, CALB и VIM разкри образуването както на астроцити, така и на неврони. За разлика от клетките в трансплантации на плъхове, много човешки стволови клетки бяха виментин-позитивни. Следователно, някои от човешките мултипотентни клетки не претърпяха диференциация. Същите автори впоследствие показаха, че човешки неврални стволови клетки, трансплантирани без имуносупресия, оцеляват в мозъка на плъхове в продължение на 20 дни след трансплантацията, без признаци на имунна агресия от глиалните елементи на зрелия мозък.

Установено е, че дори невронните стволови клетки на Drosophila се присаждат и претърпяват диференциация в мозъка на таксон, толкова отдалечен от насекомите, колкото плъхът. Коректността на експеримента на авторите е без съмнение: трансгенните линии на Drosophila съдържат гени за човешки невротрофични фактори NGF, GDNF, BDNF, вмъкнати във вектора CaSper под промотора на топлинния шок на Drosophila, така че телесната температура на бозайниците автоматично предизвиква тяхната експресия. Авторите идентифицират клетките на Drosophila по продукта на бактериалния ген за галактозидаза, използвайки хистохимично X-Gal оцветяване. Освен това се оказа, че невронните стволови клетки на Drosophila реагират специфично на невротрофични фактори, кодирани от човешки гени: при ксенотрансплантация на клетки от трансгенна линия на Drosophila, съдържаща гена gdnf, синтезът на тирозин хидроксилаза в нейните диференциращи се невронни стволови клетки се увеличава рязко и клетките с гена ngf активно произвеждат ацетилхолинестераза. Ксенотрансплантацията индуцира подобни генно-зависими реакции в алотрансплантата на ембрионална невронна тъкан, трансплантирана заедно с нея.

Означава ли това, че специфичната диференциация на невронните стволови клетки се индуцира от видово неспецифични невротрофични фактори? Според резултатите на авторите, продуциращите ксенотрансплантати невротрофични фактори имат специфичен ефект върху съдбата на алографтите, които в този случай се развиват по-интензивно и са 2-3 пъти по-големи по размер от алографтите, въведени в мозъка без добавяне на ксенотрансплантати. Следователно, ксенотрансплантатните клетки, съдържащи невротрофинови гени, по-специално генът, кодиращ човешкия глиален клетъчен невротрофичен фактор (GDNF), имат видово неспецифичен ефект върху развитието на алографта, подобен на действието на съответния невротрофин. Известно е, че GDNF увеличава оцеляването на допаминергичните неврони в средния мозък на ембриона на плъх и усилва метаболизма на допамина от тези клетки, както и индуцира диференциацията на тирозин хидроксилаза-позитивни клетки, като усилва растежа на аксоните и увеличава размера на тялото на невронните клетки. Подобни ефекти се наблюдават и в култивирани допаминергични неврони на средния мозък на плъх.

Активна миграция на човешки неврални стволови клетки се наблюдава след ксенотрансплантация в мозъка на зрели плъхове. Известно е, че процесът на миграция и диференциация на невралните стволови клетки се контролира от набор от специални гени. Иницииращият миграционен сигнал към клетката-прекурсор за започване на диференциация се дава от протеиновия продукт на c-ret протоонкогена заедно с GDNF. Следващият сигнал идва от гена mash-1, който контролира избора на пътя на клетъчно развитие. Освен това, специфичната реакция на диференциращите се клетки зависи и от α-рецептора на цилиарния невротрофичен фактор. По този начин, предвид напълно различната генетична конституция на ксеногенните човешки неврални стволови клетки и мозъчните клетки на реципиентния плъх, е необходимо да се признае не само видовата неспецифичност на невротрофичните фактори, но и най-високият еволюционен консерватизъм на гените, отговорни за специфичната диференциация на невралните стволови елементи.

Бъдещето ще покаже дали ксенотрансплантацията на ембрионален невроматериал ще бъде възможна в неврохирургичната практика за лечение на невродегенеративни патологични процеси, причинени от нарушаване на синтеза на миелин от олигодендроцити. Междувременно, най-интензивно разглежданите въпроси на невротрансплантацията са тези, свързани с получаването на алогенни невронни стволови клетки от ембрионален или зрял мозък в култура с последващата им насочена диференциация в невробласти или специализирани неврони.

Трансплантация на неврални стволови клетки

За стимулиране на пролиферацията и диференциацията на невронните стволови клетки на възрастен организъм може да се трансплантира ембрионална нервна тъкан. Възможно е стволовите клетки на ембрионалната нервна тъкан, донесени с алографта, сами да претърпят пролиферация и диференциация. Известно е, че след травма на гръбначния стълб регенерацията на нервните проводници протича чрез удължаване на увредените аксони и колатерално поникване на аксони на неувредени израстъци на моторни неврони. Основните фактори, които възпрепятстват регенерацията на гръбначния мозък, са образуването на белег от съединителната тъкан в областта на увреждането, дистрофичните и дегенеративните промени в централните неврони, дефицитът на NGF и наличието на продукти от разпадането на миелина в областта на увреждането. Доказано е, че трансплантацията на различни клетъчни типове в увредения гръбначен мозък - фрагменти от седалищния нерв на възрастни животни, ембрионална окципитална кора, хипокампус, гръбначен мозък, Schwann клетки, астроцити, микроглия, макрофаги, фибробласти - насърчава регенерацията на увредените аксони чрез поникване и позволява на новообразуваните аксони да растат през зоната на увреждане на гръбначния мозък. Експериментално е доказано, че трансплантацията на ембрионална нервна тъкан в областта на увреждането на гръбначния мозък, чрез действието на невротрофични фактори, ускорява растежа на увредените аксони, предотвратява образуването на глиален белег и развитието на дистрофични и дегенеративни процеси в централните неврони, докато клетките на трансплантираната ембрионална нервна тъкан оцеляват в гръбначния мозък, интегрират се със съседните тъкани и насърчават растежа на аксоните през зоната на увреждане с образуването на дендритни синапси върху гръбначните неврони.

Тази област на регенеративно-пластичната медицина получи най-голямо развитие в Украйна благодарение на работата на научния екип, ръководен от В. И. Цимбалюк. На първо място, това са експериментални изследвания на ефективността на трансплантацията на ембрионална нервна тъкан при травми на гръбначния мозък. По време на автотрансплантация на периферния нерв авторите наблюдават най-изразени деструктивни промени в дисталната зона на шева, където на 30-ия ден след операцията те са комбинирани с репаративни процеси. По време на алотрансплантация морфофункционалното състояние на имплантирания нерв на 30-ия ден се характеризира с изразена деструкция с мастна дегенерация и амилоидоза на фона на фокална възпалителна лимфоидно-клетъчна инфилтрация с преобладаваща атрофия на Schwann-клетките. Трансплантацията на ембрионална нервна тъкан допринесе в по-голяма степен за възстановяване на проводимостта на гръбначния мозък, особено при животни, претърпели операция през първите 24 часа след нараняването: на фона на намаляване на интензивността на възпалителните и деструктивните процеси, хипертрофия и хиперплазия на протеин-синтезиращите и енергопроизводящите ултраструктурни елементи на гръбначните неврони, се наблюдава хипертрофия и хиперплазия на олигодендроцитите, амплитудата на мускулния акционен потенциал се възстанови с 50%, а скоростта на провеждане на импулса с 90%. При оценка на ефективността на трансплантацията на ембрионална нервна тъкан в зависимост от зоната на трансплантация е установено, че най-добри резултати се наблюдават, когато присадката е въведена директно в зоната на увреждане на гръбначния мозък. При пълно пресичане на гръбначния мозък трансплантацията на ембрионална нервна тъкан е неефективна. Динамичните изследвания показват, че оптималното време за извършване на трансплантация на ембрионална нервна тъкан е първите 24 часа след увреждане на гръбначния мозък, докато извършването на операция в периода на изразени вторични исхемично-възпалителни промени, които настъпват на 2-9-ия ден след нараняването, трябва да се счита за неподходящо.

Известно е, че тежката травматична мозъчна травма провокира мощно и продължително активиране на липидната пероксидация в началните и междинните етапи на посттравматичния период както в увредената мозъчна тъкан, така и в организма като цяло, а също така нарушава процесите на енергиен метаболизъм в увредения мозък. При тези условия трансплантацията на ембрионална нервна тъкан в областта на травматичното увреждане насърчава стабилизирането на процесите на липидна пероксидация и повишава потенциала на антиоксидантната система на мозъка и организма като цяло, засилва неговата антирадикалова защита на 35-60-ия ден от посттравматичния период. В същия период след трансплантация на ембрионална нервна тъкан, енергийният метаболизъм и процесите на окислително фосфорилиране в мозъка се нормализират. Освен това е доказано, че на първия ден след експериментална травматична мозъчна травма импедансът на тъканта на увреденото полукълбо намалява с 30-37%, на контралатералното - с 20%, което показва развитие на генерализиран мозъчен оток. При животни, претърпели трансплантация на ембрионална нервна тъкан, инволюцията на отока настъпи значително по-бързо - още на седмия ден средната стойност на импеданса на тъканите на увреденото полукълбо достигна 97,8% от контролното ниво. Освен това, пълно възстановяване на стойностите на импеданса на 30-ия ден е отбелязано само при животни, получили трансплантация на ембрионална нервна тъкан.

Смъртта на някои неврони в мозъка след тежка черепно-мозъчна травма е една от основните причини за посттравматични усложнения. Невроните на интегриращите допаминергични и норадренергични системи на средния мозък и продълговатия мозък са особено чувствителни към нараняване. Намаляването на нивото на допамин в стриопалидалния комплекс и мозъчната кора значително увеличава риска от развитие на двигателни нарушения и психични разстройства, епилептиформни състояния, а намаляването на производството на допамин в хипоталамуса може да бъде причина за множество вегетативни и соматични нарушения, наблюдавани в късния посттравматичен период. Резултатите от проучвания, проведени при експериментална черепно-мозъчна травма, показват, че трансплантацията на ембрионална нервна тъкан спомага за възстановяване на нивата на допамин в увреденото мозъчно полукълбо, допамин и норепинефрин в хипоталамуса и повишава нивата на норепинефрин и допамин в средния мозък и продълговатия мозък. Освен това, в резултат на трансплантация на ембрионална нервна тъкан в увреденото полукълбо на мозъка на опитни животни, процентното съотношение на фосфолипидите се нормализира и съдържанието на мастни киселини се увеличава (C16:0, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 + C18:2, C20:3 + C20:4, C20:5).

Тези данни потвърждават стимулирането на регенеративно-пластичните процеси от трансплантираната ембрионална нервна тъкан и показват репаративно-трофичния ефект на трансплантата върху мозъка на реципиента като цяло.

Клиничният опит на персонала на Института по неврохирургия „А. П. Ромоданов“ към Академията на медицинските науки на Украйна при трансплантация на ембрионална нервна тъкан при церебрална парализа, изключително сложна патология с тежка двигателна дисфункция, заслужава специално внимание. Клиничните форми на церебрална парализа зависят от нивото на увреждане на интегралните структури, отговорни за регулирането на мускулния тонус и формирането на двигателни стереотипи. В момента има достатъчно доказателства в подкрепа на факта, че патологичните промени в стриопалидално-таламокортикалната система за двигателен контрол играят важна роля в нарушенията на двигателната функция и мускулния тонус. Стриопалидалната връзка на тази система осъществява контролната функция чрез нигростриатално производство на допамин. Директният път за осъществяване на таламокортикален контрол започва от невроните на путамена, медиира се от гама-аминомаслена киселина (GABA) и субстанция P и се проектира директно в двигателната зона на вътрешния сегмент на глобус паллидус и черната субстанция. Индиректният път, чийто ефект се реализира с участието на GABA и енкефалин, произхожда от невроните на путамена и засяга ядрата на базалните ганглии чрез поредица от връзки, включващи външния сегмент на globus pallidus и субталамичното ядро. Нарушенията в проводимостта на директния път причиняват хипокинезия, докато намаляването на проводимостта на структурите на индиректния път води до хиперкинезия със съответните промени в мускулния тонус. Целостта на GABAергичните проводими пътища на различни нива в системата за двигателен контрол и интеграцията на допаминергичните връзки на ниво путамен са от съществено значение за регулирането на таламокортикалните взаимодействия. Най-честата проява на двигателната патология при различни форми на церебрална парализа е нарушение на мускулния тонус и тясно свързана промяна в рефлекторната мускулна активност.

Трансплантацията на ембрионална нервна тъкан при церебрална парализа изисква задълбочен анализ на естеството на увреждането на мозъчните структури. Въз основа на определянето на нивата на допамин и GABA в субарахноидалната цереброспинална течност, авторите детайлизират нивото на нарушаване на интеграцията на функционалните мозъчни структури, което прави възможно обективизирането на резултатите от хирургичната интервенция и коригирането на повторни невротрансплантации. Ембрионална нервна тъкан (абортен материал на 9-седмичен ембрион) е трансплантирана в паренхима на кората на прецентралните извивки на мозъчните полукълба в зависимост от тежестта на атрофичните промени. Не са наблюдавани усложнения или влошаване на състоянието на пациентите в следоперативния период. Положителна динамика е отбелязана при 63% от пациентите със спастични форми, при 82% от децата с атонично-естетична форма и само при 24% от пациентите със смесена форма на заболяването. Установен е отрицателен ефект на високо ниво на невросенсибилизация с наличието на автоантитела към невроспецифични протеини върху резултатите от операцията. Трансплантацията на ембрионална нервна тъкан се оказва неефективна при пациенти на възраст 8-10 и повече години, както и в случаи на тежък хиперкинетичен синдром и епилепсия. Клинично ефективността на трансплантацията на ембрионална нервна тъкан при пациенти със спастични форми на церебрална парализа се проявява чрез формиране на нови статомоторни умения и волеви движения с корекция на патологичния двигателен стереотип и намаляване на степента на спастичност, патологични пози и нагласи. Авторите смятат, че положителният ефект от трансплантацията на ембрионална нервна тъкан е резултат от нормализиращия ефект върху функционалната активност на супраспиналните структури, участващи в регулирането на постуралния тонус и волевите движения. В същото време положителните клинични ефекти от трансплантацията на ембрионална нервна тъкан са съпроводени с намаляване на съдържанието на невротрансмитери в субарахноидалната цереброспинална течност, което показва възстановяване на интегралните взаимодействия на засегнатите мозъчни структури.

Съществува и друга тежка форма на неврологична патология - апаличен синдром, чийто проблем с лечението, за съжаление, далеч не е решен. Апаличният синдром е полиетиологично субакутно или хронично състояние, което възниква в резултат на тежки органични лезии на централната нервна система (главно на мозъчната кора) и се характеризира с развитие на панапраксия и панагнозия с относително запазена функция на сегментно-стволовите отдели и формациите на лимбично-ретикуларния комплекс на мозъка. Последващите проучвания (от 1 година до 3 години) показват, че апаличният синдром не е окончателна диагноза за персистиращо увреждане на нервната система при деца, а се трансформира или в органична деменция, или в хронично вегетативно състояние. В отделението по възстановителна неврохирургия на Института по неврохирургия „А. П. Ромоданов“ към Академията на медицинските науки на Украйна, 21 пациенти с последствия от апаличен синдром са претърпели трансплантация на ембрионална нервна тъкан. Под обща анестезия, с коронен борер е направен отвор върху зоната на най-изразените атрофични промени, разкрити чрез компютърна томография или магнитен резонанс, а при наличие на дифузна атрофия на сивото или бялото вещество, трансплантатът е въведен в прецентралните и централните гири на мозъка. След отваряне на твърдата мозъчна обвивка (dura mater), парчета тъкан от сензомоторната кора на 8-9-седмични ембриони са имплантирани интракортикално с помощта на специално устройство. Броят на имплантираните тъканни проби варира от 4 до 10, което се определя от размера на отвора и размера на локалните промени в мозъчното вещество. За разлика от други видове патология, при апалния синдром авторите се стремят да имплантират възможно най-много ембрионална тъкан в най-достъпните области на мозъка. Твърдата мозъчна обвивка е зашита и е извършена пластична операция на дефекта на черепа. По време на операцията всички пациенти показаха значителни промени както в кората (атрофия, липса на извивки, промяна в цвета и пулсацията на мозъчното вещество), така и в менингите (удебеляване на твърдата мозъчна обвивка, значително удебеляване на арахноидалната мембрана с наличие на собствени кръвоносни съдове, сливане на мембраните с подлежащото мозъчно вещество). Тези промени бяха по-изразени при пациенти с анамнеза за възпалителни мозъчни лезии. При пациенти, претърпели хипоксия на ЦНС, преобладаваха дифузни атрофични промени в мозъчното вещество, особено в кората, с увеличаване на субарахноидалното пространство, без значителни промени в менингите. Половината от пациентите имаха повишено кървене на меки тъкани, кости и мозъчно вещество. След операциите, в рамките на шест месеца до три години, състоянието се подобри при 16 пациенти и остана непроменено при петима. Наблюдавана е положителна динамика както в двигателната, така и в психическата сфера. Мускулният тонус намаля при десет пациенти, при 11 пациенти двигателната активност се увеличи (намали парезите,(координацията на движенията се подобри), при пет деца манипулативната способност на горните крайници се увеличи значително. При четирима пациенти честотата и тежестта на епилептичните припадъци намаляха, а при едно дете изобщо не се наблюдаваха припадъци през целия период на наблюдение след операцията. Агресията намаля при две деца, при двама пациенти с тежки булбарни нарушения се подобри актът на преглъщане, две деца успяха да дъвчат самостоятелно още 2 седмици след операцията. Наблюдава се намаляване на тежестта на психичните разстройства, девет деца станаха по-спокойни след операцията, сънят и вниманието се подобриха при седем пациенти. Трима пациенти с последствия от апаличен синдром започнаха да разпознават родителите си, един - да следва инструкции, двама - да произнасят думи, при три степента на дизартрия намаля. Авторите отбелязват, че забележимо подобрение в състоянието на пациентите започва 2 месеца след операцията, достига максимум до 5-6 месеца, след което темпът на подобрение се забавя и до края на годината процесът се стабилизира при 50% от пациентите. Положителният ефект от невротрансплантацията послужи като основа за повторна операция при шестима пациенти с последствия от апаличен синдром, но на другото полукълбо на мозъка. Техниката и методите на втората трансплантация бяха идентични с тези при първата операция, но клиничният ефект от втората операция беше по-нисък, въпреки че не възникнаха сериозни усложнения нито след първата, нито след втората хирургична интервенция. Според авторите, механизмът на терапевтичния ефект на невротрансплантацията е свързан с невротрофичния ефект на трансплантираната ембрионална нервна тъкан, която съдържа голям брой растежни, хормонални и други биологично активни вещества, стимулиращи репарацията на увредените неврони и пластичната реорганизация на мозъчната тъкан на реципиента. Възможен е и активиращ ефект върху активността на нервните клетки, които преди това са били морфологично запазени, но са загубили функционалната си активност поради заболяването. Именно бързият невротрофичен ефект може да обясни подобряването на булбарните функции при някои деца още в края на първата или втората седмица след операцията. Предполага се, че освен това, до третия или четвъртия месец се установяват морфофункционални връзки между трансплантата и мозъка на гостоприемника, чрез които невротрансплантантът замества функциите на мъртвите мозъчни клетки, което е субстрат за подобряване както на двигателните, така и на психическите функции на пациентите. Две деца са били в състояние да дъвчат самостоятелно още 2 седмици след операцията. Наблюдава се намаляване на тежестта на психичните разстройства, девет деца стават по-спокойни след операцията, сънят и вниманието се подобряват при седем пациенти. Трима пациенти с последствия от апалния синдром започват да разпознават родителите си, един - да следва инструкции, двама - да произнасят думи.При трима степента на дизартрия е намаляла. Авторите отбелязват, че забележимо подобрение в състоянието на пациентите започва 2 месеца след операцията, достига максимум до 5-6 месеца, след което темпът на подобрение се забавя и до края на годината процесът се стабилизира при 50% от пациентите. Положителният ефект от невротрансплантацията е послужил като основа за повторна операция при шестима пациенти с последствия от апаличен синдром, но на другото полукълбо на мозъка. Техниката и методът на втората трансплантация са идентични с тези при първата операция, но клиничният ефект от втората операция е по-нисък, въпреки че не е имало сериозни усложнения нито след първата, нито след втората хирургична интервенция. Според авторите, механизмът на терапевтичния ефект на невротрансплантацията е свързан с невротрофичния ефект на трансплантираната ембрионална нервна тъкан, която съдържа голям брой растежни, хормонални и други биологично активни вещества, стимулиращи репарацията на увредените неврони и пластичната реорганизация на мозъчната тъкан на реципиента. Възможен е и активиращ ефект върху активността на нервните клетки, които преди това са били морфологично запазени, но са загубили функционалната си активност поради заболяването. Именно бързият невротрофичен ефект може да обясни подобряването на булбарните функции при някои деца още в края на първата или втората седмица след операцията. Предполага се, че заедно с това, до третия или четвъртия месец се установяват морфофункционални връзки между трансплантата и мозъка на гостоприемника, чрез които невротрансплантацията замества функциите на мъртвите мозъчни клетки, което е субстрат за подобряване както на двигателните, така и на психическите функции на пациентите. Две деца са били в състояние да дъвчат самостоятелно още 2 седмици след операцията. Наблюдава се намаляване на тежестта на психичните разстройства, девет деца стават по-спокойни след операцията, сънят и вниманието се подобряват при седем пациенти. Трима пациенти с последствия от апалния синдром започват да разпознават родителите си, един - да следва инструкции, двама - да произнасят думи, при трима степента на дизартрия намалява. Авторите отбелязват, че забележимо подобрение в състоянието на пациентите започва 2 месеца след операцията, достига максимум до 5-6 месеца, след което темпът на подобрение се забавя и до края на годината процесът се стабилизира при 50% от пациентите. Положителният ефект от невротрансплантацията послужи като основа за повторна операция при шест пациенти с последствия от апаличен синдром, но на другото полукълбо на мозъка. Техниката и методът на втората трансплантация бяха идентични с тези при първата операция, но клиничният ефект от втората операция беше по-нисък, въпреки че не се наблюдаваха сериозни усложнения нито след първата, нито след втората хирургична интервенция. Според авторите,Механизмът на терапевтичния ефект на невротрансплантацията е свързан с невротрофичния ефект на трансплантираната ембрионална нервна тъкан, която съдържа голям брой растежни, хормонални и други биологично активни вещества, стимулиращи възстановяването на увредените неврони и пластичната реорганизация на мозъчната тъкан на реципиента. Възможен е и активиращ ефект върху активността на нервните клетки, които преди това са били морфологично запазени, но са загубили функционалната си активност поради заболяването. Именно бързият невротрофичен ефект може да обясни подобряването на булбарните функции при някои деца още в края на първата или втората седмица след операцията. Предполага се, че наред с това, до третия или четвъртия месец се установяват морфофункционални връзки между трансплантата и мозъка на гостоприемника, чрез които невротрансплантацията замества функциите на мъртвите мозъчни клетки, което е субстрат за подобряване както на двигателните, така и на психическите функции на пациентите, въпреки че не са възникнали сериозни усложнения нито след първата, нито след втората хирургична интервенция. Според авторите, механизмът на терапевтичния ефект на невротрансплантацията е свързан с невротрофичния ефект на трансплантираната ембрионална нервна тъкан, която съдържа голям брой растежни, хормонални и други биологично активни вещества, стимулиращи възстановяването на увредените неврони и пластичната реорганизация на мозъчната тъкан на реципиента. Възможен е и активиращ ефект върху активността на нервните клетки, които преди това са били морфологично запазени, но са загубили функционалната си активност поради заболяването. Именно бързият невротрофичен ефект може да обясни подобряването на булбарните функции при някои деца още в края на първата или втората седмица след операцията. Предполага се, че наред с това, до третия или четвъртия месец се установяват морфофункционални връзки между трансплантата и мозъка на гостоприемника, чрез които невротрансплантацията замества функциите на мъртвите мозъчни клетки, което е субстрат за подобряване както на двигателните, така и на психическите функции на пациентите, въпреки че не са възникнали сериозни усложнения нито след първата, нито след втората хирургична интервенция. Според авторите, механизмът на терапевтичния ефект на невротрансплантацията е свързан с невротрофичния ефект на трансплантираната ембрионална нервна тъкан, която съдържа голям брой растежни, хормонални и други биологично активни вещества, стимулиращи репарацията на увредените неврони и пластичната реорганизация на мозъчната тъкан на реципиента. Възможен е и активиращ ефект върху активността на нервните клетки, които преди това са били морфологично запазени, но са загубили функционалната си активност поради заболяването.Именно бързият невротрофичен ефект може да обясни подобряването на булбарните функции при някои деца още в края на първата или втората седмица след операцията. Предполага се, че наред с това, до третия или четвъртия месец, се установяват морфофункционални връзки между трансплантата и мозъка на гостоприемника, чрез които невротрансплантацията замества функциите на мъртвите мозъчни клетки, което е субстрат за подобряване както на двигателните, така и на психичните функции на пациентите.

Експериментално е изследван ефектът от трансплантацията на ембрионална нервна тъкан върху реорганизацията на междуневронните взаимовръзки. Авторите са изследвали моделите на възстановяване на междумодулните аксонални връзки в областта на механичното увреждане на мозъчната кора при бели плъхове със и без трансплантация на ембрионална нервна тъкан, използвайки флуоресцентния липофилен маркер DIL (1,1-диоктадецил-3,3,33'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат) и конфокално лазерно сканиране. Установено е, че въвеждането на ембрионална нервна тъкан в зоната на увреждане осигурява растежа на аксони, които след преминаване през трансплантата се свързват със съседната мозъчна тъкан, докато без трансплантация на ембрионална нервна тъкан зоната на увреждане е непреодолима пречка за растящите аксони. В тази работа е извършена трансплантация на ембрионален (15-17-ти ден от бременността) неокортекс. Получените от авторите резултати са допълнително доказателство в полза на активното влияние на трансплантацията на ембрионална нервна тъкан върху посттравматичната реорганизация на междуневронните взаимоотношения на съседни структурни и функционални модули на мозъчната кора. Трансплантацията на ембрионална нервна тъкан осигурява частично възстановяване на връзките между увредените области на мозъчната кора, като създава благоприятни условия за растеж на аксони в зоната на действие на невротрофичните фактори на трансплантата. Съществуването на такъв ефект е доказано експериментално и се обсъжда в литературата като доказателство за високи пластични възможности на увредения мозък на полово зрели животни. В тази връзка, клетъчната трансплантация понастоящем се разглежда като оптимална терапевтична стратегия за възстановяване на функцията на увредената човешка ЦНС.

Данните, получени от авторите, относно ефективността на използването на ембрионална нервна тъкан на мозъка като екзогенна трансплантационна среда за растеж на аксони, потвърждават перспективите за целенасочено създаване на комуникационни връзки между непокътнати съседни области на мозъка. Работата по изучаване на ефекта от трансплантацията на нервна тъкан върху динамиката на функционалните параметри на централната нервна система изглежда актуална. Задачата на работата беше да се изследва ефектът от трансплантацията на ембрионалния locus coeruleus (LC) върху морфофункционалните показатели на LC невроните и двигателната активност на реципиентите. Реципиентите бяха женски плъхове Wistar, а донорите - 18-дневни ембриони на плъхове от същата линия. Трансплантацията на ембрионална LC беше извършена в кухината на третата камера на мозъка. Хистологично, присаждането на присадката е установено при 75% от реципиентните животни. В случаите на присаждане, присадката е била в съседство със стената на камерата, запълвайки 1/5-2/5 от нейния лумен, и е била жизнеспособна. На 1 и 6 месеца след операцията, трансплантираната нервна тъкан, според своите морфологични характеристики, представлява структури, които биха възникнали по време на нормалното им онтогенетично развитие, т.е. КТ структури. Данните, получени от авторите, показват, че при животни, на които е трансплантиран ембрионалният КТ зачатък, динамичната активност се променя и матриксната активност на хроматина в ядрата на КТ клетките се увеличава. Следователно, активността на невроните на собствената КТ се засилва, но и присаденият трансплантат е функционално активен. Известно е, че така наречената локомоторна област на средния мозък практически съвпада с локализацията на КТ. Авторите смятат, че основата за промяната в двигателната активност на реципиентните плъхове е активирането на КТ клетки, както собствени, така и на трансплантираните, с освобождаване на голямо количество норепинефрин, включително в сегментите на гръбначния мозък. По този начин се предполага, че повишаването на двигателната активност при условия на трансплантация на КТ в непокътнатия мозък на животни се дължи на наличието на функционално активен трансплантат, интегриран с мозъка на реципиента и допринасящ за активирането на двигателната активност при плъхове.

Освен това беше показано, че трансплантираните невроепителни клетки от ембрионалните рудименти на неокортекса и гръбначния мозък оцеляват и се диференцират в невробласти, млади и зрели неврони в рамките на 1-2 месеца след трансплантацията им в увредения седалищен нерв на зрели плъхове. При изследване на динамиката на развитието на NADPH-позитивни неврони от ембрионалните рудименти на неокортекса и гръбначния мозък на плъхове в хетеротопни алографти (15-дневен ембрион на плъх), при надлъжни срезове през седалищните нерви на реципиентните плъхове е установено присаждане на 70 до 80% от неврографтите, което зависи от периода на наблюдение. Една седмица след операцията в присадките започват да се образуват уни- и биполярни невробласти със заоблени светли ядра и едно или две ядърца, което е съпроводено с образуването на клъстери. Авторите не успяват да открият клетки, съдържащи NADPH диафораза (NADPH-d) сред невробластите. След 7 дни само клетъчните елементи на кръвоносните съдове бяха NADPH-позитивни - капилярни ендотелни клетки в дебелината на трансплантата, както и ендотелни и гладкомускулни клетки на съдовете на седалищния нерв на реципиента. Тъй като в гладкомускулните клетки на съдовете индуцирането на NO синтаза (NOS) протича под влиянието на IL-1, авторите свързват появата на NADPH-позитивни гладкомускулни клетки в кръвоносните съдове на седалищния нерв с наличието на IL-1, синтезиран в увредени нервни стволове. Известно е, че неврогенезата при условия на трансплантация на ембрионални мозъчни рудименти протича синхронно с развитието на неврони in situ. Резултатите от морфологичните изследвания показват, че диференциацията на някои невронни елементи на трансплантатите седем дни след трансплантацията съответства на диференциацията на клетки в подобни части на мозъка на новородени плъхове. По този начин, при условия на хетеротопна трансплантация в периферния нерв, трансплантираните ембрионални нервни клетки проявяват способността да синтезират NADPH-d. В този случай, повече неврони, съдържащи NADPH-d, се откриват в трансплантации на гръбначен мозък, отколкото в трансплантации на неокортекс, но синтезът на азотен оксид започва в трансплантираните неврони по-късно, отколкото по време на развитието in situ. В ЦНС на гръбначните животни NOS-позитивните клетки се появяват още в пренаталния период. Смята се, че NO насърчава образуването на синаптични връзки в развиващия се мозък, а наличието на NOS-позитивни нервни аферентни влакна, които осигуряват синтез на NO в церебеларните невробласти, стимулира миграцията и диференциацията на невроните, поради което се формира нормална мозъчна цитоархитектура. В тектума е установена важна роля на NO в синапсогенезата - само онези неврони, които са имали синаптични връзки с клетки на ретината, се оказват NOS-позитивни.

Известно е, че азотният оксид е един от регулаторите на мозъчната активност, където се образува от аргинин под въздействието на NO синтазата, която притежава диафоразна активност. В централната нервна система NO се синтезира в ендотелни клетки на кръвоносни съдове, микроглия, астроцити и неврони на различни части на мозъка. След травматично мозъчно увреждане, както и по време на хипоксия и исхемия, се наблюдава увеличение на броя на невроните, съдържащи NO, който е един от регулаторите на мозъчния кръвоток. Предвид способността на NO да индуцира синапсогенеза, изучаването на образуването на NO-съдържащи клетки в условия на невротрансплантация на фона на травматично увреждане на нервната тъкан на реципиента е от особен интерес.

Не по-малко важно е изследването на ефекта на невротрансплантацията върху условно-рефлекторния стереотип на поведение. В експерименти по изследване на ефекта на интрацеребрална и дистантна (между CII и CIII) трансплантация на ембрионална тъкан от locus coeruleus (17-19 ден от бременността) върху процесите на паметта и съдържанието на катехоламини при плъхове с разрушаване на фронтотемпоралния неокортекс е показано, че електролитичното увреждане на фронтотемпоралния кортекс на мозъка нарушава стереотипа на условно-рефлекторната емоционална реакция на избягване (памет), отслабва физиологичната активност, намалява съдържанието на норепинефрин в зоната на коагулирания неокортекс, но повишава нивото му в хипоталамуса, където се наблюдава намаляване на концентрацията на адреналин, въпреки че количеството му в кръвта и надбъбречните жлези се увеличава.

В резултат на интрацеребрална трансплантация на ембрионална тъкан от типа locus coeruleus, стереотипът на условно-рефлексната емоционално-избягваща реакция, нарушен от електролитно увреждане на фронтотемпоралните области на мозъчната кора, се възстановява при 81,4% от животните, съдържанието на адреналин в ретикуларната формация на средния мозък, хипоталамуса и неокортекса се нормализира, а нивото му в хипокампуса дори се повишава, което е съчетано с намаляване на концентрацията на адреналин в кръвта.

Дистанционната трансплантация на ембрионална тъкан от locus coeruleus не само възстановява нарушения стереотип на условния рефлекс - емоционална избягваща реакция при плъхове с електролитно увреждане на фронтотемпоралната кора, но и повишава съдържанието на норепинефрин и адреналин, главно в хипоталамуса, кръвта, надбъбречните жлези и сърцето. Предполага се, че това се дължи на васкуларизация на трансплантата, проникване на невротрансмитери в кръвния поток, преминаването им през кръвно-мозъчната бариера и активиране на механизмите за обратно захващане на адреналин и норепинефрин чрез видове захващане 1, 2, 3. Авторите смятат, че дългосрочното стабилизиране на нивото на норепинефрин при условия на присаждане и функциониране на трансплантата може да се разглежда като феномен на неговото прогресивно освобождаване в минимални дози от невроните на locus coeruleus.

Положителните клинични ефекти от трансплантацията на ембрионална нервна тъкан могат да се дължат и на способността на последните да влияят върху процесите на съдова неоплазма, в чиято регулация пряко участват растежни фактори и цитокини. Васкулогенезата се активира от ангиогенни растежни фактори - съдов ендотелен растежен фактор (VEGF), FGF, PDGF и TGF, които се синтезират по време на исхемия, действаща като иницииращ момент на ангиогенезата. Доказано е, че изчерпването на потенциала за съдов растеж настъпва по време на процеса на стареене на организма, което играе съществена роля в патогенезата на заболявания като коронарна болест на сърцето и облитерираща атеросклероза на долните крайници. Тъканната исхемия се развива и при много други заболявания. Въвеждането на ангиогенни фактори в исхемичните зони (терапевтична ангиогенеза) стимулира растежа на кръвоносните съдове в исхемичните тъкани и подобрява микроциркулацията поради развитието на колатерално кръвообращение, което от своя страна повишава функционалната активност на засегнатия орган.

VEGF и FGF се считат за най-обещаващи за клинично приложение. Резултатите от първите рандомизирани проучвания са обнадеждаващи, особено ако оптималните дози и методи на приложение на ангиогенните фактори са били избрани правилно. В тази връзка е проведена експериментална оценка на ангиогенната активност на екстракт, изолиран от човешка ембрионална мозъчна тъкан. В работата е използван абортен материал, получен на двадесетата седмица от бременността и обработен по метода на I. Maciog et al. (1979), модифициран от IC ANRF. Това лекарство е аналог на „Ендотелна добавка за растеж на клетки“ („Sigma“) и представлява естествена смес от човешки ангиогенни фактори, която включва VEGF и FGF. Експериментите са проведени върху плъхове с модели на исхемия на задна крайник и миокардна тъкан. Въз основа на изследването на активността на алкалната фосфатаза при опитни животни, на които е даден екстракт от ембрионална нервна тъкан, е установено увеличение на броя на капилярите на единица площ на миокарда - както в надлъжни, така и в напречни разрези на сърцето. Ангиогенната активност на препарата се проявява при директно приложение в исхемичната зона, както и при системно (интрамускулно) приложение, което води до намаляване на средната площ на постинфарктния белег.

При всеки вариант на трансплантация на ембрионална нервна тъкан е изключително важно правилно да се избере гестационната възраст на трансплантирания ембрионален материал. Сравнителният анализ на ефективността на клетъчните препарати от ембрионалния вентрален мезенцефалон на 8-, 14- и 16-17-дневни ембриони на плъхове три месеца след интрастриатална невротрансплантация на зрели плъхове с паркисонизъм в автоматизирания тест за индуцирана от апоморфин моторна асиметрия разкри значително по-висока ефективност на клетъчните препарати на ЦНС от 8-дневни ембриони и най-ниска ефективност от 16-17-дневна ембрионална нервна тъкан. Получените данни корелират с резултатите от хистоморфологичния анализ, по-специално с размера на трансплантатите, тежестта на глиалната реакция и броя на допаминергичните неврони в тях.

Разликите в терапевтичния ефект на ембрионалните клетки на нервната тъкан могат да бъдат свързани както със степента на незрялост и ангажираност на самите клетки, така и с различните им отговори на растежни фактори, освободени в областта на индуцираното увреждане на допаминергичните неврони. По-специално, ефектът на EGF и FGF2 върху развитието на теленцефални неврални стволови клетки in vivo се проявява на различни етапи от ембриогенезата. Невроепителните клетки на 8,5-дневни миши ембриони, когато се култивират in vitro в безсерумна среда, пролиферират в присъствието на FGF2, но не и EGF, към който реагират само популации от стволови клетки, изолирани от мозъка на ембриони в по-късни етапи на развитие. В същото време, невралните стволови клетки пролиферират в отговор на всеки от тези митогени и адитивно усилват растежа в случай на добавяне на EGF и FGF2 към култура с ниска плътност на засяване на клетките. EGF-реактивните неврални стволови клетки от зародишните зони на 14,5-дневни миши ембриони се считат за линейни потомци на FGF-реактивни неврални стволови клетки, които се появяват за първи път след 8,5 дни бременност. Потенциалният фенотип на невралните стволови и прогениторните клетки зависи от сложния ефект на тяхната микросреда. Имунофенотипизирането на неврални клетки от перивентрикуларните и хипокампалните зони на 8-12- и 17-20-седмични човешки ембриони чрез флоуцитофлуорометрия разкри значителна вариабилност, свързана както с гестационната възраст, така и с индивидуалните конституционни особености на донорския биоматериал. Когато тези неврални прогениторни клетки се култивират в селективна безсерумна среда с EGF, FGF2 и NGF, невросферите се образуват със скорост, която значително зависи от гестационната възраст. Клетки от различни части на мозъка на 5-13-седмични човешки ембриони, при кратко култивиране с FGF2 в монослойна култура върху ламининов субстрат в присъствието на следи от растежни фактори, поддържат пролиферация в продължение на 6 седмици с висок процент нестин-позитивни клетки на фона на спонтанно образуване на клетки с маркери и на трите линии на неврална диференциация. Клетки, изолирани от мезенцефалона на човешки ембрион при гестационен период над 13 седмици, пролиферират под влиянието на EGF и също така образуват невросфери. Синергичен ефект е постигнат чрез използване на комбинация от EGF и FGF2. Най-интензивна пролиферация на неврални стволови клетки с образуване на невросфери се наблюдава при култивиране на тъканта на мозъчната кора на 6-8-седмични човешки ембриони в присъствието на EGF2, IGF1 и 5% конски серум върху субстрат с фибронектин.

Трябва да се отбележи, че въпросите относно гестационната възраст и секцията от ембрионалната ЦНС, чиято тъкан е за предпочитане да се използва за целите на невротрансплантацията, остават отворени. Отговорите на тях трябва да се търсят в неврогенезата на развиващия се мозък, която продължава през целия пренатален период - във време, когато епителът на невралната тръба образува многослойна структура. Смята се, че източникът на стволови клетки и нови неврони е радиалната глия, състояща се от удължени клетки с дълги израстъци, радиално насочени спрямо стената на мозъчните везикули и контактуващи с вътрешната повърхност на вентрикулите и външната пиална повърхност на мозъчната стена. Преди това радиалната глия е била надарена само с функцията на невронален тракт, по който невробластите мигрират от вентралната област към повърхностните отдели, а също така ѝ е била отредена скелетна роля в процеса на формиране на правилната ламинарна организация на кората. Днес е установено, че с напредването на развитието радиалната глия се трансдиференцира в астроцити. Значителна част от него при бозайниците се редуцира веднага след раждането, но при онези животински видове, при които радиалната глия е запазена до зряла възраст, неврогенезата активно протича в постнаталния период.

В култура, радиални глиални клетки от ембрионалния неокортекс на гризачите образуват неврони и глиални клетки, като невроните се образуват предимно на 14- до 16-дневна гестационна възраст от ембрионалното развитие (периодът на максимална интензивност на неврогенезата в мозъчната кора на мишки и плъхове). На 18-ия ден от ембриогенезата диференциацията се измества към образуването на астроцити със значително намаляване на броя на новообразуваните неврони. In situ маркирането на радиални глиални клетки с GFP позволява да се открие асиметрично делене на белязани клетки в кухината на мозъчните везикули на 15- до 16-дневни ембриони на плъхове с появата на дъщерни клетки с имунологични и електрофизиологични характеристики на невробластите. Прави впечатление, че според резултатите от динамичните наблюдения, нововъзникващите невробласти използват майчината клетка на радиалните глиални клетки за миграция към пиалната повърхност.

Ендогенният маркер на радиалната глия е междинният филаментен протеин нестин. Използвайки метода на флуоресцентно сортиране на клетки, маркирани с ретровирус, свързан с GFP и експресирани под контрола на нестин, беше показано, че стволовите клетки на зъбната извивка и хилуса на човешкия хипокампус (материалът е получен по време на операции за епилепсия) експресират нестин. Следователно те принадлежат към радиалната глия, която при хората, както и при другите бозайници, се запазва само в зъбната извивка.

В същото време, ефективността на клетъчната трансплантация се определя не само от високата жизнеспособност на донорските клетки, техния потенциал за диференциация и способност да заместват дефектните клетки, но, на първо място, от тяхната насочена миграция. Пълната функционална интеграция на трансплантираните клетки зависи от тяхната миграционна способност - без да се нарушава цитоархитектурата на мозъка на реципиента. Тъй като радиалната глия претърпява почти пълна редукция в постнаталния период, беше необходимо да се установи как донорските клетки могат да се придвижат от зоната на трансплантация до мястото на мозъчно увреждане при възрастни реципиенти. Съществуват два варианта на клетъчна миграция към ЦНС, които не зависят от радиалната глия: феноменът на тангенциална миграция или движението на невробластите по време на развитието на мозъчната кора, перпендикулярно на мрежата от радиална глия, както и миграция „в редица“ или „по верига“. По-специално, миграцията на невронните прогениторни клетки от ростралната субвентрикуларна зона към обонятелната луковица се осъществява като последователност от плътно съседни клетки, заобиколени от глиални клетки. Смята се, че тези клетки използват партньорски клетки като субстрат за миграция, а основният регулатор на такива междуклетъчни взаимодействия е PSA-NCAM (полисиалилирана молекула на адхезията на невронните клетки). Следователно, невронната миграция не изисква непременно участието на радиална глия или предварително съществуващи аксонални връзки. Екстрарадиалната форма на клетъчно движение в „нишка“ по ростралния миграционен тракт се поддържа през целия живот, което показва реална възможност за целенасочено доставяне на трансплантирани невронни прогениторни клетки към зрялата нервна система.

Съществува хипотеза за наличието на линия от стволови клетки в онтогенезата на мозъка, според която в ранните етапи на развитието на мозъка стволова клетка е невроепителна клетка, която с узряването си се трансдиференцира в радиална глия. В зряла възраст ролята на стволови клетки се изпълнява от клетки, които имат характеристиките на астроцити. Въпреки редица спорни моменти (противоречия относно стволовите клетки на хипокампуса, както и дълбоките части на мозъка, които нямат слоеста кора и се развиват от таламичните туберкули, където липсва радиална глия), ясната и проста концепция за последователна промяна във фенотипа на стволовите клетки през цялата онтогенеза изглежда много привлекателна.

Влиянието на факторите на микросредата върху определянето и последващата диференциация на невронно диференциращите се клетки е ясно демонстрирано чрез трансплантация на зрели стволови клетки от гръбначния мозък на плъхове в различни области на зрялата нервна система. Когато стволовите клетки са трансплантирани в зъбната гируса или в областта на невронна миграция в обонятелните луковици, е наблюдавана активна миграция на трансплантираните клетки с образуването на множество неврони. Трансплантацията на стволови клетки в гръбначния мозък и областта на рога на Амон води до образуването на астроцити и олигодендроцити, докато трансплантацията в зъбната гируса води до образуването не само на глиални клетки, но и на неврони.

При зрял плъх броят на делящите се клетки в зъбната гируса може да достигне няколко хиляди на ден - по-малко от 1% от общия брой гранулирани клетки. Невроните съставляват 50-90% от клетките, астоцитите и другите глиални елементи - около 15%. Останалите клетки нямат антигенни характеристики на невроните и глията, но съдържат антигени на ендотелни клетки, което показва тясна връзка между неврогенезата и ангиогенезата в зъбната гируса. Поддръжниците на възможността за диференциация на ендотелни клетки в невронни прекурсорни клетки се позовават на способността на ендотелните клетки in vitro да синтезират BDNF.

Скоростта на самосглобяване на невронните вериги е впечатляваща: по време на диференциацията, прекурсорните клетки на грануларните клетки мигрират към зъбната извивка и образуват израстъци, растящи към SAZ зоната на рога на Амон и образуващи синапси с пирамидални глутаматергични и интеркаларни инхибиторни неврони. Новосъздадените грануларни клетки се интегрират в съществуващите невронни вериги в рамките на 2 седмици, а първите синапси се появяват още 4-6 дни след появата на нови клетки. Чрез често приложение на BrdU или 3H-тимидин (един от методите за идентифициране на възрастни стволови клетки) на зрели животни, в рога на Амон са открити голям брой белязани неврони и астроцити, което показва възможността за образуване на нови неврони не само в зъбната извивка, но и в други части на хипокампуса. Интересът към процесите на делене, диференциация и клетъчна смърт в зъбната извивка на хипокампуса на зрелия мозък се дължи и на факта, че образуваните тук неврони са локализирани в една от ключовите области на хипокампуса, отговорна за процесите на учене и памет.

По този начин, днес е установено, че невралните прогениторни клетки произхождат от клетките на субепендималната зона на латералния вентрикул на зрели гризачи. Те мигрират по ростралния миграционен тракт, образуван от надлъжно ориентирани астроглиални клетки, до обонятелната луковица, където се вграждат в слоя на гранулираните клетки и се диференцират в неврони с тази структура. Миграция на прогениторни неврални клетки е открита в ростралния миграционен тракт на възрастни маймуни, което показва възможността за образуване на нови неврони в обонятелната луковица на примати. Невронни стволови клетки са изолирани от обонятелната луковица на възрастен човек и са прехвърлени в линии, чиито клонирани клетки се диференцират в неврони, астроцити и олигодендроцити. Стволови клетки са открити в хипокампуса на зрелия мозък на плъхове, мишки, маймуни и хора. Невронните стволови клетки от субгранулираната зона на зъбната фасция са източник на прогениторни клетки, мигриращи към медиалните и страничните крайници на хипокампуса, където се диференцират в зрели гранулирани клетки и глиални елементи. Аксоните на de novo формирани неврони на зъбната фасция се проследяват до CA3 полето, което показва участието на новообразувани неврони в осъществяването на хипокампалните функции. В асоциативните области на неокортекса на възрастните маймуни са открити невронни прогениторни клетки, мигриращи от субвентрикуларната зона. В слой VI на неокортекса на мозъка на мишката се откриват нови пирамидални неврони 2-28 седмици след индуцираното увреждане и смъртта на местните неврони на този слой поради миграцията на преди това спящи прогениторни клетки от субвентрикуларната зона. Накрая, реалността на постнаталната неврогенеза в човешкия мозък се доказва от двукратното увеличение на броя на кортикалните неврони, което продължава през първите 6 години след раждането.

От не малко значение за практическата клетъчна трансплантология е въпросът за регулирането на процесите на размножаване и диференциация на невралните стволови и прогениторни клетки. Най-важните фактори, потискащи пролиферацията на невралните прогениторни клетки, са глюкокортикоидите, които рязко намаляват броя на деленията, докато отстраняването на надбъбречните жлези, напротив, значително увеличава броя на митозите (Gould, 1996). Прави впечатление, че морфогенезата на зъбната гируса при гризачите е най-интензивна през първите две седмици от постнаталното развитие по време на периода на липса на реакция на стрес на фона на рязко намаляване на производството и секрецията на стероидни хормони на надбъбречната кора. Кортикостероидите инхибират миграцията на гранулираните клетки - новите неврони не се вграждат в гранулирания слой на зъбната гируса, а остават в хилуса. Предполага се, че едновременно с това се нарушават и процесите на образуване на синаптични връзки. Защитата на клетките от подобна „стероидна агресия“ се осъществява чрез минимална експресия на минералкортикоидни и глюкокортикоидни рецептори върху пролифериращи гранулирани клетки не само по време на развитието на зъбната гируса, но и при зрели животни. Въпреки това, от всички неврони на мозъка, именно невроните на хипокампуса се характеризират с най-високо съдържание на глюкокортикоидни рецептори, което причинява стресовия ефект върху хипокампуса. Психоемоционалният стрес и стресовите ситуации инхибират неврогенезата, а хроничният стрес рязко намалява способността на животните да придобиват нови умения и да учат. По-изразеният отрицателен ефект на хроничния стрес върху неврогенезата е напълно разбираем, ако вземем предвид предимно латентното състояние на невронните стволови клетки. При обездвижване на бременни плъхове (за гризачи - изключително силен стресов фактор) е установено, че пренаталният стрес също причинява намаляване на броя на клетките в зъбната гируса и значително инхибира неврогенезата. Известно е, че глюкокортикоидите участват в патогенезата на депресивните състояния, чийто морфологичен еквивалент е инхибирането на неврогенезата, патологичната реорганизация на невроните и междуневронните връзки и смъртта на нервните клетки. От друга страна, антидепресантните химиотерапевтични средства активират образуването на неврони de novo, което потвърждава връзката между процесите на образуване на нови неврони в хипокампуса и развитието на депресия. Естрогените имат значителен ефект върху неврогенезата, чиито ефекти са противоположни на действието на глюкокортикостероидите и се състоят в подпомагане на пролиферацията и жизнеспособността на невронните прогениторни клетки. Трябва да се отбележи, че естрогените значително повишават способността за учене на животните. Някои автори свързват цикличните промени в броя на гранулираните клетки и техния излишен брой при женските с влиянието на естрогените.

Известно е, че неврогенезата се контролира от EGF, FGF и BDNF, но механизмите на ефекта на външни сигнали върху стволовите клетки от митогени и растежни фактори не са достатъчно проучени. Установено е, че PDGF in vitro поддържа невронната посока на диференциация на прогениторните клетки, а цилиарният невротрофичен фактор (CNTF), подобно на трийодотиронина, стимулира образуването предимно на глиални елементи - астроцити и олигодендроцити. Хипофизният аденилатциклаза-активиращ протеин (PACAP) и вазоактивният чревен пептид (VIP) активират пролиферацията на невралните прогениторни клетки, но същевременно инхибират процесите на диференциация на дъщерните клетки. Опиоидите, особено при продължително излагане, значително инхибират неврогенезата. Опиоидните рецептори обаче не са идентифицирани в стволовите клетки и невралните прогениторни клетки на зъбната извивка (те присъстват в диференциращите се неврони на ембрионалния период), което не ни позволява да оценим директните ефекти на опиоидите.

Нуждите на практическата регенеративно-пластична медицина принудиха изследователите да обърнат специално внимание на изучаването на плури- и мултипотентността на стволовите клетки. Прилагането на тези свойства на ниво регионални стволови клетки на възрастен организъм би могло в бъдеще да осигури производството на необходимия трансплантационен материал. По-горе беше показано, че епигенетичната стимулация на невронните стволови клетки позволява получаването на пролифериращи клетки, вече предварително оформени според невронните фенотипове, което ограничава техния брой. В случай на използване на тотипотентните свойства на ембрионална стволова клетка, пролиферацията до получаване на достатъчен брой клетки се случва по-рано от невронната диференциация и размножените клетки лесно се превръщат в невронен фенотип. За да се получат невронни стволови клетки, ембрионалните стволови клетки (ESC) се изолират от вътрешната клетъчна маса на бластоциста и се култивират при задължителното присъствие на LIF, което запазва тяхната тотипотентност и способност за неограничено делене. След това се индуцира невронна диференциация на ESC с помощта на ретиноева киселина. Трансплантацията на получените невронни стволови клетки в стриатума, увреден от хинолин и 6-хидроксидопамин, е съпроводена с тяхната диференциация в допаминергични и серотонергични неврони. След инжектиране в вентрикулите на ембрионалния мозък на плъх, невралните прогениторни клетки, получени от ембрионални стволови клетки (ESC), мигрират към различни области на мозъка на реципиента, включително кората, стриатума, септума, таламуса, хипоталамуса и малкия мозък. Клетките, останали в вентрикуларната кухина, образуват епителни структури, наподобяващи неврална тръба, както и отделни островчета от неневрална тъкан. В мозъчния паренхим на ембриона реципиент, трансплантираните клетки произвеждат трите основни клетъчни типа на нервната система. Някои от тях имат удължени апикални дендрити, пирамидални клетъчни тела и базални аксони, проектиращи се в corpus callosum. Астроцитите от донорски произход разширяват израстъци до близките капиляри, а олигодендроцитите са в тясен контакт с миелинови муфи, участвайки в образуването на миелин. По този начин, невралните прогениторни клетки, получени от ESC in vitro, са способни на насочена миграция и регионална диференциация, адекватна на сигналите от микросредата, осигурявайки много области на развиващия се мозък с неврони и глия.

Някои автори разглеждат възможността за де- и трансдиференциация на регионални стволови клетки на възрастен организъм. Косвено потвърждение за клетъчната дедиференциация в култура с разширяване на техния потенциал се предоставя от данни за присаждане на миши невронни стволови клетки в червения костен мозък с последващо развитие на клетъчни линии от тях, даващи функционално активни клетки на периферната кръв. Освен това, трансплантацията на генетично маркирани (LacZ) невросферни клетки, получени от зрял или ембрионален мозък, в мозъка на облъчени мишки с потисната хематопоеза доведе до образуването не само на невронни производни от стволови клетки, но и предизвика генериране на кръвни клетки, което показва плурипотентност на невронните стволови клетки, реализирана извън мозъка. По този начин, невронната стволова клетка е способна да се диференцира в кръвни клетки под въздействието на сигнали от микросредата на костния мозък с предварителна трансформация в хематопоетична стволова клетка. От друга страна, при трансплантация на хематопоетични стволови клетки от костен мозък в мозъка е установена тяхната диференциация под влиянието на микросредата на мозъчната тъкан в глиални и невронни клетки. Следователно, потенциалът за диференциация на невронните и хематопоетичните стволови клетки не е ограничен от тъканната специфичност. С други думи, фактори на локалната микросреда, различни от тези, характерни за тъканите на мозъка и костния мозък, са способни да променят посоката на диференциация на тези клетки. Показано е, че невронните стволови клетки, въведени във венозната система на облъчени мишки, създават популации от миелоидни, лимфоидни и незрели хематопоетични клетки в далака и костния мозък. In vitro е установен ефектът на морфогенетичните протеини на костния мозък (BMPs) върху оцеляването и диференциацията на невронните стволови клетки, определяйки, както в ранните етапи на ембриогенезата, тяхното развитие в невронна или глиална посока. В култури от невронни стволови клетки от 16-дневни ембриони на плъхове, BMPs индуцират образуването на неврони и астроглия, докато в култури от стволови клетки, получени от перинатален мозък, се образуват само астроцити. Освен това, BMPs потискат генерирането на олигодендроцити, които се появяват in vitro само с добавянето на BMP антагониста noggin.

Процесите на трансдиференциация са видово неспецифични: човешките хематопоетични стволови клетки от костен мозък, трансплантирани в стриатума на зрели плъхове, мигрират към бялото вещество на външната капсула, ипси- и контралатералния неокортекс, където образуват астроцитноподобни клетъчни елементи (Azizi et al., 1998). Когато стволовите клетки от костен мозък се алотрансплантират в латералния вентрикул на новородени мишки, миграцията на хематопоетичните стволови клетки може да се проследи до структурите на предния мозък и малкия мозък. В стриатума и молекулярния слой на хипокампуса мигриралите клетки се трансформират в астроцити, а в обонятелната луковица, вътрешния гранулоклетъчния слой на малкия мозък и ретикуларната формация на мозъчния ствол те образуват невроноподобни клетки с положителна реакция към неврофиламенти. След интравенозно приложение на хематопоетични клетки на възрастни мишки, GFP-маркирани микро- и астроцити са открити в неокортекса, таламуса, мозъчния ствол и малкия мозък.

Освен това, мезенхимните стволови клетки от костен мозък, които дават началото на всички видове клетки на съединителната тъкан, също могат да претърпят неврална трансдиференциация при определени условия (припомнете си, че ембрионалният източник на мезенхима са клетките на невралния гребен). Доказано е, че човешки и миши стромални клетки от костен мозък, култивирани in vitro в присъствието на EGF или BDNF, експресират маркера на невралните прогениторни клетки нестин, а добавянето на различни комбинации от растежни фактори води до образуването на клетки с маркери на глия (GFAP) и неврони (ядрен протеин, NeuN). Маркираните сингенни мезенхимни стволови клетки, трансплантирани в латералния вентрикул на мозъка на новородени мишки, мигрират и се локализират в предния мозък и малкия мозък, без да нарушават цитоархитектурата на реципиентния мозък. Мезенхимните стволови клетки от костен мозък се диференцират в зрели астроцити в стриатума и молекулярния слой на хипокампуса и заселват обонятелната луковица, гранулираните слоеве на малкия мозък и ретикуларната формация, където се трансформират в неврони. Човешките мезенхимни стволови клетки от костен мозък са способни да се диференцират в макроглия in vitro и да се интегрират в мозъчните структури на плъхове след трансплантация. Директната трансплантация на мезенхимни стволови клетки от костен мозък в хипокампуса на възрастни плъхове също е съпроводена с тяхната миграция в мозъчния паренхим и невроглиална диференциация.

Предполага се, че трансплантацията на стволови клетки от костен мозък може да разшири възможностите за клетъчна терапия на заболявания на ЦНС, характеризиращи се с прекомерна патологична смърт на неврони. Трябва да се отбележи обаче, че не всички изследователи признават факта на взаимна трансформация на невронните и хематопоетичните стволови клетки, особено in vivo, което отново се дължи на липсата на надежден маркер за оценка на тяхната трансдиференциация и по-нататъшно развитие.

Трансплантацията на стволови клетки отваря нови хоризонти за клетъчната генна терапия на наследствена неврологична патология. Генетичната модификация на невронните стволови клетки включва вмъкване на генетични регулаторни конструкции, чиито продукти взаимодействат с протеините на клетъчния цикъл в режим на автоматична регулация. Трансдукцията на такива гени в ембрионални прогениторни клетки се използва за размножаване на невронни стволови клетки. Повечето генетично модифицирани клетъчни клонове се държат като стабилни клетъчни линии, без да показват признаци на трансформация in vivo или in vitro, но имат изразена способност за контактно инхибиране на пролиферацията. При трансплантация размножените трансфектирани клетки се интегрират в тъканта на реципиента, без да нарушават цитоархитектурата и без да претърпяват туморна трансформация. Донорните невронни стволови клетки не деформират зоната на интеграция и се конкурират равностойно за пространство с прогениторните клетки на гостоприемника. Въпреки това, на 2-3-тия ден интензивността на делене на трансфектираните клетки рязко намалява, което съответства на контактно инхибиране на тяхната пролиферация in vitro. Ембрионите-реципиенти на невронни стволови трансфектанти нямат аномалии в развитието на централната нервна система, всички области на мозъка, които са в контакт с трансплантата, се развиват нормално. След трансплантация, клонингите на неврални стволови клетки бързо мигрират от зоната на инжектиране и често излизат извън съответните ембрионални зони по ростралния тракт, като се интегрират адекватно с други области на мозъка. Интеграцията на генетично модифицирани клонинги и трансфектирани клетъчни линии на неврални стволови клетки в мозъка на гостоприемния организъм е характерна не само за ембрионалния период: тези клетки се имплантират в множество области на централната нервна система на плода, новороденото, възрастен и дори стареещия организъм на реципиента и демонстрират способност за адекватна интеграция и диференциация. По-специално, след трансплантация в камерната кухина на мозъка, трансфектираните клетки мигрират, без да увреждат кръвно-мозъчната бариера, и се превръщат в неразделни функционални клетъчни компоненти на мозъчната тъкан. Донорните неврони образуват подходящи синапси и експресират специфични йонни канали. При запазена целостност на кръвно-мозъчната бариера, астроглията, производно на трансфектираните неврални стволови клетки, разширява процесите до мозъчните съдове, а получените от донор олигодендроцити експресират миелинов основен протеин и миелинизират невронните процеси.

Освен това, невронните стволови клетки се трансфектират за използване като клетъчни вектори. Такива векторно-генетични конструкции осигуряват in vivo стабилна експресия на чужди гени, участващи в развитието на нервната система, или се използват за коригиране на съществуващи генетични дефекти, тъй като продуктите на тези гени са способни да компенсират различни биохимични аномалии на централната нервна система. Високата миграционна активност на трансфектираните стволови клетки и адекватната имплантация в зародишните зони на различни области на развиващия се мозък ни позволяват да се надяваме на пълно възстановяване на наследствения дефицит на клетъчни ензими. При моделиране на синдрома на атаксия-телангиектазия (мутантни миши линии pg и pcd), клетките на Пуркиние изчезват от малкия мозък на опитни животни през първите седмици от постнаталното развитие. Доказано е, че въвеждането на невронни стволови клетки в мозъка на такива животни е съпроводено с тяхната диференциация в клетки на Пуркиние и гранулирани неврони. При pcd мутанти нарушенията на координацията на движенията са частично коригирани и интензивността на тремора е намалена. Подобни резултати са получени чрез трансплантиране на клонирани човешки невронни стволови клетки в примати, при които е индуцирана дегенерация на клетки на Пуркиние с помощта на онконаза. След трансплантация, донорски неврални стволови клетки са открити в гранулирания, молекулярния и Пуркиниевия слой на церебеларния паренхим. Следователно, генетичната модификация на невралните прогениторни клетки може да осигури стабилна, ангажирана модификация на фенотипа, която е устойчива на външни влияния. Това е особено важно при патологични процеси, свързани с развитието на фактори в реципиента, които предотвратяват оцеляването и диференциацията на донорските клетки (напр. по време на имунна агресия).

Мукополизахаридозата тип VII при хора се характеризира с невродегенерация и прогресивна интелектуална недостатъчност, която се моделира при мишки чрез делеционна мутация в гена за бета-глюкуронидаза. След трансплантация на трансфектирани неврални стволови клетки, секретиращи бета-глюкуронидаза, в мозъчните вентрикули на новородени дефектни мишки реципиенти, донорските клетки се намират първо в терминалната зона и след това се разпространяват в целия мозъчен паренхим, стабилно коригирайки целостта на лизозомите в мозъка на мутантни мишки. В модел на болестта на Тей-Сакс, ретровирусно трансдуцирани неврални стволови клетки, когато се прилагат in utero на миши фетуси и се трансплантират в новородени мишки, осигуряват ефективна експресия на бета-субединицата на бета-хексозаминидазата при реципиенти с мутация, водеща до патологично натрупване на бета2-ганглиозид.

Друго направление на регенеративната медицина е стимулирането на пролиферативния и диференциращ потенциал на собствените невронни стволови клетки на пациента. По-специално, невронните стволови клетки секретират NT-3 по време на хемисекция на гръбначния мозък и мозъчна асфиксия при плъхове, експресират NGF и BDNF в септума и базалните ганглии, тирозин хидроксилази в стриатума, както и рилин в малкия мозък и миелинов основен протеин в мозъка.

Въпреки това, на въпросите за стимулиране на неврогенезата очевидно не се обръща достатъчно внимание. Няколко проучвания показват, че функционалното натоварване на нервните центрове, отговорни за разграничаването на миризми, се отразява във формирането на нови неврони. При трансгенни мишки с дефицит на невронни адхезионни молекули, намаляването на интензивността на неврогенезата и намаляването на броя на невроните, мигриращи към обонятелните луковици, е съчетано с нарушаване на способността за разграничаване на миризми, въпреки че прагът на възприятие на миризми и краткосрочната обонятелна памет не са нарушени. Функционалното състояние на клетките на зъбната извивка играе важна роля в регулирането на неврогенезата: отслабването на ефекта на глутамата върху гранулираните клетки след разрушаването на енториналния кортекс насърчава пролиферацията и диференциацията на невроните, а стимулирането на влакната на перфорантния път (основният аферентен вход към хипокампуса) причинява инхибиране на неврогенезата. Антагонистите на NMDA рецепторите активират процесите на образуване на нови неврони, докато агонистите, напротив, намаляват интензивността на неврогенезата, което по същество наподобява действието на глюкокортикостероидите. В литературата се откриват противоречиви резултати от изследвания: информацията за експериментално доказания инхибиторен ефект на възбуждащия невротрансмитер глутамат върху неврогенезата е несъвместима с данните за стимулиране на пролиферацията на прогениторни клетки и появата на нови неврони с повишаване на гърчовата активност в хипокампуса на животни с експериментални каинови и пилокарпинови модели на епилепсия. В същото време, в традиционния модел на епилепсия, причинена от множествена подпрагова стимулация на определена област на мозъка (киндлинг) и характеризираща се с по-слабо изразена смърт на неврони, интензивността на неврогенезата се увеличава само в късната фаза на киндлинга, когато се наблюдава увреждане и смърт на неврони в хипокампуса. Доказано е, че при епилепсия гърчовата активност стимулира неврогенезата с анормална локализация на нови гранулирани неврони, много от които се появяват не само в зъбната гируса, но и в хилуса. Такива неврони са от голямо значение за развитието на мъхови влакнести пониквания, тъй като техните аксони образуват нормално липсващи обратни колатерали, които образуват множество синапси със съседни гранулирани клетки.

Използването на регионални невронни стволови клетки открива нови перспективи за приложението на клетъчната трансплантация при лечението на метаболитни и генетични невродегенеративни заболявания, демиелинизиращи заболявания и посттравматични разстройства на централната нервна система. Преди извършване на заместителна клетъчна трансплантация по един от методите, се извършва селекция и разширяване на необходимия тип невронни прогениторни клетки ex vivo с цел последващото им въвеждане директно в увредената област на мозъка. Терапевтичният ефект в този случай се дължи на заместването на увредените клетки или на локалното освобождаване на растежни фактори и цитокини. Този метод на регенеративно-пластична терапия изисква трансплантация на достатъчно голям брой клетки с предварително определени функционални характеристики.

По-нататъшни изследвания на молекулярните характеристики и регенеративно-пластичния потенциал на зрелите мозъчни стволови клетки, както и способността на регионалните стволови клетки с различен тъканен произход да се трансдиференцират, също трябва да се считат за подходящи. Днес вече е проведен скрининг на антигени на хематопоетични стволови клетки от костен мозък, с определяне на маркерна комбинация от клетки, способни да се трансдиференцират в неврални стволови прогениторни клетки (CD 133+, 5E12+, CD34-, CD45-, CD24). Получени са клетки, които образуват невросфери in vitro и образуват неврони при трансплантация в мозъка на новородени имунодефицитни мишки. Интерес за клетъчната ксенотрансплантология представляват резултатите от изследвания върху възможността за кръстосана трансплантация на стволови клетки при индивиди от еволюционно отдалечени таксони. Резултатите от имплантирането на неврални стволови клетки в областта на мозъчния тумор остават без правилна интерпретация: трансплантираните клетки активно мигрират в целия обем на тумора, без да излизат извън неговите граници, а когато клетките се въвеждат в непокътнатата част на мозъка, се наблюдава тяхната активна миграция към тумора. Въпросът за биологичното значение на такава миграция остава отворен.

Трябва да се отбележи, че успешната трансплантация на неврални стволови клетки, както и на други неврални прогениторни клетки, получени от ембрионални стволови клетки (ESC), е възможна само при използване на високо пречистени неврални прогениторни клетки, тъй като недиференцираните ембрионални стволови клетки неизбежно се трансформират в тератоми и тератокарциноми при трансплантация на възрастен имунокомпетентен реципиент. Дори минимално количество слабо диференцирани клетки в суспензията от донорски клетки рязко увеличава туморогенността на трансплантата и неприемливо увеличава риска от развитие на тумор или образуване на неневрална тъкан. Получаването на хомогенни популации от неврални прогениторни клетки е възможно при използване на клетки, които възникват на определени етапи от нормалната ембриогенеза, като алтернативен източник на донорска тъкан. Друг подход включва внимателно елиминиране на нежелани клетъчни популации чрез специфична за линията селекция. Използването на ESC за невротрансплантация след недостатъчното им излагане in vitro на растежни фактори също е опасно. В този случай не може да се изключи неуспех на програмата за неврална диференциация с образуването на структури, присъщи на невралната тръба.

Днес е съвсем очевидно, че невронните стволови клетки проявяват тропизъм към патологично променени области на централната нервна система и имат изразен регенеративно-пластичен ефект. Микросредата в мястото на смъртта на нервната тъкан моделира посоката на диференциация на трансплантираните клетки, като по този начин попълва дефицита на специфични невронни елементи в зоната на увреждане на ЦНС. При някои невродегенеративни процеси възникват неврогенни сигнали за рекапитулация на неврогенезата и невронните стволови клетки на зрелия мозък са способни да реагират на тази поучителна информация. Многобройни експериментални данни служат като ясна илюстрация на терапевтичния потенциал на невронните стволови клетки. Интрацистерналното приложение на клон на невронни стволови клетки на животни с лигиране на средната мозъчна артерия (модел на исхемичен инсулт) спомага за намаляване на площта и обема на деструктивно променената област на мозъка, особено в случай на трансплантация на невронни стволови клетки заедно с FGF2. Имуноцитохимично се наблюдава миграция на донорни клетки към исхемичната зона с последващата им интеграция с непокътнати мозъчни клетки на реципиента. Трансплантацията на незрели клетки от миша невроепителна линия MHP36 в мозъка на плъхове с експериментален инсулт подобрява сензомоторната функция, а въвеждането на тези клетки в мозъчните вентрикули засилва когнитивната функция. Трансплантацията на невронно преформирани хематопоетични клетки от човешки костен мозък на плъхове елиминира дисфункцията на мозъчната кора, причинена от исхемично увреждане. В този случай ксеногенните невронни прогениторни клетки мигрират от мястото на инжектиране към зоната на деструктивни промени в мозъчната тъкан. Интракраниалната трансплантация на хомоложни клетки от костен мозък при травматично увреждане на мозъчната кора при плъхове води до частично възстановяване на двигателната функция. Донорните клетки се присаждат, пролиферират, претърпяват невронна диференциация в неврони и астроцити и мигрират към лезията. Когато се инжектират в стриатума на възрастни плъхове с експериментален инсулт, клонираните човешки невронни стволови клетки заместват увредените клетки на ЦНС и частично възстановяват нарушената мозъчна функция.

Човешките неврални стволови клетки се изолират главно от ембрионалния теленцефалон, който се развива много по-късно от по-каудално разположените части на нервния ствол. Показана е възможността за изолиране на неврални стволови клетки от гръбначния мозък на 43-137-дневен човешки плод, тъй като в присъствието на EGF и FGF2 тези клетки образуват невросфери и проявяват мултипотентност в ранните пасажи, диференцирайки се в неврони и астроцити. Дългосрочното култивиране на неврални прогениторни клетки (над 1 година) обаче ги лишава от мултипотентност - такива клетки са способни да се диференцират само в астроцити, т.е. стават унипотентни. Регионални неврални стволови клетки могат да бъдат получени в резултат на частична булбектомия и след размножаване в култура в присъствието на LIF да бъдат трансплантирани на същия пациент с невродегенеративни промени в други части на централната нервна система. В клиниката за първи път е проведена заместителна клетъчна терапия с неврални стволови клетки за лечение на пациенти с инсулт, придружен от увреждане на базалните ганглии на мозъка. В резултат на трансплантация на донорски клетки е отбелязано подобрение в клиничното състояние на повечето пациенти.

Някои автори смятат, че способността на невронните стволови клетки да се присаждат, мигрират и интегрират в различни области на нервната тъкан в случай на увреждане на ЦНС открива неограничени възможности за клетъчна терапия не само на локални, но и на обширни (инсулт или асфиксия), мултифокални (множествена склероза) и дори глобални (повечето наследствени метаболитни нарушения или невродегенеративни деменции) патологични процеси. Всъщност, когато клонирани миши и човешки невронни стволови клетки се трансплантират в реципиентни животни (съответно мишки и примати) с дегенерация на допаминергични неврони в мезостриаталната система, индуцирана от въвеждането на метил-фенил-тетрапиридин (модел на болестта на Паркинсон) 8 месеца преди трансплантацията, донорските невронни стволови клетки се интегрират в ЦНС на реципиента. Месец по-късно трансплантираните клетки се локализират двустранно по протежение на средния мозък. Някои от получените неврони с донорен произход експресират тирозин хидролаза при липса на признаци на имунна реакция към трансплантацията. При плъхове, на които е прилаган 6-хидроксидопамин (друг експериментален модел на болестта на Паркинсон), адаптацията на трансплантираните клетки към микросредата в мозъка на гостоприемника е била определена от условията на култивиране на неврални стволови клетки преди тяхната трансплантация. Невронните стволови клетки, бързо пролифериращи in vitro под влиянието на EGF, компенсират дефицита на допаминергични неврони в увредения стриатум по-ефективно от клетките от 28-дневни култури. Авторите смятат, че това се дължи на загубата на способността за възприемане на съответните сигнали за диференциация по време на процеса на клетъчно делене на невралните прогениторни клетки in vitro.

В някои проучвания са правени опити за повишаване на ефективността на въздействието върху процесите на реинервация на увредения стриатум чрез трансплантация на ембрионални стриатумни клетки в тази област като източник на невротрофични фактори с едновременна трансплантация на допаминергични неврони на вентралния мезенцефалон. Оказа се, че ефективността на невротрансплантацията до голяма степен зависи от метода на въвеждане на ембрионална нервна тъкан. В резултат на проучвания върху трансплантацията на препарати от ембрионална нервна тъкан в камерната система на мозъка (с цел да се избегне увреждане на паренхима на стриатума) е получена информация за положителния им ефект върху двигателния дефект при паркинсонизъм.

В други проучвания обаче експериментални наблюдения показват, че трансплантацията на препарати от ембрионална нервна тъкан на вентралния мезенцефалон, съдържащи допаминергични неврони, в мозъчния вентрикул, както и трансплантацията на GABA-ергични ембрионални невронни елементи в стриатума на плъхове с хемипаркинсонизъм, не насърчава възстановяването на нарушените функции на допаминергичната система. Напротив, имуноцитохимичният анализ потвърждава данните за ниската преживяемост на допаминергичните неврони на вентралния мезенцефалон, трансплантирани в стриатума на плъхове. Терапевтичният ефект от интравентрикуларната трансплантация на ембрионална нервна тъкан на вентралния мезенцефалон се реализира само при условие на едновременно имплантиране на препарат от ембрионални стриатални клетки в денервирания стриатум. Авторите смятат, че механизмът на този ефект е свързан с положителния трофичен ефект на GABA-ергичните елементи на ембрионалния стриатум върху специфичната допаминергична активност на интравентрикуларните трансплантати на вентралния мезенцефалон. Изразена глиална реакция при трансплантатите е съпроводена с лека регресия на параметрите на апоморфиновия тест. Последното, от своя страна, корелира със съдържанието на GFAP в кръвния серум, което директно показва нарушение на пропускливостта на кръвно-мозъчната бариера. Въз основа на тези данни авторите стигат до заключението, че нивото на GFAP в кръвния серум може да се използва като адекватен критерий за оценка на функционалното състояние на трансплантата, а повишената пропускливост на кръвно-мозъчната бариера за невроспецифични антигени като GFAP е патогенетично звено в развитието на трансплантационна недостатъчност поради автоимунно увреждане на нервната тъкан на реципиента.

От гледна точка на други изследователи, присаждането и интеграцията на невронните стволови клетки след трансплантация са стабилни и доживотни, тъй като донорските клетки се намират в реципиентите поне две години след трансплантацията и без значително намаляване на броя им. Опитите да се обясни това с факта, че в недиференцирано състояние невронните стволови клетки не експресират MHC клас I и II молекули на ниво, достатъчно за индуциране на имунна реакция на отхвърляне, могат да се считат за верни само по отношение на нискодиференцирани невронни прекурсори. Не всички невронни стволови клетки в мозъка на реципиента обаче се запазват в незряло латентно състояние. Повечето от тях претърпяват диференциация, по време на която MHC молекулите се експресират напълно.

По-специално, недостатъчната ефективност на използването на интрастриатална трансплантация на ембрионални вентрални мезенцефалонни препарати, съдържащи допаминергични неврони, за лечение на експериментален паркисонизъм е свързана с ниската преживяемост на трансплантираните допаминергични неврони (само 5-20%), което се дължи на реактивна глиоза, съпътстваща локална травма на мозъчния паренхим по време на трансплантация. Известно е, че локалната травма на мозъчния паренхим и съпътстващата глиоза водят до нарушаване на целостта на кръвно-мозъчната бариера с освобождаване на антигени на нервната тъкан, по-специално OCAR и неврон-специфичен антиген, в периферната кръв. Наличието на тези антигени в кръвта може да предизвика производството на специфични цитотоксични антитела към тях и развитието на автоимунна агресия.

В. Цимбалюк и съавтори (2001) съобщават, че все още е валидна традиционната гледна точка, според която централната нервна система е имунологично привилегирована зона, изолирана от имунната система чрез кръвно-мозъчната бариера. В своя преглед на литературата авторите цитират редица трудове, показващи, че тази гледна точка не съответства напълно на същността на имунните процеси в мозъка на бозайниците. Установено е, че белязани вещества, въведени в мозъчния паренхим, могат да достигнат дълбоки шийни лимфни възли и след интрацеребрално инжектиране на антигени в организма се образуват специфични антитела. Клетките на шийните лимфни възли реагират на такива антигени чрез пролиферация, започваща на 5-ия ден след инжектирането. Образуването на специфични антитела е установено и по време на трансплантация на кожа в мозъчния паренхим. Авторите на прегледа предоставят няколко хипотетични пътя за транспорт на антигени от мозъка към лимфната система. Един от тях е преходът на антигени от периваскуларните пространства към субарахноидалното пространство. Предполага се, че периваскуларните пространства, локализирани по протежение на големите съдове на мозъка, са еквивалент на лимфната система в мозъка. Вторият път е по протежение на белите влакна - през етмоидната кост в лимфните съдове на носната лигавица. Освен това, в твърдата мозъчна обвивка има обширна мрежа от лимфни съдове. Непропускливостта на кръвно-мозъчната бариера за лимфоцитите също е доста относителна. Доказано е, че активираните лимфоцити са способни да произвеждат ензими, които влияят на пропускливостта на структурите на мозъчния "имунен филтър". На нивото на посткапиларните венули, активираните Т-хелпери проникват през непокътнатата кръвно-мозъчна бариера. Тезата за липсата на клетки в мозъка, които представляват антигени, не издържа на критика. В момента е убедително доказана възможността за представяне на антигени в ЦНС от поне три вида клетки. Първо, това са дендритни клетки, получени от костен мозък, които са локализирани в мозъка по протежение на големите кръвоносни съдове и в бялото вещество. Второ, антигените са способни да представят ендотелни клетки на мозъчни кръвоносни съдове и във връзка с MHC антигени, което подпомага клоналния растеж на Т-клетки, специфични за тези антигени. Трето, микро- и астроглиалните клетки действат като антиген-представящи агенти. Участвайки във формирането на имунния отговор в централната нервна система, астроцитите придобиват свойствата на имунна ефекторна клетка и експресират редица антигени, цитокини и имуномодулатори. Когато се инкубират с γ-интерферон (γ-INF), астроглиалните клетки in vitro експресират MHC антигени клас I и II, а стимулираните астроцити са способни на антигенно представяне и поддържане на клонална пролиферация на лимфоцити.

Травма на мозъчната тъкан, следоперативно възпаление, оток и фибринови отлагания, съпътстващи трансплантацията на ембрионална нервна тъкан, създават условия за повишена пропускливост на кръвно-мозъчната бариера с нарушена автотолерантност, сенсибилизация и активиране на CD3+CD4+ лимфоцити. Представянето на авто- и алоантигени се осъществява от астроцити и микроглиални клетки, които реагират на y-INF чрез експресия на MHC молекули, ICAM-1, LFA-I, LFA-3, костимулаторни молекули B7-1 (CD80) и B7-2 (CD86), както и секреция на IL-la, IL-ip и y-INF.

Следователно, фактът за по-дългото оцеляване на ембрионалната нервна тъкан след интрацеребрална трансплантация, отколкото след периферното ѝ приложение, трудно може да се свърже с липсата на иницииране на трансплантационен имунитет. Освен това, моноцитите, активираните лимфоцити (цитотоксични CD3+CD8+ и Т-хелперни клетки) и произвежданите от тях цитокини, както и антителата към антигени на периферния трансплантат на ембрионална нервна тъкан, играят основна роля в процеса на неговото отхвърляне. Ниското ниво на експресия на MHC молекули в ембрионалната нервна тъкан е от определено значение за създаването на условия за по-дълга резистентност на невротрансплантатите към Т-клетъчните имунни процеси. Ето защо в експеримента имунното възпаление след трансплантация на ембрионална нервна тъкан в мозъка се развива по-бавно, отколкото след кожна присадка. Въпреки това, пълно разрушаване на отделни трансплантати на нервна тъкан се наблюдава след 6 месеца. В този случай Т-лимфоцитите, ограничени от MHC антигени клас II, са локализирани предимно в зоната на трансплантация (Nicholas et al., 1988). Експериментално е установено, че по време на ксенологична невротрансплантация, изчерпването на Т-хелперите (L3T4+), но не и на цитотоксичните Т-лимфоцити (Lyt-2), удължава оцеляването на нервната тъкан на плъхове в мозъка на реципиентните мишки. Отхвърлянето на невротрансплантата е съпроводено с неговата инфилтрация от макрофаги и Т-лимфоцити на гостоприемника. Следователно, макрофагите на гостоприемника и активираните микроглиални клетки действат in situ като антиген-представящи имуностимулиращи клетки, а повишената експресия на донорските MHC клас I антигени засилва убийствената активност на цитотоксичните Т-лимфоцити на реципиента.

Няма смисъл да се анализират многобройните спекулативни опити да се обясни фактът на отхвърляне на невротрансплантат с реакцията на имунната система на реципиента към ендотелните клетки или глиалните елементи на донора, тъй като дори чисти линии от неврални прогениторни клетки са подложени на имунна атака. Прави впечатление, че експресията на Fas лиганди от мозъчни клетки, които се свързват с апоптозни рецептори (Fas молекули) върху Т-лимфоцити, инфилтриращи мозъка, и индуцират тяхната апоптоза, играе важна роля в механизмите за по-дълго оцеляване на трансплантата в рамките на ЦНС, което е типичен защитен механизъм на трансбариерните автоимуногенни тъкани.

Както правилно отбелязват В. Цимбалюк и съавтори (2001), трансплантацията на ембрионална нервна тъкан се характеризира с развитие на възпаление с участието на клетки, сенсибилизирани към мозъчни антигени и активирани клетки, антитела, а също и в резултат на локално производство на цитокини. Важна роля в това играе предварително съществуващата сенсибилизация на организма към мозъчни антигени, която се случва по време на развитието на заболявания на ЦНС и може да бъде насочена към трансплантационни антигени. Ето защо наистина дългосрочното оцеляване на хистонесъвместимите невротрансплантати се постига само чрез потискане на имунната система с циклоспорин А или чрез въвеждане на моноклонални антитела към CD4+ лимфоцитите на реципиента.

По този начин много проблеми на невротрансплантацията остават нерешени, включително тези, свързани с имунологичната съвместимост на тъканите, които могат да бъдат решени само след целенасочени фундаментални и клинични изследвания.