Хемопоетични стволови клетки от кръв от пъпна връв

Кръвта от пъпна връв е добър източник на хемопоетични стволови клетки по отношение на пролиферативния потенциал и способността им за репопулация. Многократно е доказано, че към момента на раждането кръвта от пъпна връв съдържа достатъчно голям брой слабо ангажирани хемопоетични прогениторни клетки. Някои автори смятат, че предимството на трансплантацията на хемопоетични стволови клетки от кръв от пъпна връв е липсата на необходимост от търсене на донор, съвместим с HLA антигени. Според тях незрялостта на имунната система на новороденото причинява намалена функционална активност на имунокомпетентните клетки и съответно по-ниска честота на тежка реакция на присадка срещу гостоприемник, отколкото при трансплантация на костен мозък. В същото време, процентът на преживяемост на трансплантация на клетки от кръв от пъпна връв не е по-нисък от този на клетките от костен мозък, дори в случай на използване на по-малък брой HSCs, прилагани на 1 kg телесно тегло на пациента. Според нас обаче, въпросите за оптималния брой трансплантирани клетки от пъпна кръв, необходими за ефективно присаждане в тялото на реципиента, тяхната имунологична съвместимост и редица други аспекти на проблема с трансплантацията на хемопоетични стволови клетки от пъпна кръв, изискват по-сериозен анализ.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Получаване на хематопоетични стволови клетки от кръв от пъпна връв

Процедурата за получаване на хемопоетични стволови клетки от кръв от пъпна връв изисква събирането ѝ веднага след раждането на детето и отделянето ѝ от плацентата, когато плацентата е in utero или ex utero, както и по време на цезарово сечение, но и ex utero. Доказано е, че ако времето от момента на раждането до отделянето на новороденото от плацентата се намали до 30 секунди, обемът на получената кръв от пъпна връв се увеличава средно с 25-40 мл. Ако тази процедура се извърши по-късно, се губи същото количество кръв. Установено е, че ранното отделяне на детето от плацентата не води до никакви негативни последици за новороденото.

Руският изследователски институт по хематология и трансфузиология е разработил ефективни и нискобюджетни технологии за получаване на кръв от пъпна връв както по време на нормално раждане ((70,2+25,8) мл), така и при цезарово сечение ((73,4+25,1) мл). Предложен е метод за отделяне на кръв от пъпна връв с достатъчно висок добив на ядрени и мононуклеарни клетки - съответно (83,1+9,6) и (83,4+14,1)%. Усъвършенстван е метод за криоконсервиране на кръв от пъпна връв, който осигурява високо запазване на мононуклеарни клетки и CFU-GM - съответно (96,8+5,7) и (89,6+22,6)%. Определена е ефективността на дренажния метод за събиране на кръв от пъпна връв с помощта на контейнер Kompoplast-300 (Русия). Авторите са събрали кръв от пъпна връв веднага след раждането на детето и отделянето му от плацентата, в условия на поставяне на плацентата in utero или ex utero. Преди пункцията на пъпната вена, пъпната връв е третирана веднъж с 5% йодна тинктура, а след това два пъти със 70% етилов алкохол. Кръвта е потекла спонтанно през свързващите тръбички в контейнера. Процедурата по събиране е отнела не повече от 10 минути. Средният обем от 66 проби от пъпна кръв, събрани чрез дренаж, е бил (72+28) ml, а броят на левкоцитите в средния общ обем на пробата е бил (1,1+0,6) x 107. При анализ на пъпна кръв за стерилност (бактериално замърсяване, HIV-1, вируси на хепатит B и C, сифилис и цитомегаловирусна инфекция), IgG антитела срещу вируса на хепатит C са открити само в една проба. В друго проучване плацентата е поставена с феталната повърхност надолу върху специална рамка веднага след раждането, пъпната връв е третирана с 5% йоден разтвор и 75% етилов алкохол. Пъпната вена е дренирана с помощта на игла от трансфузионна система (G16). Кръвта е потекла спонтанно в контейнера. Средният обем на кръвта, събрана по този начин, е бил (55+25) ml. В работата на G. Kogler et al. (1996), кръв от пъпна връв е събрана по затворен метод и са получени големи обеми кръв - средно (79+26) мл. Авторите отбелязват, че сред 574 проби от кръв от пъпна връв, около 7% съдържат по-малко от 40 мл кръв, което не позволява да бъдат използвани за трансплантация. К. Исояма и др. (1996), събирайки кръв от пъпна връв чрез активна ексфузия с помощта на спринцовки, са получили средно 69,1 мл кръв (обемът на кръвта от пъпна връв е варирал от 15 до 135 мл). Накрая, А. Абдел-Магед П.И. и др. (1997) са успели да получат средно 94 мл кръв от пъпна връв (от 56 до 143 мл) чрез катетеризация на пъпната вена.

За да се намали рискът от ятрогенна инфекция и замърсяване с майчини секрети, е разработена затворена система за събиране на кръв, базирана на широко използваната трансфузионна система на Baxter Healthcare Corp., Диърфийлд, Илинойс (САЩ), съдържаща 62,5 ml CPDA (цитрат-фосфат-декстроза с аденин) като антикоагулант. Технологията за получаване на материала е от първостепенно значение за приготвянето на висококачествена проба по отношение на обем, съдържание и чистота на клетъчната суспензия. От съществуващите методи за събиране на кръв от пъпна връв, които условно се класифицират като затворени, полуотворени и отворени системи, предпочитание трябва да се даде на първия, тъй като затворената система значително намалява риска от микробно замърсяване на материала, както и замърсяване на клетъчната суспензия с майчини клетки.

А. Наглер и др. (1998) провеждат сравнителен анализ на ефективността на трите системи за събиране на кръв от пъпна връв. В първия вариант процедурата е проведена в затворена система чрез ексфолиране на кръв директно в контейнер. Във втория вариант кръвта от пъпна връв е получена чрез активно извличане на кръв със спринцовка MP1, последвано от промиване на плацентарните вени и едновременно дрениране на кръвта в контейнер (отворен метод). В третия вариант кръвта е събрана в полуотворена система чрез активно извличане със спринцовки и промиване през пъпната артерия с едновременно извличане в контейнер. В първия вариант авторите получават кръв от пъпна връв в обем (76,4+32,1) ml със съдържание на левкоцити (10,5+3,6) x 10⁶ ^в 1 ml кръв. Във втория вариант съответните показатели са (174,4+42,8) ml и (8,8+3,4) x 10⁶ ^/ ml; в третата - (173,7+41,3) мл и (9,3+3,8) x 10 ⁶ /мл. Най-честата инфекция на проби от пъпна кръв е наблюдавана при използване на отворена система. Установена е пряка корелация между масата на плацентата и обема на извлечената кръв - с увеличаване на масата на плацентата, количеството на събраната кръв се увеличава.

След вземането на кръв от пъпна връв следва етапът на разделяне - изолиране на мононуклеарни клетки и пречистване на клетъчната суспензия от еритроцитите. В експериментални условия, ядрените клетки се изолират чрез утаяване с метилцелулоза по време на лизис на еритроцити с амониев хлорид. Метилцелулозата обаче не трябва да се използва за клинични цели, тъй като загубите на хематопоетични стволови клетки върху нея достигат 50-90%. Лизис на еритроцити също почти никога не се извършва в клиниката поради големите обеми на работния разтвор, въпреки че процентът на изолиране на ядрени клетки с CD34+ фенотип, както и на прогениторни клетки с функции CFU-GM и CFU-GEMM по този начин е значително по-висок. Съобщава се за появата на ново средство за изолиране на мононуклеарни клетки в градиент на плътност, разтвор на бутанова плътност (BDS72). Това вещество има следните физиологични параметри: pH - 7,4, осмолалност - 280 mOsm/kg, плътност - 1,0720 g/ml. Според авторите, той може да се използва за изолиране на до 100% от CD34-позитивните клетки и за отстраняване на 98% от еритроцитите. BDS72 обаче все още не се използва в клиниката.

В одобрените методи за изолиране на ядрени клетки от кръв от пъпна връв обикновено се използва 10% разтвор на хидроксиетил нишесте или 3% разтвор на желатин. Ефективността на утаяване на еритроцитите и изолирането на ядрени клетки и в двата случая е приблизително еднаква. Когато обаче желатинът се използва като утаяващ агент, е възможно да се получи малко по-голямо количество CFU-GM, отколкото при използване на хидроксиетил нишесте. Предполага се, че разликите в ефективността на изолирането на CFU-GM се дължат на различните скорости на утаяване на отделни фракции ядрени клетки или на способността на молекулите на хидроксиетил нишестето да се абсорбират върху повърхността на рецепторите на хематопоетичните клетки и по този начин да блокират чувствителността им към колонии-стимулиращи фактори, използвани при култивиране на CFU-GM in vitro. Въпреки това, и двата седиментатора могат да бъдат подходящи за изолиране на ядрени клетки при създаване на големи банки от кръв от пъпна връв.

Методите за отделяне и криоконсервация на кръв от пъпна връв по принцип не се различават от тези, използвани при работа с хематопоетични стволови клетки от периферна кръв и костен мозък на възрастни донори. Но при подготовката на голям брой проби от кръв от пъпна връв за нейните банки, методите за разделяне трябва, на първо място, да бъдат нискобюджетни. Затова, за съжаление, в момента за клинични нужди се използват вече изпитани рутинни методи за изолиране и криоконсервация на клетки от кръв от пъпна връв, а по-ефективните, но скъпи методи остават участ на експериментаторите.

Като цяло са одобрени критерии за оценка на броя на хематопоетичните клетки и изисквания за изследване на проби от кръв от пъпна връв за идентифициране на инфекциозни агенти. За да се гарантира безопасността на трансплантацията на хематопоетични клетки от кръв от пъпна връв, всички кръвни проби трябва да бъдат изследвани предимно за хематогенно предавани инфекции и генетични заболявания. Редица автори препоръчват допълнителни специални методи за изследване на кръв от пъпна връв за диагностициране на генетични заболявания като а-таласемия, сърповидно-клетъчна анемия, аденозин деаминазен дефицит, агамаглобулинемия на Брутон, болести на Хърлер и Понтер.

Според препоръките на L. Ticheli и съавтори (1998), всяка проба от пъпна кръв трябва да бъде изследвана за ядрени клетки, CD34-позитивни клетки и CFU-GM, да се извърши HLA типизиране и да се определи кръвната група според ABO и нейния Rh фактор. Освен това, трябва да се извърши бактериологично посяване, серологично изследване за HIV и цитомегаловирусна инфекция, HBsAg, вирусен хепатит C, HTLY-I и HTLV-II (човешка Т-клетъчна левкемия), сифилис и токсоплазмоза. Полимеразна верижна реакция (ПВР) за цитомегаловирус и HIV инфекция е задължителна.

Процедурата за получаване на кръв от пъпна връв трябва да се извършва в строго съответствие с принципите на медицинската биоетика. Преди вземането на кръв е необходимо да се получи съгласието на бременната жена за провеждането ѝ. Предварителен разговор с бременната жена за получаване на информирано съгласие за всички манипулации, от кръвопреливане до попълване на документацията, се извършва само от медицински работници. В никакъв случай не е допустимо някоя от тези процедури да се извършва от персонал с биологично, химическо, фармацевтично или друго немедицинско образование, поради нарушаване на установените норми на биоетиката и човешките права. При положителни тестове за носителство на HBsAg, наличие на антитела към причинителите на хепатит C, HIV инфекция и сифилис, кръв от пъпна връв не се събира, а проби от вече събрана кръв се отхвърлят и унищожават. Трябва да се отбележи, че носителството на латентни инфекции при новородени е много по-рядко срещано, отколкото при възрастни, следователно вероятността от хематогенен трансфер и развитие на инфекциозни усложнения по време на инфузии на хематопоетични клетки от кръв от пъпна връв е значително по-ниска, отколкото в случай на използване на костен мозък от възрастен донор за трансплантация.

Важен аспект от клиничното приложение на кръв от пъпна връв е оценката на трансплантацията, която се основава на определяне на количеството хематопоетични стволови клетки в проба от кръв от пъпна връв и дозите клетки, необходими за трансплантация. Понастоящем все още не са разработени стандарти за оптималното количество клетки от кръв от пъпна връв, необходими за трансплантация. Няма общоприета гледна точка дори по отношение на рутинни параметри като броя на CD34-позитивните клетки и CFU-GM. Някои автори оценяват потенциала на хематопоетичните клетки чрез анализ на дългосрочни култури с определяне на съдържанието на колони-образуващи единици, общи за гранулоцитите, еритроцитите, моноцитите и мегакариоцитите - CFU-GEMM.

Въпреки това, в клинична обстановка, стандартната оценка на трансплантация на кръв от пъпна връв обикновено включва само определяне на броя на ядрените или мононуклеарните клетки.

Съхранение на хемопоетични стволови клетки от пъпна кръв

Съществуват и някои проблеми в технологията за съхранение на хематопоетични клетки от пъпна връв. При криоконсервиране на хематопоетични стволови клетки, за да се постигне оптимален режим на замразяване, е необходимо обемът на пъпната кръв да се намали максимално, а също и еритроцитите да се отстранят предварително, за да се избегне хемолиза и рискът от развитие на реакция на несъвместимост за еритроцитни антигени (ABO, Rh). За тези цели са подходящи различни методи за изолиране на ядрени клетки. В началото на 90-те години на миналия век най-широко използваният метод е изолирането на ядрени клетки в градиент на плътност на базата на Ficoll с плътност 1,077 g/ml или Percoll с плътност 1,080 g/ml. Разделянето на пъпна кръв в градиент на плътност позволява изолирането предимно на мононуклеарни клетки, но води до значителни загуби на хематопоетични прогениторни клетки - до 30-50%.

Ефективността на седиментация на хидроксиетил нишесте в процеса на изолиране на хематопоетични клетки от пъпна кръв се оценява по различен начин. Някои автори посочват ниското качество на разделяне, използвайки този метод, докато други изследователи, напротив, сред всички възможни методи, дават предпочитание на изолирането на хематопоетични стволови клетки от пъпна кръв с помощта на 6% разтвор на хидроксиетил нишесте. В същото време се подчертава високата ефективност на седиментация на хематопоетичните клетки, която според някои данни достига от 84% до 90%.

Привържениците на различна гледна точка смятат, че на практика всички методи за фракциониране са свързани с големи загуби на ядрени клетки и предлагат разделянето да се извършва чрез центрофугиране, като се разделя кръвта от пъпната връв на 3 фракции: еритроцити, левкоцитен пръстен и плазма. Чрез изолиране на клетките по този начин, авторите установяват, че съдържанието на мононуклеарни клетки, ранни хематопоетични прогениторни клетки и клетки с CD34+ имунофенотип в крайна сметка възлиза съответно на 90, 88 и 100% от началното ниво. Подобни стойности за увеличението на пречистените по този метод клетки от пъпна кръв са получени и от други изследователи: след утаяване са изолирани 92% от ядрените клетки, 98% от мононуклеарните клетки, 96% от CD34-позитивните клетки и 106% от колониообразуващите единици.

В края на 90-те години на миналия век желатинът се използва широко като седиментационен агент. В клиничната практика желатинът се използва за изолиране на хематопоетични стволови клетки от кръв от пъпна връв от 1994 г. При използване на 3% желатинов разтвор, ефективността на изолиране на ядрени клетки достига 88-94%. Мащабното използване на желатин при създаването на банка от кръв от пъпна връв потвърждава неговите предимства пред други седиментационни агенти. Сравнителен анализ на ефективността на всички горепосочени методи за изолиране на ядрени клетки при условията на последователното им използване върху всяка от тестваните проби от кръв от пъпна връв доказа, че 3% желатинов разтвор е оптималният седиментационен агент по отношение на добива на мононуклеарни клетки с CD34+/CD45+ фенотип, както и по отношение на броя на CFU-GM и CFU-GEMM. Методите, използващи Ficoll градиент на плътност, както и използването на хидроксиетил нишесте и метилцелулоза, са значително по-малко ефективни, като загубите на хематопоетични клетки достигат 60%.

Разширяването на обемите на трансплантация на стволови клетки от пъпна връв е свързано не само с разработването на методи за тяхното придобиване, но и за съхранение. Съществуват много проблеми, пряко свързани с подготовката на пъпна кръв за дългосрочно съхранение и избора на оптимална технология за криоконсервация на пробите от нея. Сред тях са въпросите за осъществимостта на извършване на процедури за разделяне, използване на различни среди за криоконсервация и прилагане на методи за подготовка на размразени клетки за трансплантация. Транспортирането на проби от нативна пъпна кръв често се извършва от райони, отдалечени от хематологични центрове. В тази връзка възниква проблемът с приемливите периоди на съхранение на пъпна кръв от момента на нейното придобиване до началото на криоконсервацията, което е от особено значение при създаването на банки от пъпна кръв.

Проучване на функционалната активност на хематопоетичните клетки в кръвта от пъпна връв след дългосрочно съхранение (до 12 години) в течен азот показва, че около 95% от хематопоетичните клетки не губят високия си пролиферативен капацитет през този период. В работата на С. Юрасов и съавтори (1997) е доказано, че съхранението на кръв от пъпна връв при стайна температура (22°C) или при 4°C за 24 и 48 часа не намалява значително жизнеспособността на хематопоетичните клетки, която е съответно 92 и 88% от първоначалното ниво. Ако обаче периодът на съхранение се удължи до три дни, броят на жизнеспособните ядрени клетки в кръвта от пъпна връв намалява значително. В същото време, други проучвания показват, че при съхранение в продължение на 2-3 дни при 22 или 4°C, жизнеспособността на зрелите гранулоцити, а не на хематопоетичните клетки, страда на първо място.

Жизнеспособността на хематопоетичните стволови клетки от пъпна връв може да бъде отрицателно повлияна от компонентите на системите за събиране на кръв от пъпна връв. Анализ на ефекта на различни антикоагуланти, чийто механизъм на действие се дължи на свързването с калциеви йони (ACD, EDTA, XAPD-1) върху хематопоетичните прогениторни клетки при условия на съхранение на кръв от пъпна връв в продължение на 24 до 72 часа, разкри техния отрицателен ефект върху жизнеспособността на ядрените клетки. В тази връзка авторите препоръчват използването на PBS (фосфатен буферен разтвор) с добавяне на нативен хепарин без консервант в концентрация 20 U/ml, което според тях позволява увеличаване на периода на съхранение на нефракционирана кръв от пъпна връв до 72 часа и запазва функционалната активност на колониите, образуващи единици. Проучване на безопасността на CFU-GM и CFU-G обаче показа, че времето за съхранение на кръв от пъпна връв преди криоконсервация не трябва да надвишава девет часа. Очевидно е, че принципът, който трябва да се прилага в този случай, е, че при наличие на противоречиви данни, трябва да се използва минималният препоръчителен период за съхранение на кръв от пъпна връв и програмираното замразяване на изолираните клетки трябва да се започне възможно най-скоро.

При замразяване на хематопоетични стволови клетки от пъпна кръв, обикновено се използва 10% разтвор на DMSO като криопротектор. Въпреки това, освен изразения криопротективен ефект, диметилсулфоксидът в такава концентрация има и директен цитотоксичен ефект, дори при минимално излагане на хематопоетичните клетки от пъпна кръв. За да се намали цитотоксичният ефект на DMSO, се използва нулева температура на експозиция, увеличава се скоростта на всички манипулации и се извършват многократни промивки след размразяване на пробите от пъпна кръв.

От 1995 г. Институтът по хематология и трансфузиология към Академията на медицинските науки на Украйна развива научно направление, насочено към цялостно изследване на кръвта от пъпна връв като алтернативен източник на хемопоетични стволови клетки. По-специално, разработени са нови технологии за нискотемпературна криоконсервация на хемопоетични клетки от нефракционирана и фракционирана кръв от пъпна връв. Като криопротектор се използва нискомолекулен медицински поливинилпиролидон. Методът за криоконсервация на нефракционирана кръв от пъпна връв се основава на оригинална технология за предварителна подготовка на клетки за замразяване и метод за специална обработка на клетъчна суспензия непосредствено преди трансплантация.

Един от най-важните фактори, влияещи върху нивото на функционална активност на криоконсервираните хематопоетични стволови клетки, е скоростта на охлаждане на клетъчната суспензия, особено по време на фазата на кристализация. Софтуерният подход за решаване на проблема със скоростта и времето на замразяване предоставя големи възможности за създаване на прости и високоефективни методи за криоконсервация, без отмиване на клетъчната суспензия от криопротектори преди трансплантация.

Най-опасните етапи за жизнеспособността на клетките по време на тяхното приготвяне са етапите на директно замразяване и размразяване. При замразяване на хематопоетични клетки значителна част от тях може да бъде унищожена в момента на преход на междуклетъчната среда от течната в твърдата фаза - кристализация. За намаляване на процента на клетъчна смърт се използват криопротектори, чиито механизми на действие и криопротективна ефективност са достатъчно добре разгледани в научната литература.

Перспективна насока за оптимизиране на методите за криоконсервация на клетки от костен мозък и пъпна кръв е комбинирането на ниски концентрации на няколко криопротектора с различни механизми на действие в един разтвор, например DMSO, действащ на вътреклетъчно ниво, и хидроксиетил нишесте или албумин, които имат извънклетъчен защитен ефект.

За криоконсервация на кръвни клетки от пъпна връв традиционно се използва 20% разтвор на DMSO, който бавно се излива в клетъчната суспензия с постоянно механично разбъркване в ледена баня, докато се постигне равно (1:1) съотношение на обемите криопротектор и клетъчна суспензия. Крайната концентрация на диметилсулфоксид е 10%. След това клетъчната суспензия се охлажда в програмиран криогенен агрегат със скорост GS/мин до -40°C, след което скоростта на охлаждане се увеличава до 10°C/мин. След достигане на -100°C, контейнерът с клетъчната суспензия се поставя в течен азот (-196°C). С тази техника на криоконсервация запазването на функционално активните мононуклеарни клетки след размразяване достига 85% от първоначалното ниво.

Модификациите на методите за криоконсервация са насочени към намаляване на концентрацията на DMSO чрез добавяне на хидроксиетил нишесте (крайните концентрации на диметилсулфоксид и хидроксиетил нишесте са съответно 5 и 6%). Висока ефективност на такава комбинация от криопротектори се наблюдава при замразяване на суспензия от миелоидни клетки, и то с не по-малка цитопротекция, отколкото при използване само на 10% разтвор на диметилсулфоксид. Броят на жизнеспособните ядрени клетки достига 96,7% от началното ниво, а функционалната им активност, оценена по броя на CFU-GM, е 81,8%.

При използване на разтвор на диметилсулфоксид в концентрации от 5 до 10% в комбинация с 4% хидроксиетил нишесте (крайна концентрация), беше установено, че безопасността на CD34-позитивните клетки в такива диапазони на диметилсулфоксид остава практически непроменена. В същото време, когато концентрацията на диметилсулфоксид намалява от 5 до 2,5%, се наблюдава масивна смърт на клетки от пъпна кръв - броят на жизнеспособните клетъчни единици намалява от 85,4 до 12,2%. Други автори също стигат до заключението, че именно 5 и 10% разтвори на диметилсулфоксид (в авторския вариант - в комбинация с автоложен серум) осигуряват цитопротекция с максимална ефективност по време на криоконсервация на HSCs от пъпна кръв. Освен това, се отбелязва висока консервация на последователно замразени и размразени клетки в случай на комбинация от 5 или 10% диметилсулфоксид с 4% разтвор на хидроксиетил нишесте, особено при контролирана скорост на охлаждане от GS/мин. В друго проучване е използван криопротективен разтвор, състоящ се от три съставки - DMSO, пречистен човешки албумин и RPMI среда в съотношение 1:4:5, който е добавен към клетъчната суспензия до равно обемно съотношение (крайната концентрация на диметилсулфоксид е 5%). След размразяване във водна баня при температура +4 GS, запазването на CFU-GM надхвърля 94%.

Някои автори предлагат използването на нефракционирана кръв от пъпна връв за криоконсервация, тъй като по време на процеса на отстраняване на червените кръвни клетки се губят значителни количества хемопоетични клетки. В този вариант се използва 10% разтвор на диметилсулфоксид, за да се предпазят мононуклеарните клетки от вредното въздействие на криокристализацията. Замразяването се извършва с постоянна скорост на охлаждане от GS/мин до -80°C, след което суспензията от клетки от пъпна кръв се потапя в течен азот. Този метод на замразяване води до частичен лизис на червените кръвни клетки, така че кръвните проби не изискват фракциониране. След размразяване клетъчната суспензия се промива от свободния хемоглобин и диметилсулфоксид в разтвор на човешки албумин или в автоложен кръвен серум на пациента и се използва за трансплантация.

Запазването на хематопоетичните прогениторни клетки след размразяване на нефракционирана кръв от пъпна връв наистина е по-високо от това на фракционираната кръв от пъпна връв, но поради криостабилността на някои еритроцити, могат да възникнат сериозни проблеми след трансфузия в резултат на трансфузия на ABO-несъвместими еритроцити. Освен това обемът на съхраняваната нефракционирана кръв се увеличава значително. От клинична гледна точка, криоконсервацията на предварително изолирани и пречистени от други клетъчни фракции хематопоетични клетки от кръв от пъпна връв е все още за предпочитане.

В частност, разработен е метод за криоконсервация на фракционирани кръвни клетки от пъпна връв, позволяващ отстраняване на еритроцитите на етапа на подготовка за замразяване, при който се използва 6% разтвор на хидроксиетил нишесте като част от плазмозаместващия разтвор „Стабизол“. След размразяване, получената по този начин клетъчна суспензия е готова за клинична употреба без допълнителни манипулации.

По този начин, в момента съществуват много доста ефективни методи за криоконсервация на кръв от пъпна връв. Основната им разлика е, че кръвните проби се замразяват нефракционирани или се подлагат на разделяне на клетъчни фракции на етапа на приготвяне и се приготвят ядрени клетки без примес на еритроцити.

Трансплантация на хемопоетични стволови клетки от пъпна кръв

В края на 80-те и началото на 90-те години на миналия век е установено, че кръвта от пъпна връв, която осигурява живот на плода по време на бременност, има високо съдържание на хемопоетични стволови клетки. Относителната простота на получаване на клетки от пъпна кръв и липсата на очевидни етични проблеми допринесоха за използването на стволови клетки от пъпна кръв в практическата медицина. Първата успешна трансплантация на кръв от пъпна връв на дете с анемия на Фанкони послужи като отправна точка за разширяване на обема на трансплантациите на стволови клетки от пъпна кръв и създаване на система за нейното банкиране. В световната система от банки за кръв от пъпна връв най-големият е Нюйоркският център за плацентарна кръв, който е в баланса на Националния институт по здравеопазване на САЩ. Броят на съхраняваните проби от кръв от пъпна връв в тази банка наближава 20 000. Броят на реципиентите (предимно деца), претърпели успешна трансплантация, също нараства. Според Министерството на здравеопазването на САЩ, периодът без рецидив на посттрансплантационния живот на реципиентите на трансплантирана кръв от пъпна връв вече надхвърля 10 години.

Това не е изненадващо, тъй като многобройни изследвания на хематопоетичния потенциал на кръвта от пъпна връв показват, че по отношение на количеството и качеството на най-ранните стволови клетки, тя не само не отстъпва на костния мозък на възрастен, но и го превъзхожда в някои отношения. По-високият пролиферативен потенциал на стволовите клетки от кръв от пъпна връв се дължи на онтогенетичните особености на клетъчната сигнализация, наличието на рецептори за специфични растежни фактори върху HSC, способността на клетките от кръв от пъпна връв за автокринно производство на растежни фактори и големия размер и дължина на теломерите.

По този начин, геномните и фенотипните характеристики на хематопоетичните стволови клетки от пъпна кръв предопределят висококачествено присаждане на трансплантата с висок потенциал за възстановяване на донорската хематопоеза в тялото на реципиента.

Ползи от хематопоетичните стволови клетки от пъпна кръв

Сред реалните предимства на използването на хематопоетични стволови клетки от пъпна кръв за трансплантация пред други източници на хематопоетични клетки, заслужава да се отбележи практически нулевият риск за здравето на донора (ако не разглеждаме плацентата като такава) и липсата на необходимост от обща анестезия. Използването на кръв от пъпна връв разширява възможностите за клетъчна трансплантация поради частично HLA-съвместими трансплантации (несъвместимост от един до три антигена). Разработен е метод за дългосрочно съхранение на хематопоетични клетки от пъпна кръв в замразено състояние, което увеличава вероятността за получаване на редки HLA типове и намалява времето за търсене на HLA-съвместим трансплантат за алогенна трансплантация. В същото време рискът от развитие на някои латентни инфекции, предавани по трансмисивен път, е значително намален. Освен това, поради възможността за използване на клетки от пъпна кръв за автоложна трансплантация, възниква евтина форма на биологична животозастраховка.

Въпреки това, поради малките обеми кръв, които могат да бъдат събрани от плацентата (средно не повече от 100 мл), проблемът с получаването на максимално възможно количество кръв от вената на пъпната връв излиза на преден план при стриктно спазване на условието за минимален риск от бактериално замърсяване на получените проби от пъпна кръв.

Примитивните хематопоетични клетки от кръв от пъпна връв обикновено се идентифицират по наличието на CD34 гликофосфопротеин на повърхността им, както и въз основа на функционалните им свойства чрез изучаване на клоногенността или образуването на колонии in vitro. Сравнителният анализ показа, че в кръвта от пъпна връв и костния мозък максималното съдържание на CD34-позитивни клетки в мононуклеарната фракция е съответно 1,6 и 5,0%, максималното ниво на колони-образуващи единици в CD34+ клетъчната субпопулация е 80 и 25%, общата ефективност на клониране на CD34+ клетки е 88 и 58%, максималното съдържание на колони-образуващи клетки с висок пролиферативен потенциал (HPP-CFC в CD34+ популацията) е 50 и 6,5%. Трябва да се добави, че ефективността на клониране на CD34+CD38 клетки и способността за реагиране на цитокинова стимулация също са по-високи в хематопоетичните стволови клетки от кръв от пъпна връв.

Комбинацията от фенотипни антигени Thy-1, CD34 и CD45RA потвърждава високия пролиферативен потенциал на хематопоетичните клетки от пъпна връв, а експресията на тези три антигена върху повърхността на клетките от пъпна връв показва тяхната принадлежност към стволови клетки. Освен това беше установено, че кръвта от пъпна връв съдържа клетки с CD34+ фенотип, които нямат маркери за линейна диференциация. Нивото на клетъчни субпопулации с фенотипния профил CD34+/Lin в кръвта от пъпна връв е около 1% от общия брой CD34-позитивни клетки. Хематопоетичните прогениторни клетки от пъпна връв дават началото както на лимфоидната клетъчна линия, така и на плурипотентната миелоидна серия на линейна клетъчна диференциация, което също показва тяхната принадлежност към стволови клетки.

Както вече бе споменато, значителните разлики между костния мозък и кръвта от пъпна връв са в количеството хематопоетични клетки, използвани за трансплантация, получени по време на една процедура за събиране. Ако по време на трансплантация на костен мозък загубата на клетъчна маса по време на отделяне, криоконсервация, размразяване и тестване е приемлива в рамките на 40-50%, то за кръвта от пъпна връв такива клетъчни загуби са много значителни, тъй като ако се използва недостатъчно количество HSC, трансплантацията може да се окаже неефективна. Според G. Kogler et al. (1998), при клетъчна трансплантация с телесно тегло на реципиента 10 kg, всички проби от кръв от пъпна връв могат да бъдат потенциални трансплантати (общият брой събрани проби от кръв от пъпна връв е 2098), с телесно тегло 35 kg - 67%, а само 25% от пробите могат да осигурят ефективна трансплантация при пациенти с телесно тегло 50-70 kg. Тази клинична ситуация показва необходимостта от оптимизиране и подобряване на ефективността на съществуващите методи за събиране, възпроизвеждане и съхранение на клетки от кръв от пъпна връв. Поради това, в литературата понастоящем широко се обсъждат въпросите за стандартизиране на методите за събиране, изследване, отделяне и криоконсервиране на кръв от пъпна връв за създаване на кръвни банки, използването ѝ в клиниката, а също така се определят условията и сроковете за съхранение на хемопоетични стволови клетки от кръв от пъпна връв.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Използване на хематопоетични стволови клетки от пъпна кръв в медицината

^{Обикновено е възможно да се изолират до 10⁶} хематопоетични стволови клетки от кръв от пъпна връв, рядко повече. В тази връзка, въпросът дали такова количество хематопоетични клетки от кръв от пъпна връв е достатъчно за възстановяване на хематопоезата при възрастен реципиент, остава отворен и до днес. Мненията по този въпрос са разделени. Някои изследователи смятат, че такова количество е напълно достатъчно за трансплантация на деца, но твърде малко за трансплантация на възрастен, за когото оптималното количество е въвеждането на (7-10) x 10⁶ ^CD34 -позитивни клетки на 1 kg телесно тегло - средно 7 x 10⁶ ^на трансплантация. От тези изчисления следва, че една проба от кръв от пъпна връв съдържа 700 пъти по-малко хематопоетични стволови клетки, отколкото е необходимо за една трансплантация на възрастен пациент. Такава количествена оценка обаче се прави по аналогия с броя на трансфузираните клетки от костен мозък и изобщо не отчита онтогенетичните особености на хематопоезата.

По-специално, фактът за по-висок пролиферативен потенциал на хематопоетичните стволови клетки от пъпна връв в сравнение с хематопоетичните прогениторни клетки от костен мозък се игнорира. Резултатите от in vitro изследвания за колониообразуващ потенциал показват, че една доза от пъпна връв е способна да осигури възстановяване на хематопоезата при възрастен реципиент. От друга страна, не бива да се забравя, че броят на стволовите клетки от пъпна връв намалява дори по време на ембрионалното развитие: съдържанието на CD34-позитивни клетки в пъпната връв намалява линейно 5 пъти в периода от 20-та гестационна седмица (кръвта за изследването е взета по време на преждевременно прекъсване на бременността) до 40-та гестационна седмица (периодът на физиологичното раждане), което е съпроводено с паралелна, трайно нарастваща експресия на линейни маркери за цитодиференциация.

Поради липсата на стандартизиран подход за количествено определяне на прогениторни клетки в проби от кръв от пъпна връв, дебатите относно оптималната доза хемопоетични стволови клетки от пъпна връв продължават. Някои изследователи смятат, че броят на ядрените клетки и мононуклеарните клетки, преизчислени спрямо телесното тегло на реципиента, т.е. тяхната доза, може да се използва като критерий за избор на проби от кръв от пъпна връв. Някои автори смятат, че минималният количествен праг на CD34+ клетки дори за автотрансплантация на HSCs е 2 x 10 ⁶ /kg. В същото време, увеличаването на дозата на хемопоетичните клетки до 5 x 10 ⁶ клетки/kg (само 2,5 пъти) вече осигурява по-благоприятно протичане на ранния посттрансплантационен период, намалява честотата на инфекциозни усложнения и скъсява продължителността на превантивната антибиотична терапия.

Според Е. Глукман и др. (1998), в онкохематологията условието за успешна трансплантация на клетки от пъпна кръв е въвеждането на поне 3,7 x 10 ⁷ ядрени клетки на 1 kg телесно тегло на реципиента. Когато дозата на хемопоетичните стволови клетки се намали до 1 x 10 ⁷ или по-малко ядрени клетки на 1 kg телесно тегло на пациента, рискът от неуспех на трансплантацията и рецидив на рак на кръвта рязко се увеличава. Трябва да се признае, че минималният брой прогениторни клетки, необходими за бързо възстановяване на хематопоезата след алотрансплантация на ХСК, все още е неизвестен. Теоретично това може да се постигне с помощта на една клетка, но в клиничната практика на трансплантацията на костен мозък бързото и стабилно присаждане се гарантира чрез преливане на поне (1-3) x 10 ⁸ ядрени клетки на 1 kg телесно тегло на пациента.

Неотдавнашно подробно проучване за определяне на оптималния брой HSCs в онкохематологията включва наблюдение на пациенти в три групи, разпределени в зависимост от съдържанието на CD34-позитивни клетки в трансплантирания материал. На пациентите от първата група са прилагани (3-5) x 10⁶ ^клетки /kg. Дозата HSC при пациенти от втората група е била (5-10) x 10⁶ ^клетки /kg, а на пациентите от третата група са трансплантирани повече от 10 x 10⁶ ^CD34 + клетки/kg. Най-добри резултати са наблюдавани в групата реципиенти, получили трансплантация с брой CD34-позитивни клетки, равен на (3-5) x 10⁶ ^/ kg. При увеличаване на дозата на трансплантираните клетки над 5 x 10⁶ ^/ kg не са установени статистически значими предимства. В този случай, много високото съдържание на HSCs в трансплантата (> 10 x 10⁶ ^/ kg) е свързано с реинфузия на значителен брой остатъчни туморни клетки, което води до рецидив на заболяването. Не е установена пряка връзка между броя на трансплантираните алогенни прогениторни клетки и развитието на реакцията присадка срещу гостоприемник.

Натрупаният световен опит в трансплантацията на кръв от пъпна връв потвърждава високия им потенциал за репопулация. Скоростта на присаждане на трансплантата от кръв от пъпна връв корелира с броя на въведените ядрени клетки. Най-добри резултати се наблюдават при трансплантация на 3 x 10 ⁷ /kg, докато за костен мозък тази доза е 2 x 10 ⁸ /kg. Според данни на координиращите центрове, в края на 2000 г. в световен мащаб са извършени 1200 трансплантации на клетки от кръв от пъпна връв, главно от сродни донори (83%). Очевидно е, че кръвта от пъпна връв трябва да се разглежда като алтернатива на костния мозък за трансплантация на пациенти с хемобластози.

В същото време, неонаталният характер на източника на хематопоетична тъкан от пъпната връв вдъхва оптимизъм поради наличието на функционални характеристики на нейните HSC. В същото време, само клиничният опит може да отговори на въпроса за достатъчността на една проба от кръв от пъпна връв за възстановяване на хематопоезата при възрастен реципиент с хематопоетична аплазия. Трансплантацията на кръвни клетки от пъпна връв се използва в лечебни програми за много туморни и нетуморни заболявания: левкемия и миелодиспластични синдроми, неходжкинов лимфом и невробластом, апластична анемия, вродени анемии на Фанкони и Даймънд-Блекфан, дефицит на левкоцитна адхезия, синдром на Бар, болест на Гюнтер, синдром на Хърлер, таласемия.

Имунологичните аспекти на трансплантацията на хемопоетични клетки от пъпна кръв заслужават внимателно внимание и отделно проучване. Доказано е, че при трансплантация на стволови клетки от пъпна кръв от донори с непълна HLA съвместимост, резултатите от трансплантацията са доста задоволителни, което според авторите показва по-ниска имунореактивност на клетките от пъпна кръв в сравнение с костния мозък.

Детайлно проучване на клетъчния състав на кръвта от пъпна връв разкри характеристиките както на фенотипния спектър на ефекторните клетки на имунната система, така и на тяхната функционална активност, което позволи кръвта от пъпна връв да се разглежда като източник на HSCs с относително нисък риск от развитие на реакция „присадка срещу гостоприемник“. Сред признаците на функционална незрялост на имунокомпетентните клетки от кръвта от пъпна връв е необходимо да се отбележи дисбалансът в производството на цитокини и намалената чувствителност към цитокиновата регулация на имунния отговор. Полученото инхибиране на активността на цитотоксичните лимфоцити се счита за фактор, допринасящ за формирането на имунологична толерантност към трансплантираната хематопоетична тъкан. В популацията на лимфоцитите от кръвта от пъпна връв, за разлика от периферната кръв и костния мозък на възрастни донори, преобладават неактивни, незрели лимфоцити и супресорни клетки. Това показва намалена готовност на Т-лимфоцитите от кръвта от пъпна връв за имунен отговор. Важна характеристика на моноцитната популация от клетки от кръвта от пъпна връв е ниското съдържание на функционално пълноценни и активни антиген-представящи клетки.

От една страна, ниската зрялост на ефекторните клетки на имунната система в кръвта от пъпна връв разширява показанията за използването ѝ в клиниката, тъй като тези характеристики осигуряват намаляване на интензивността на имунния конфликт между клетките на донора и реципиента. Но, от друга страна, е известно за съществуването на корелация между степента на развитие на реакцията „присадка срещу гостоприемник“ и противотуморния ефект на трансплантацията, т.е. развитието на ефекта „присадка срещу левкемия“. В тази връзка е проведено проучване върху противотуморната цитотоксичност на клетките от пъпна връв. Получените резултати показват, че въпреки наистина отслабения отговор на имунокомпетентните клетки от пъпна връв към антигенна стимулация, лимфоцитите, които се активират предимно, са естествени убийци и подобни на убийци клетки, които участват активно в механизмите за осъществяване на противотуморна цитотоксичност. Освен това в кръвта от пъпна връв са открити субпопулации от лимфоцити с фенотиповете CD16+CD56+ и CD16"TCRa/p+. Предполага се, че тези клетки в активираната си форма осъществяват реакцията „присадка срещу левкемия“.

В Института по онкология към Академията на медицинските науки на Украйна, криоконсервирани хематопоетични клетки от пъпна кръв са прилагани на онкологично болни с персистираща хематопоетична хипоплазия, дължаща се на химио- и лъчетерапия. При такива пациенти трансплантацията на хематопоетични стволови клетки от пъпна кръв доста ефективно възстановява депресираната хематопоеза, което се вижда от трайното повишаване на съдържанието на зрели образувани елементи в периферната кръв, както и от повишаване на показателите, характеризиращи състоянието на клетъчния и хуморалния имунитет. Стабилността на ефекта на репопулация след трансплантация на хематопоетични клетки от пъпна кръв позволява продължаване на лъчетерапията и химиотерапията без прекъсване на курса на лечение. Има информация за по-висока ефективност на алотрансплантацията на стволови клетки от пъпна кръв при онкохематологични пациенти: годишният риск от рецидив на туморно заболяване при тяхното използване е 25% спрямо 40% при пациенти с трансплантиран алогенен костен мозък.

Механизмът на действие на криоконсервираните стволови клетки от пъпна кръв трябва да се разглежда като резултат от хуморална стимулация на хематопоезата на реципиента, причинена от уникалната способност на неонаталните клетки за автокринно производство на хематопоетични растежни фактори, както и като следствие от временно присаждане на донорски клетки (както се вижда от достоверно повишаване на съдържанието на фетален хемоглобин в периферната кръв на реципиентите на 7-15-ия ден след трансфузията в сравнение с първоначалните данни). Липсата на посттрансфузионни реакции при реципиентите на пъпна кръв е резултат от относителната толерантност на нейните имунокомпетентни клетки, както и критерий за доверие в биологичната адекватност на криоконсервирания материал.

Прогениторните клетки-убийци на Т-лимфоцитите от пъпна кръв са способни да се активират под въздействието на екзогенна цитокинова стимулация, което се използва за разработване на нови ex vivo и in vivo методи за индуциране на противотуморна цитотоксичност на трансплантирани лимфоидни елементи за последваща имунотерапия. Освен това, „незрялостта“ на генома на имунокомпетентните клетки от пъпна кръв позволява те да бъдат използвани за засилване на противотуморната активност чрез методи на молекулярно моделиране.

Днес кръвта от пъпна връв е намерила широко приложение предимно в детската хематология. При деца с остра левкемия, алотрансплантацията на хемопоетични стволови клетки от пъпна връв, в сравнение с алотрансплантацията на костен мозък, значително намалява честотата на реакцията „присадка срещу гостоприемник“. Това обаче е съпроводено с по-дълъг период на неутро- и тромбоцитопения и, за съжаление, по-висока 100-дневна смъртност след трансплантацията. По-дългият период на възстановяване на нивата на гранулоцитите и тромбоцитите в периферната кръв може да се дължи на недостатъчна диференциация на отделни субпопулации от CD34-позитивни клетки от пъпна връв, както се вижда от ниското ниво на абсорбция на радиоактивен родамин и ниската експресия на CD38 антигени на тяхната повърхност.

В същото време, трансплантацията на хемопоетични стволови клетки от пъпна връв на възрастни пациенти, извършена поради липсата както на съвместим несвързан донор на костен мозък, така и на възможност за мобилизиране на автоложни ХСК, показа висока едногодишна преживяемост без рецидив в групата на пациентите под 30-годишна възраст (73%). Разширяването на възрастовия диапазон на реципиентите (18-46 години) доведе до намаляване на преживяемостта до 53%.

Количественият анализ на клетки с CD34+ фенотип в костен мозък и кръв от пъпна връв разкри по-високото им (3,5 пъти) съдържание в костния мозък, но в кръвта от пъпна връв е отбелязано значително преобладаване на клетки с фенотипния профил CD34+HLA-DR. Известно е, че кръвните клетки с имунологични маркери CD34+HLA-DR пролиферират по-активно от клетките с имунофенотип CD34+HLA-DR+, което е потвърдено в експериментални изследвания на растежа на дългосрочна култура на хематопоетични клетки in vitro. Примитивни клетъчни прекурсори с CD34+CD38 фенотип се съдържат както в кръвта от пъпна връв, така и в костния мозък, но клетките от кръвта от пъпна връв с набор от маркери CD34+CD38 имат по-висока клоногенна активност от хематопоетичните клетки със същия фенотип, изолирани от костния мозък на възрастни донори. Освен това, клетките от пъпна кръв с имунофенотип CD34+CD38 пролиферират по-бързо в отговор на стимулация с цитокини (IL-3, IL-6, G-CSF) и произвеждат 7 пъти повече колонии в дългосрочни култури, отколкото клетките от костен мозък.

Банки за стволови клетки от пъпна кръв

За правилното развитие на нова област на практическата медицина - трансплантацията на стволови клетки от пъпна кръв, както и за прилагането на трансплантации на хемопоетични стволови клетки от костен мозък, е необходимо да има обширна мрежа от кръвни банки, каквито вече са създадени в САЩ и Европа. Вътрешните мрежи от банки за пъпна кръв са обединени от Асоциацията на банките Netcord. Целесъобразността на създаването на международна асоциация на банките за пъпна кръв се определя от факта, че за извършване на несвързани трансплантации са необходими голям брой типизирани проби от пъпна кръв, което позволява избор на HLA-идентичен донор. Само създаването на система от банки със съхранение на кръвни проби от различни HLA типове може реално да реши проблема с намирането на необходимия донор. Организирането на такава система от банки за пъпна кръв изисква предварително разработване на етични и правни норми, които в момента се обсъждат на международно ниво.

За да се създадат банки за кръв от пъпна връв в Украйна, трябва да се разработи цяла поредица от разпоредби и документи.

На първо място, това са въпросите за стандартизация на методите за събиране, фракциониране и замразяване на кръв от пъпна връв. Необходимо е да се регулират правилата за събиране на кръв от пъпна връв в родилните домове в съответствие с изискванията на медицинската етика, да се определи минималният обем кръв от пъпна връв, който осигурява успешна трансплантация. Необходимо е да се сравнят и стандартизират различни критерии за оценка на качеството и количеството на хематопоетичните прогениторни клетки, както и методите за HLA типизиране и диагностичните методи за генетични и инфекциозни заболявания, които могат да се предават по време на инфузия на клетки от пъпна връв, да се установят общи критерии за подбор на здрави донори. Струва си да се обсъдят и въпросите за създаването на отделни складове за серум, клетки и ДНК, получени от кръв от пъпна връв.

Абсолютно необходимо е да се организира компютърна мрежа от данни за кръв от пъпна връв, която да се свърже с регистрите на донорите на костен мозък. За по-нататъшното развитие на клетъчната трансплантология е необходимо да се разработят специални протоколи за сравняване на резултатите от трансплантация на кръв от пъпна връв и костен мозък от HLA-идентични роднини и несвързани донори. Стандартизацията на документацията, включително информираното съгласие на родителите, както и уведомяването на майката или роднините за генетични и/или инфекциозни заболявания, открити при детето, може да помогне за решаването на етичните и правните проблеми на клиничното използване на клетки от кръв от пъпна връв.

Определящото условие за развитието на клетъчната трансплантология в Украйна ще бъде приемането на Националната програма за донорство на стволови клетки и развитието на международно сътрудничество с други страни чрез Световната асоциация на донорите на костен мозък (WMDA), Националната програма за донорство на костен мозък на САЩ (NMDP) и други регистри.

Обобщавайки все още кратката история на развитието на трансплантацията на хемопоетични стволови клетки от пъпна връв, отбелязваме, че първите предположения за възможността за използване на пъпна връв в клиника, изразени още в началото на 70-те години, са потвърдени през 80-те години от резултатите от експериментални изследвания върху животни, а през 1988 г. е извършена първата в света трансплантация на хемопоетични клетки от пъпна връв на човек, след което започва да се създава глобална мрежа от банки от пъпна връвна кръв. За 10 години броят на пациентите с трансплантирани хемопоетични клетки от пъпна връв наближава 800. Сред тях са пациенти с различни заболявания от туморен (левкемия, лимфом, солидни тумори) и нетуморен (вродени имунодефицити, анемия, заболявания, свързани с метаболитни нарушения) характер.

Съдържанието на ранни и ангажирани клетъчни прекурсори в кръвта от пъпна връв е по-високо, отколкото в периферната кръв на възрастен. По отношение на броя на гранулоцитно-макрофагните колониообразуващи единици и техния пролиферативен потенциал, кръвта от пъпна връв значително превъзхожда периферната кръв на възрастни дори след въвеждането на растежни фактори. В дългосрочни клетъчни култури in vitro е отбелязана по-голяма пролиферативна активност и жизнеспособност на клетките от кръвта от пъпна връв, отколкото на клетките от костен мозък. Критични моменти при трансплантацията на стволови клетки от кръв от пъпна връв са броят и хематопоетичният потенциал на ядрените клетки, наличието на цитомегаловирусна инфекция, HLA съвместимостта на донора и реципиента, телесното тегло и възрастта на пациента.

Трансплантацията на стволови клетки от пъпна кръв обаче трябва да се разглежда като алтернатива на трансплантацията на костен мозък за лечение на тежки кръвни заболявания, предимно при деца. Клиничните проблеми на трансплантацията на клетки от пъпна кръв постепенно се разрешават - вече съществуват доста ефективни методи за събиране, отделяне и криоконсервиране на клетки от пъпна кръв, осигуряват се условия за формиране на банки от пъпна кръв и се усъвършенстват методите за тестване на ядрени клетки. 3% разтвор на желатин и 6% разтвор на хидроксиетил нишесте трябва да се считат за оптимални за разделяне по време на мащабно набавяне на хемопоетични стволови клетки от пъпна кръв при създаване на банки.

П. Перехрестенко и съавтори (2001) правилно отбелязват, че трансплантацията на стволови клетки от пъпна кръв трябва да заеме достойно място в комплекса от терапевтични мерки за преодоляване на хематопоетичните депресии с различен генезис, тъй като стволовите клетки от пъпна кръв имат редица значителни предимства, сред които най-важни са относителната простота на тяхното набавяне, липсата на риск за донора, ниското замърсяване на неонаталните клетки с вируси и сравнително ниската цена на трансплантацията. Някои автори посочват, че трансплантацията на клетки от пъпна кръв е по-рядко съпроводена с усложнения, свързани с реакцията присадка срещу гостоприемник, отколкото трансплантацията на клетки от костен мозък, което според тях се дължи на слабата експресия на HLA-DR антигени върху клетките от пъпна кръв и тяхната незрялост. Основната популация от ядрени клетки в пъпната кръв обаче са Т-лимфоцитите (CD3-позитивни клетки), чието съдържание е около 50%, което е с 20% по-малко, отколкото в периферната кръв на възрастен, но фенотипните разлики в Т-клетъчните субпопулации от тези източници са незначителни.

Сред факторите, пряко влияещи върху процента на преживяемост при трансплантация на стволови клетки от пъпна връв, заслужава да се отбележи възрастта на пациентите (най-добри резултати се наблюдават при реципиенти на възраст от една до пет години), ранната диагностика на заболяването и формата на левкемия (ефективността е значително по-висока при остра левкемия). От голямо значение са дозата на ядрените клетки от пъпна връв, както и тяхната HLA съвместимост с реципиента. Не е случайно, че анализът на клиничната ефективност на трансплантацията на HSC от пъпна връв в онкохематологията показва най-добри резултати от лечението при използване на сродни трансплантации: едногодишната преживяемост без рецидив в този случай достига 63%, докато при несродна трансплантация - само 29%.

По този начин, наличието на голям брой стволови клетки в кръвта от пъпна връв и високият капацитет за репопулация на неонаталните хематопоетични стволови клетки позволяват те да бъдат използвани за алогенна трансплантация при онкохематологични пациенти. Трябва да се отбележи обаче, че възстановяването на хематопоезата след трансплантация на хематопоетични клетки от пъпна връв е „разтегнато във времето“: възстановяването на съдържанието на неутрофили в периферната кръв обикновено се наблюдава до края на 6-та седмица, а тромбоцитопенията обикновено изчезва след 6 месеца. Освен това, незрялостта на хематопоетичните клетки от пъпна връв не изключва имунологични конфликти: тежка остра и хронична реакция на присадка срещу гостоприемник се наблюдава съответно при 23 и 25% от реципиентите. Рецидиви на остра левкемия до края на първата година след трансплантация на клетки от пъпна връв се наблюдават в 26% от случаите.

[ 10 ], [ 11 ]