Експериментални модели на остеоартрит

Хрущялът е много специализирана тъкан, съдържаща само един тип клетки (хондроцити), характеризираща се с липсата на кръвни и лимфни съдове. Храненето на хрущяла се извършва предимно чрез абсорбция от синовиалната течност. Метаболизмът на хондроцитите се регулира от редица разтворими фактори, продуцирани локално от хондроцитите и околните тъкани. Функцията на хондроцитите също зависи от състава на извънклетъчната среда (кислородно напрежение, йонна концентрация, рН и т.н.), VCM състав, взаимодействие на клетките и матриците, физически сигнали. Основната задача на експерименталното моделиране е създаването на култури в извънклетъчната среда без промяна на фенотипа на зрелите клетки. Втората задача е да се създадат култури за изучаване на преждевременната, забавена, кратка или дългосрочна реакция на хондроцитите на химически и / или физически сигнали. Изследвания ин витро и дават възможност да се изследва поведението на хондроцитна при остеоартрит. Третата задача е разработването на ко-лечебни системи, които позволяват да се изследват взаимодействията на различните тъкани в ставата. Четвъртата задача е подготовката на хрущялни импланти за последваща трансплантация. И накрая, петата задача е да се изследват растежни фактори, цитокини или терапевтични средства, които са способни да стимулират ремонта и / или да потискат резорбцията на хрущяла.

През последното десетилетие, създадени различни модели на ставните хрущяли клетъчни култури, сред тях - монослоеве, окачен култура, култура hondronov, експлантанти, съвместно отглеждане, безсмъртната клетъчна култура. Всяка култура има своите предимства и недостатъци и всяка от тях е подходяща за изучаване на един особен аспект на метаболизма на хондроцитите. Следователно хрущялните експланти са отличен модел за изследване на оборота на матричните елементи, който изисква истински рецептори на клетъчната повърхност и нормални взаимодействия на клетъчна матрица и матрикс-клетка. В същото време се препоръчва изследването на депозитите в матрицата или механизмите за регулиране на метаболизма на хондроцитите да се извършва върху култура от изолирани клетки. Еднослойна култура с ниска плътност е необходима за изучаване на процеса на клетъчна диференциация. Културите, суспендирани в естествена или синтетична матрица, са модел за анализ на адаптивния отговор на хондроцитите към механичното напрежение.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Хондроцитни култури

При избора на хрущялна тъкан за in vitro изследвания, трябва да се имат предвид няколко важни точки. Матричната композиция и метаболитната активност на хондроцитите варират в различните стави, а последната зависи и от дълбочината на хондроцита в тъканта. Тези данни са получени в няколко експеримента, в които са изследвани изолирани субпопулации на хондроцити от хрущялните зони от различни дълбочини. Съществуват редица морфологични и биохимични разлики между култивираните хондроцити, разположени в повърхността и дълбоките слоеве на ставния хрущял. Повърхностните клетки синтезират рядка изчерпана протеогликанова фибриларна матрица, докато по-дълбоките клетки продуцират матрица, богата на фибрили и протеогликани. Освен това, повърхностни клетки произвеждат сравнително по-малки неагрегираните протеогликани и хиалуронова киселина и агрекан и относително малък кератан сулфат, по-дълбоко разположени хондроцитите. Друга важна отличителна черта на метаболизма на хондроцитите, изолирани от хрущялните зони от различни дълбочини, е реакцията към екзогенния стимул. Според М. Айделот и съавтори, бикон хоцитите от повърхностната зона на хрущяла са по-чувствителни към IL-1, отколкото клетките в дълбоката зона.

Поведението на клетките също зависи от местоположението на тъканта. Хондроцити хрущялни и ушни ръбове, взети от същото животно, които реагират различно на растежни фактори, като например фибробластен растежен фактор (FGF), и TGF-бета. FGF увеличава включването на тимидин, пролин и левцин в хондроцитната култура на реброто, но не и в ушите. TGF-P увеличава включването на тимидин в хрущялни хондроцити ребро и ухо, но няма ефект върху тимидин в хондроцити и пролин ухо. Хрущялните клетки, получени от зоните с най-голям товар, се различават от тези от местата с ниско натоварване на хрущяла. Например, зрели хондроцити на хрущяла на коляното от централната област на овце ставния тибиалната кост повърхност не са обхванати от менискуса, който носи най-голямото натоварване ин виво, по-малък синтезира агрекан, декорин, но по-голям от клетките на областите, покрити от менискуса. Авторите подчертават също, че е важно да се използва хрущял от идентични зони на ставите при изследване на синтетичната функция на ставите.

Метаболизмът на хондроцитите и техният отговор на регулаторните фактори също значително зависи от възрастта на донора, развитието на неговия скелет и състоянието на ставите, от които се вземат клетките. При човешките хондроцити се наблюдава значително намаление с възрастта на пролиферативния отговор. Най-голямо намаление се наблюдава при донори на възраст 40-50 години и над 60 години. Освен това тежестта на пролиферативния отговор към растежните фактори (напр. FGF и TGF-бета) намалява по време на стареене. В допълнение към количествените промени в пролиферацията на хондроцитите има и качествени промени. Младите донорни клетки (на възраст 10-20 години) реагират по-добре на производния на тромбоцити растежен фактор (PDGF), отколкото на TGF-бета, докато противоположното се наблюдава в донорните клетки на възрастни. За да се обяснят зависимите от възрастта промени в синтетичната функция на хондроцитите и тяхната реакция към ефекта на растежните фактори, се използват няколко механизма. Сред тях намаляването на броя и афинитета на повърхностните клетъчни рецептори, промяната в синтезата и биоактивността на растежните фактори и цитокините, модификация на пострецепторните сигнали.

Патологичното състояние на ставите също променя морфологията и метаболитната активност на хондроцитите. Така че, J. Kouri и съавтори (1996) идентифицират три субпопулации на хондроцити в хрущяла с остеоартрит. Хондроцитите от повърхностната и горната среда на хрущяла образуват клъстери и синтезират повече протеогликани и колаген. TGF-бета, и инсулин-подобен растежен фактор (IGF) може да стимулира протеогликан синтез от хондроцити и частично неутрализиране на ефектите на IL-1 и TNF-а. Хрущялни експланти са страдащи от остеоартрит и хондроцитите, изолирани от хрущял на пациенти с остеоартрит, са по-чувствителни към стимулиране на TGF-бета от здрави хрущялни хондроцити. Тези разлики най-често се свързват с фенотипни промени в хондроцитите в горните слоеве на ставния хрущял.

Изолирането на отделните хондроцити се постига чрез последователно третиране с протеолитични ензими на ЕСМ. След освобождаването им от ECM, изолираните клетки са идеално подходящи за изследване на синтеза на de novo матрични компоненти . Някои автори използват само клостридий колагеназа, други проинкубатират хрущяла с трипсин, проназа, ДНКаза и / или хиалуронидаза. Броят на изолираните клетки зависи от използваните ензими. По този начин, когато обработката на един на 1 г колагеназа тъкан може да се получи 1,4T0 ⁶ хондроцити, докато при използване на проназа, хиалуронидаза и колагеназа - 4,3-10 ⁶. Когато се обработват с колагеназа, агрекан, протеините, IL-6, IL-8 остават в клетъчната култура много повече, отколкото в случай на последователно третиране с различни ензими. Има няколко обяснения за тези разлики между двете клетъчни култури:

• Клетъчни рецептори повредени или депресия чрез действието на ензими, TGF-бета инхибира синтеза на ДНК на протеогликани в наскоро изолирани хондроцитите (ден 1), а ДНК и протеогликан синтеза на хондроцити култивират в монослой (7 дни), стимулирани с TGF-бета. Въпреки това, за реекспресирането на тези мембранни компоненти е необходим достатъчен период преди започването на експеримента.
• Екзогенните протеази могат да разрушат взаимодействието на клетките и матрицата, медиирани от интегрини. Фамилията на интегрини стимулира прикрепването на хондроцитите към молекулите на VKM (Shakibaei M. Et al., 1997) .Това разкъсване може да повлияе върху експресията на матричните гени.
• Остатъците от матрични компоненти могат да регулират синтетичната функция на хондроцитите. Интегрините са в състояние да разпознават продуктите от разграждането на ECM, като по този начин играят важна роля в ремонта на тъкани след излагане на протеолитични ензими. Т. Larsson et Al (1989) съобщават, че добавянето на интактни или фрагментирани протеогликани в култивирани клетки, стимулира синтеза на протеини и протеогликани. Въпреки това, високи нива на хиалуронова киселина предизвиква значително намаляване на включването на сулфат протеогликан синтез от хондроцитите пилешки ембрионални хондроцити зрял свински и хондросарком клетки на плъх. Освен това, хиалуронова киселина - инхибитор на протеогликан освобождаване от клетките дори в присъствието на IL-LB, TNF-а, FGF, което показва, че първият противодействие на биологичната активност на растежни фактори и цитокини. Точният механизъм, залегнал в действието на хиалуроновата киселина, остава неясен; Известно е, че хондроцитите съдържат рецептор за хиалуронова киселина, свързана с актинови филаменти на цитозола. Свързването на хиалуроновата киселина с нейния рецептор стимулира фосфорилирането на протеини. По този начин, тези данни демонстрират модулацията на метаболитната функция на хондроцитите чрез фрагментирани или нативни молекули на матрични протеини чрез активиране на мембранните рецепторни клетки.
• Бързото стимулиране от ензими на синтеза на матрични протеини от хондроцити може да бъде следствие от промяна във формата на хондроцити и / или реорганизация на цитоскелета.
• Някои от цитокините (напр. IL-8) и растежни фактори (напр. IGF-1, TGF-P) са фиксирани в ECM. Най-известен пример е свързването на TGF-бета с декор, което води до намаляване на способността на първия да индуцира клетъчен растеж на яйчникови клетки в китайски хамстери. Данните, че съдържанието на хрущялната декорация се увеличава с възрастта, показват намаляване на бионаличността на TGF-бета при стареене. Факторите на растежа и цитокините могат да бъдат освободени от матричните остатъци по време на култивирането и след това да модулират функцията на хондроцитите.

[8], [9], [10], [11],

Монослоева култура на хондроцити

Диференцираният фенотип на хондроцитите се характеризира основно със синтеза на колаген тип II и тъканно специфични протеогликани, както и с ниско ниво на митотична активност. Има доказателства, че дългосрочно култивиране на клетки в монослой, и след няколко повторени пасажи на клетки, хондроцити губят сферична форма, стават продълговата, фибробласт-форма. С такъв фибробластен метаплазия синтетичен функция също се модифицира клетки, характеризиращ се с прогресивно намаляване на синтезата на колагените II, IX и XI видове и подобрен синтез на колаген I, III и Utipov. Малки неагрегирани протеогликани се синтезират чрез функционален агрекан. Синтеззатезин В и L е изключително нисък в диференцирани клетки, но в процеса на загуба на диференциация се увеличава. Колагеназа-1 се експресира в диференцирани хондроцити при продължително култивиране неговата експресия се намалява докато увеличаването на производството на тъкан инхибитор на металопротеази (TIMP).

Диференцираните хондроцити ре-експресират колагена на диференцирания фенотип, когато се прехвърлят от еднослойна култура към суспендирана. Процесът на диференциация вероятно е свързан с формата на клетките. Това свойство редовно се използва от изследователи, които изучават дефектни трансплантации с автоложни хондроцити. Малък брой клетки, получени от биопсичен материал, могат да се умножат в еднослойна култура и след това да се поставят отново в триизмерна матрица преди трансплантацията. Re-експресия на специфичен фенотип дедиференциирани хондроцити мигрирали в агарозен култура, може да бъде стимулирано чрез TGF-р-освин хидроксиапатит комплекс и аскорбинова киселина.

В отговор на ефекта на растежните фактори и цитокините, хондроцитите се модифицират по време на процеса на диференциация. Клетъчният отговор към цитокини и растежни фактори се различава между недиференцирани и диференцирани хондроцити. IL-1 стимулира пролиферацията на фибробласти, докато растежът на недиференцирани хондроцити се инхибира от IL-1. Синтезът на ДНК се стимулира от IGF-1 в удължени, но не сплескани хондроцити. В диференцираните хондроцити стимулиращите ефекти на IL-1 (3 и TNF-a върху проколагеназните продукти са по-изразени, отколкото при недиференцираните.

Отглеждане на хондроцити

Култивирането на хондроцити в суспензия в течна среда или в естествена или синтетична триизмерна матрица стабилизира фенотипа на хондроцита. Клетките запазват своята сферична форма, синтезират тъканно специфични протеини. Претеглена култура на хондроцитите обикновено се препоръчва за изследване на образуването на нова периглолетна матрица. Хондроцитните култури в синтетични или естествени абсорбиращи полимери се използват за имплантиране на клетки в хрущялни дефекти, за да се стимулира регенерирането на хрущялната тъкан на ставата. Синтетичната или естествена среда за имплантируеми клетки трябва да отговаря на редица изисквания:

• Имплантите трябва да имат порьозна структура за адхезия и клетъчен растеж,
• нито самият полимер, нито продуктите от неговото разграждане, трябва да причинят възпаление или токсични реакции по време на in vivo имплантиране ,
• носителят на трансплантат трябва да може да се свърже със съседен хрущял или субхондрална кост,
• естествената или синтетичната матрица трябва да е способна да абсорбира, нейното разграждане трябва да бъде балансирано чрез регенерация на тъканите,
• За да се улесни ремонта на хрущяла, химическата структура и матричната архитектура на матрицата трябва да спомогнат за поддържането на клетъчния фенотип, кодиран от хондроцитите, и да синтезират тъканно специфични протеини,
• по време на имплантацията in vivo, е необходимо да се изследват механичните свойства на синтетичната или естествената матрица.

[12], [13], [14], [15], [16]

Суспендиране на хондроцитите в течната фаза

Cell свързване към пластмасови съдове, в който култивирането на хондроцити могат да бъдат предотвратени техните стени, покрити с разтвор на метил целулоза, агароза, хидрогел (поли-2-хидроксиетилметакрилат), или смес от колаген-агароза. При тези условия хондроцитите образуват клъстери и синтезират главно агреснови и тъканно-специфични колагени (II, IX, XI типове). Обикновено се откриват два типа клетки. Клетките, разположени в центъра, запазват сферична форма, заобиколена от добре развита ECM, което се потвърждава от хистохимичните и ултраструктурни изследвания. На периферните хондроцити има дискоидни контури, са заобиколени от рядка ECM; Малко се знае за функционалните характеристики на такива клетки.

Възможно е култивиране на хондроцити върху микроносители, поддържани при суспензия; като микроносители, използвайки декстран зърна (tsitodeks), покрити с колаген декстранови зърна (tsitodeks III), besporovye микросфери са колаген тип I (tsellagen). При тези условия на култивиране, хондроцитите се прикрепват към повърхността на микроносителя, запазват своята сферична форма и произвеждат матрично подобен материал. Освен това, използването на колаген стимулира пролиферацията на хондроцитите и реекспресирането на нормален фенотип. Следователно, култивирането на хондроцити върху микросферите на колагена може да се използва за възстановяване на клетъчния фенотип преди трансплантацията.

Друг метод за култивиране на хондроцити, суспендирани в течна среда е под формата на техните култивиране плътни гранули, състояща се от клетки (0.5-1 х 10 ^б ), получени чрез центрофугиране. Такива хондроцити са способни да произвеждат матрица, съдържаща големи количества протеогликани, II-колаген тип, но не и тип I колаген, което беше потвърдено чрез хистологично, имунохистохимично и количествени методи.

Суспендиране на хондроцитите в естествен ЕСМ

Хондроцитите да бъдат култивирани в суспензия в триизмерна матрица (мек агар, агароза, наричаме гени гел или гъба, хиалуронова киселина, фибриново лепило, алгинатни перли).

Култивираните агарозни хондроцити запазват своя нормален фенотип и синтезират колаген тип II и специфични за тъканите съвкупни агрегати. Когато се култивират в агароза, клетъчно синтезирани протеогликани се освобождават в средата в продължение на 50 дни. За сравнение - в монослойна култура клетъчната фаза е препълнена с гликозаминогликани още през първите 5-6 дни от култивирането; когато се култивира в средата след засилване на синтеза и освобождаването на гликозаминогликаните, зависимо от времето намаление на глюкозаминогликаните се случва през първите 8-10 дни. Независимо от това, поведението на хондроцитите по време на тяхното култивиране в агароза се различава от това в условията in vivo. В агарозата голям брой синтезирани Aggregan агрегати съдържат по-малки и по-малки молекули, отколкото in vivo. TGF-P стимулира синтеза на протеогликани в експланта, но намалява синтеза на агрекан в агароза.

Алгинатът е линеен полизахарид, получен от кафяви водорасли. В присъствието на двувалентни катиони, като Ca2 ^{+ йони}, този полимер става гел. Всяка хондроцитна уловени в алгинат, заобиколен от матрица на отрицателно заредени полизахариди, порите на които са сравними с тези на хиалинни хрущял. Матрицата, която се образува хондроцити в алгинатни перли, състояща се от два сегмента - тънък слой от клетъчно-свързан матрица, съответстваща на периклетъчни и териториални матриците на ставния хрущял и по-отдалечени матрица междутериториално еквивалент в родната тъкан. На 30-ия ден на културата, относителната и абсолютната обем заета от клетки, и всяка от двете отдели в шийката на алгинат е почти напълно идентични с тези на нативния хрущял. За почти трийсетден хондроцити запазват тяхната сферична форма и произвеждат агрекан, хидродинамични свойства, които са подобни на тези на агрекан молекули в матрицата на ставния хрущял и колаген молекула II, IX и XI видове. В същото време, както и други култури, суспензии, алгинатни перли върху повърхността на плоски клетки са налични, които генерират малко количество от тип I колаген молекули, освобождава директно в околната среда и не са включени в видеорекордера. В алгинатните зърна се наблюдава умерена пролиферация на хондроцити. След 8 месеца от култивиране в алгинат гел зрели хондроцити не губят метаболитна активност и продължава да се синтезират тъканно-специфичен колаген тип II и агрекан.

N. Tanaka и съавтори (1984) изследват дифузионните свойства на различни естествени молекули в алгиназата и установяват, че молекули, по-големи от 70 kD, не дифундират през алгиназата. По този начин, култивирането на клетки в алгината е подходящо за изучаване регулирането на биосинтезата на матриците и организацията на ЕСМ. Наличието на клетки, култивирани в алгината, позволява да се изследва ефектът от пептидните регулаторни фактори и фармакологичните агенти върху нивата на транскрипция, посттранскрипция и транслация.

Хондроцитите също се култивират в матрица от видовете колагенни влакна I и II. S. Nehrer и съавтори (1997) сравняват функционирането на кундроцитите на кучета в порести колаген-протеогликанови полимерни матрици, съдържащи колагени от различни типове. Те откриват важни различия в морфологията на биосинтетичната функция на хондроцитите, култивирани в колагенни матрици, съдържащи колаген тип I и II. Клетките в матрицата на колаген тип II навиват сферичната си форма, докато в колаген тип I имат фибробластна морфология. Освен това, в матрицата на колаген тип II, хондроцитите произвеждат повече гликозаминогликани. J. Van Susante et al (1995) сравняват свойствата на хондроцитите, култивирани в алгинатния и колагеновия (тип I) гел. Авторите откриват значително увеличение на броя на клетките в колагеновия гел, но от шестия ден на култивиране клетките губят характерен фенотип, превръщайки се в клетки, подобни на фибробласти. В алгинатния гел се наблюдава намаляване на броя на клетките, но хондроцитите запазват своя нормален фенотип. Количеството на колагенов гел протеогликани на клетка бяха значително по-високи, отколкото в алгинат, но се наблюдава намаление на синтеза на гел матрични елементи като се излиза от 6-тия ден на култивиране, докато в алгинат синтез продължава да расте.

Масивната триизмерна фибринова матрица е естествено вещество, което поддържа хондроцитите, претеглени в нея, в диференциран фенотип. 3D фибриновата матрица може също да се използва като носител за трансплантация на хондроцити. Предимствата на фибрина са липсата на цитотоксичност, способността за запълване на пространството, способността за залепване. Чрез хистологични и биохимични изследвания Autoren-diografii, електронна микроскопия показва, че хондроцитите в гелове фибрин запазват тяхната морфология, се размножават и произвеждат матрица дори след 2 седмици на отглеждане. Въпреки това, G. Homminga и съавторите (1993) съобщават, че след 3 дни култивиране започва разпадането на фибрина, дедефиференцията на хондроцитите прогресира.

Суспендиране на хондроцитите в изкуствен (синтетичен) ЕСМ

Хрущялни импланти за реконструктивна или ортопедична хирургия могат да бъдат получени чрез израстване на изолирани хондроцити in vitro в синтетична биосъвместима матрица.

Хондроцитите от култивирана полигликолова киселина пролиферират и поддържат нормална морфология и фенотип в рамките на 8 седмици. Компонентът на хондроцит-полигликолова киселина се състои от клетки, гликозаминогликани, колагени и има външна колагенова капсула. Въпреки това, при такива импланти има два вида колагенни молекули - I и II. Имплантите на дедиференциирани хондроцити серия от пасажи имат по-голям размер на гликозаминогликани и колаген, отколкото в имплантите на недиференцирани първични хондроцити.

L. Освободен сътр (1 993b) спрямо поведението на хондроцитни култури от човешки и говежди в влакнест полигликолова киселина (EQAP) и в раздор polilaktilovoy киселина (PPLC). След 6-8 седмици от култивирането на бичи хондроцити в HSVG или PPLC авторите наблюдаваха клетъчната пролиферация и регенерирането на хрущялната матрица. В HSBC, хондроцитите са сферични, разположени в лакуни, заобиколени от хрущялна матрица. След 8 седмици ин витро култура регенерираната тъкан съдържа до 50% сухо вещество (4% клетъчна маса, 15% гликозаминогликани и 31% колаген). В PPLK клетките са с форма на шпиндел, малко количество гликозаминогликани и колаген. В HSBC клетъчният растеж е 2 пъти по-интензивен, отколкото при РТСА. При условия in vivo, хондроцитите, отглеждани в HPVC и PPLC в продължение на 1 до 6 месеца, произвеждат хистологично подобна на хрущяла тъкан. Имплантите съдържат гликозаминогликани, тип I и тип II колагени.

Хондроцитите на плодови бикове се култивират в порьозен хидрофобен и хидрофилен полиетилен с висока плътност. След 7 дни инкубация и в двата субстрата, клетките задържат сферична форма, съдържаща главно тип II колаген. След 21 дни от култивирането се оказа, че хидрофилната матрица съдържа повече тип II колаген, отколкото хидрофобната матрица.

Хрущялната тъкан може също да бъде получена чрез култивиране в монослой върху филтри Millicell-CM. Предварителното покриване на филтрите с колаген е необходимо за закрепването на хондроитите. Хистологичното изследване на културата демонстрира натрупването на хондроцити в ЕСМ, съдържащи протеогликани и тип II колаген. Колаген тип I в такава култура не се открива. Хондроцитите в получената хрущялна тъкан имат сферична форма, но на повърхността на тъканта те са малко сплескани. Дебелината на новообразуваната тъкан се увеличава с времето и зависи от началната плътност на монослоевата клетка. При оптимални условия на култивиране дебелината на тъканта на хрущяла достига 110 μm, организацията на нейните клетки и колаген в повърхностните и дълбоките слоеве е подобна на тази на ставния хрущял. VKM съдържа приблизително 3 пъти повече колаген и протеогликани. След 2 седмици култивиране се отбелязва натрупването на матрицата-са, което прави възможно извличането на тъкан от филтъра и използването му за трансплантация.

Sims et al. (1996) изследва култивирането на хондроцити в полиетиленоксид-гел капсулиран полимерна матрица, която позволява голям брой клетки да се транспортират чрез инжектиране. Шест седмици след инжектирането в подкожната тъкан на атимични мишки се образува нов хрущял, който се характеризира морфологично с бяла опалесценция, подобна на хиалиновия хрущял. Данните от хистологични и биохимични изследвания показват наличието на активно пролифериращи хондроцити, които произвеждат ECM.

Експлантационните

Изследването на хрущялната тъкан се използва за изследване на процесите на ана- и катаболизъм в нея, хомеостаза, резорбция и ремонт. Хондроцитите в хрущялните тъканни експланти поддържат нормалния фенотип и състава на ЕСМ, подобни на тези в ставния хрущял in vivo. След 5 дни култивиране в присъствието на серум се постига постоянно ниво на синтез и естествено разграждане. Резорбция може да ускори тъканна култура и в основната култура с добавяне на серум, използвайки редица агенти, например, IL-lb, TNF-а, bakterialnyhlipopolisaharidov, производни на ретиновата киселина или активни кислородни радикали. За да се изследва ремонта на хрущяла, увреждането му се индуцира от разтворими медиатори на възпалението (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) или физическо разкъсване на матрицата.

Методът на органотипните култури е модел за изследване на in vitro ефектите на изолирани външни фактори върху хондроцитите и околните матрици. In vivo, хондроцитите рядко се намират в ECM и не се свързват помежду си. Културата на експлантантния ставен хрущял запазва тази структурна организация, както и специфичните взаимодействия между хондроците и тяхната околна извънклетъчна среда. Този модел се използва и за изследване на ефекта от механичния стрес, фармакологични агенти, растежни фактори, цитокини, хормони върху метаболизма на хрущяла.

Друго предимство на експлантацията на хрущялни тъкани е липсата на увреждане на хондроцитите от протеолитични ензими или механичен фактор, което е неизбежно, когато клетките са изолирани. Рецепторите и другите мембранни протеини и гликопротеини са защитени от увреждащи фактори.

[17], [18], [19], [20], [21]

Култура на хондроните

Hondron - структурни, функционални и метаболитен ставния хрущял единица, състояща се от хондроцитна периклетъчни матрица и капсула компактна нишка и е отговорен за хомеостазата на матрицата. Хондроните се извличат механично от хрущяла и се събират чрез няколко последователни хомогенизации с ниска скорост. Изолирани от зоните на различни дълбочини hondrony хрущял могат да бъдат разделени в четири категории: единична hondron, двоен hondrony, множествена (три или повече) линейно подредени hondrony (колона hondronov) конгестия hondronov.

Единична hondrony обикновено се намират в средните слоеве на непокътнат хрущял, близнак - на границата на средата и дълбоките слоеве линейно разположени множество hondrony типично за дълбоките слоеве на непокътнат хрущяла. Накрая, клъстерите на хондроните се състоят от случайно организирани групи от единични и сдвоени хондрони, които запазват агрегираното състояние след хомогенизиране. Hondronov клъстери представляват големи хрущялни фрагменти, обикновено съдържащ няколко радиално hondronov и колагенови фибрили, т. Е. Типичен организация, която е характерна за дълбоките слоеве на матрицата. Хондроните са имобилизирани в прозрачна агароза, което позволява да се изследва тяхната структура, молекулен състав и метаболитна активност. Hondron система - агароза разглежда като микро модел на хрущяла, който е различен от традиционната система на хондроцитна - агароза, който запазва естествения микросреда, не е необходимо да се извърши неговия синтез и монтаж. Културата на хондроните е модел за изследване на взаимодействията на клетките и матрикса в ставния хрущял при нормални и патологични състояния.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Културата на безсмъртните хондроцити

За да се създадат постоянни клетъчни линии, се използват рекомбинантни ДНК или вируси, съдържащи онкоген, които могат да направят клетката "безсмъртна". Безсмъртните хондроцити имат способността да водят до безкрайна пролиферация, поддържайки стабилен фенотип. F. Mallein-Gerin и сътр (1995) показа, че онкогенът е SV40T-индуцирана пролиферация на миши хондроцити, които по този начин продължават да експресират стабилно колагените II, IX и XI видове, както и съвместно и агрекан свързващ протеин. Обаче, такава клетъчна линия придобива способността да синтезира колаген тип I, когато се култивира в еднослойна култура или в агарозен гел.

W. Horton и съавтори (1988) описват линия безсмъртни клетки с ниско ниво на колаген тип II иРНК експресия. Тези клетки се получават чрез трансформирането им с миши ретровирус, съдържащ I-myc- и y-ra-онкогени. Този тип клетки е уникален модел за изследване на взаимодействията на ставната матрица при отсъствие на тип II колаген, както и регулиране на синтеза на колаген тип II.

Културата на хондропити с мутирали или заличени гени е удобен модел за изучаване на тяхната физиологична функция. Този модел е особено подходящ за изучаване на ролята на специфични молекули в организации хрущялната матрица или изучаване на ефектите на различни регулаторни фактори на хрущялен метаболизъм. Хондроцити дистанционно ген синтезиран тип колаген IX колагенови фибрили-широк от нормалното, което показва, че колаген тип IX регулира диаметъра на фибрили. Както е отбелязано в глава 1, наскоро открити генна мутация COLAI тип кодиране II колаген в семейства с първична генерализирана остеоартрит. За да се изследва ефекта на мутант колаген тип II в ставния матрица Р. Dharmrvaram сътр (1997) провежда трансфекция ( "замърсяване" чужда нуклеинова киселина) дефектен COL ₂ AI (аргинин при позиция 519 се заменя с цистеин) в човешки ембрионални хондроцити ин витро.

Система от коколта. В ставата, хрущялът взаимодейства с клетки от други видове, които се съдържат в синовиалната мембрана, синовиалната течност, сухожилията, сухонстралната кост. Метаболизмът на хондроцитите може да бъде повлиян от различните разтворими фактори, синтезирани от тези клетки. Така, артритният ставен хрущял се разрушава от протеолитични ензими и свободни радикали, които се произвеждат от синовиални клетки. Поради това са разработени модели за изследване на сложни взаимодействия между хрущяла и околните тъкани, които се наричат кокултура.

S. Lacombe-Gleise сътр (1995) бяха култивирани заешки хондроцити и остеобласти в системата на съвместно отглеждане (COSTAR), в която клетките се разделят микропореста мембрана (0.4 микрона) позволява обмена между двете клетъчни видове без пряк контакт. Това проучване демонстрира способността на остеобластите да стимулират растежа на хондроцитите чрез разтворими медиатори.

AM Malfait и съавтори (1994) изследват връзката между моноцитите на периферната кръв и хондроцитите. Този модел е подходящ за изучаване на процесите, медиирани от цитокини, при възпалителни артропатии (ревматоиден артрит, серонегативен спондилит и др.). Авторите на модела отделят клетките от белтъчна свързваща мембрана с пори с диаметър 0.4 μm. Проучването установи, че липополизахарид-стимулирани моноцити отработени iFNO IL-1-а, който инхибира синтеза на хондроцити агрекан и допринася за разграждането на вече синтезирани агрекан агрегати.

К. Tada сътр (1994), създаден модел на съвместно отглеждане в който ендотелните клетки в колаген (I тип) гел бяха поставени във вътрешната камера от външната камера отделена от нея с хондроцити поставят във филтър с размер на порите 0,4 микрона. В състояние на пълна изолация от външната камера, човешки ендотелиални клетки образуваха епруветки в колагенен гел в присъствието на EGF или TGF-a. С едновременното култивиране на двата вида TGF клетки, зависимото образуване на епруветките от ендотелните клетки се инхибира. Инхибирането на хондроцитите на този процес частично е елиминирано от анти-TGF-бета антитела. Може да се приеме, че TGF-бета, продуциран от хондроцитите, намалява васкуларизацията на самия хрущял.

S. Groot и съавтори (1994) едновременно култивират хондроцити от хипертрофичните и пролиферативни зони на костта на 16-дневна фетална мишка с парчета мозъчна тъкан. След 4 дни на култивиране се наблюдава трансдиференциране на хондроцити в остеобласти и начало на образуване на остеоиди. След 11 дни от култивирането, част от хрущяла се замества от костна тъкан и костната матрица е частично калцифицирана. Някои невропептиди и невротрансмитери, продуцирани от мозъчната тъкан, повлияват метаболизма на остеобластите или имат рецептори върху тях. Сред тях може да се изолира норепинефрин, вазоактивен интестинален пептид, пептид, свързан с калцитониновия ген, субстанция Р и соматостатин. Култивирани с хондроцити, части от мозъчна тъкан могат да предизвикат някои от тези фактори, които могат да индуцират процеса на трансдиференция на хондроцити в остеобласти.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Влиянието на външните фактори върху културата на хондроцитите

Ефектът на напрежението на кислорода върху метаболизма на хондроцитите

В повечето случаи хондроцитните култури се развиват при атмосферно напрежение. Независимо от това, добре е известно, че in vivo хондроцити съществуват при хипоксични условия и напрежението на кислорода варира при различни патологични състояния. По време на процеса на зреене се наблюдават значителни промени в кръвоснабдяването на епифизите. Тъй като васкуларизацията варира в различни области на плаката за растеж, кислородното напрежение в тях също се променя. C. Brighton и R. Heppenstall (1971) показват, че в плочата на тибията при зайци, напрежението на кислорода в хипертрофичната зона е по-малко, отколкото в околния хрущял. Измерванията на някои метаболитни параметри показват, че хондроцитите са в състояние бързо да реагират на локални промени в концентрацията на кислород. На първо място, при ниско кислородно напрежение, консумацията на хондроцити намалява. С намаление на кислородното напрежение от 21 до 0.04% се увеличава усвояването на глюкозата, увеличава се ензимната активност на гликолизата и синтезата на млечната киселина. Дори при ниско кислородно напрежение, абсолютното количество на АТФ, АМП и АМР остава стабилно. Тези данни показват посоката на метаболизма на хондроцитите, за да се постигне максимално икономия на енергия. Независимо от това, синтетичната активност и следователно процесите на репарация се променят при хипоксия.

Високото напрежение на кислорода влияе и върху метаболизма на хондроцитите, което води до намаляване на синтеза на протеогликани и ДНК, разграждане на матрицата на хрущяла. Тези ефекти като правило са придружени от производството на свободни кислородни радикали.

Влияние на йонната концентрация и осмотичното налягане на околната среда върху функцията на хондроцитите

В родната концентрацията на хрущял йон е значително различна от тази на други тъкани: съдържанието на натрий в извънклетъчната среда е 250 - 350 ммола, и осмоларност - 350-450 милиосмола. Когато изолиране хондроцитите от VCR и ги мъти в стандартен носител (DMEM (Minimal Essential Medium Дюлбеко - минимална основна среда на Дюлбеко) осмоларитет - 250-280,7 милиосмола) се променя рязко заобикалящата среда на клетката. Освен това концентрацията на калций и калий в стандартна среда е много по-ниска, отколкото в естествената тъкан, а концентрацията на аниони е много по-висока.

Добавянето на захароза към средата води до увеличаване на нейната осмоларност и индуцира преходно вътреклетъчно повишаване на концентрацията на Н ⁺ и калциевите аниони в цитозола. Такива вътреклетъчни промени могат да повлияят на процесите на диференциация на хондроцитите и тяхната метаболитна активност. J. Urban сътр (1993) установяват, че включването на ³⁵ 8-сулфатни и ³ H-пролин изолирани хондроцити инкубират в DMEM стандартна среда за 2-4 часа, е само 10% от тази на нативния тъкан. Интензивност Синтез достига, когато осмоларността на извънклетъчната среда на 350-400 милиосмола в наскоро изолирани хондроцити и хрущялни експланти в. Освен това обемът на хондроцитите се увеличава с 30-40% след поставяне на изолирани клетки в стандартна DMEM среда с посочената осмоларност. Въпреки това, когато култивирани хондроцити по нефизиологично осмоларност за 12-16 часа, клетките се адаптират към новата среда чрез намаляване на интензивността на срязване е пропорционално биосинтеза осмоларност на извънклетъчната среда.

P. Borgetti сътр (1995) изследва ефекта на осмоларност на извънклетъчната среда на растеж, морфологията и биосинтезата на свине хондроцити. Авторите показват, други биохимични и морфологични характеристики на хондроцити култивирани в среда с осмоларност милиосмола 0.28 и 0.38. Когато 0.48 милиосмола осмоларитет на средата по време на първите 4-6 часа на културата се наблюдава намаляване на клетъчната пролиферация и синтеза на протеини, но впоследствие настъпили възстанови тези параметри, които в крайна сметка са достигнали стойностите контрол. Когато култивиране хондроцити в среда с 0.58 милиосмола осмоларността клетки загубят способността си да поддържа физиологичен интензитет пролиферативни процеси и след 6 дни броят на хондроцити се намалява значително. При осмоларност на средата, 0,58 mosmol, се наблюдава дълбоко инхибиране на протеиновия синтез. В допълнение, когато се култивират в среда с осмоларност милиосмола 0,28-0,38 хондроцити запазват физиологичен фенотип при по-висока осмоларност (милиосмола 0,48-0,58) значителни промени в клетъчната морфология, както проявената загуба характеристика фенотип хондроцити превръщане в фибробласт подобни клетки, както и загуба на клетки, способността да се съберат матрични протеогликани. Резултатите от това изследване показват, хондроцитна отзивчивост към колебания в ограничен осмотичността на извънклетъчната среда.

Промяната в концентрацията на други йони може също да повлияе на процесите на биосинтеза в хондроцитите. По този начин, степента на включване на ³⁵ S (сулфат) се увеличава с половината с увеличаване на калиев йон концентрация от 5 тМ (концентрацията в стандартната среда на DM EM) до 10 тМ (концентрацията в ЕСМ ин виво). Концентрацията на калций под 0.5 ммол насърчава производството на колаген от зрели хондроцити рогат добитък, докато концентрацията на 1-2 тМ (съответства на концентрация в стандартната среда на DM EM) причинява значително намаляване на синтеза на колаген. Умерено увеличение на биосинтезата се наблюдава при високи нива на калций (2-10 mmol). Различни катиони участват в прикрепването на хондроцитите към протеините на VKM. По този начин магнезиевите и мангановите йони осигуряват прикрепване към фибронектин и колаген тип II, докато калциевите йони не участват в прикрепянето на хондроцитите към протеините. По този начин резултатите от описаните изследвания показват влиянието на промените в екстрацелуларните йони на калия, натрий, калция и осмоларността на средата върху биосинтетичната функция на хондроцитите, инкубирани в стандартна среда.

Влиянието на механичното напрежение върху метаболизма на хондроцитите

Имобилизирането на ставата води до обратима атрофия на хрущяла, което показва необходимостта от механични стимули за нормалния ход на метаболитните процеси в ЕСМ. В повечето случаи използваните модели на клетъчна култура съществуват при нормални атмосферни условия. М. Райт и съавтори (1996) показаха, че механичната среда влияе върху метаболизма на хондроцитите, отговорът на клетките зависи от интензивността и честотата на натоварването при компресия. Експерименти с натоварването на интактни експланти на ставния хрущял ин витро показват намаляване на синтеза на протеини и протеогликани при статично натоварване, докато динамичен товар стимулира тези процеси. Точните механизми за прилагане на механични въздействия натоварване на хрущял комплекс, и вероятно свързани с щам клетки, хидростатичното налягане, осмотичното налягане, електрически потенциал и клетъчно повърхностни рецептори за матрични молекули. За да се изследва ефекта на всеки от тези параметри, е необходимо да се създаде система, в която един параметър може да бъде променян независимо. Например, експлантираната култура не е подходяща за изучаване на клетъчната деформация, но може да се използва за изследване на цялостния ефект на налягането върху метаболитната активност на хондроцитите. Компресиране на хрущяла води до клетъчна деформация, а също така придружено от възникване на хидростатичното налягане градиент, електрически потенциал, и флуиден поток промяна физикохимични такива фактори, като съдържанието на вода в матрицата, плътността на електрически заряд, нивото на осмотичното налягане. Клетъчната деформация може да бъде изследвана като се използват изолирани хондроцити, потопени в агарозен или колагенен гел.

Разработени са няколко системи за изследване на ефекта от механичната стимулация върху културата на хондроцитите. Някои изследователи използват системи за тази цел, при които налягането се прилага върху клетъчната култура през газовата фаза. Например, JP Veldhuijzen сътр (1979), използвайки налягане над атмосферното от 13 кРа при ниска честота (0.3 Hz) в продължение на 15 минути, се наблюдава увеличаване на сАМР синтез и протеогликани и понижаване на синтеза на ДНК. R. Smith и сътр (1996) показа, че периодично експозицията на първични култури от хондроцити бик хидростатично налягане (10 МРа) при 1 Hz в продължение на 4 часа, причинени увеличаване на синтеза на агрекан и колаген тип II, докато постоянно налягане няма ефект върху тези процеси. Използвайки подобна система М. Райт и сътр (1996) съобщава, че цикличният налягане на клетъчната култура се свързва с хиперполяризация на клетъчната мембрана на хондроцити и активиране на Са ²⁺ зависими калиеви канали. По този начин ефектите от цикличното налягане се медиират от йонни канали, активирани чрез разтягане, в хондроцитната мембрана. Отговорът на хондроцитите на хидростатичното налягане зависи от условията на клетъчната култура и от честотата на приложеното натоварване. По този начин, цикличен хидростатично налягане (5 МРа) намалява включването на сулфат в хондроцитна монослой при честота от 0.05, 0.25 и 0.5 Hz, докато за честоти над включване сулфат 0.5 Hz в хрущялни експланти се увеличава.

Bushmann М. И др (1992) съобщава, че хондроцити в агарозен гел н променят биосинтеза в отговор на статични и динамични механични натоварвания, както и култивирани непокътнати органи. Авторите установяват, че механичното натоварване генерира хиперосимотичен стимул, последвано от намаляване на рН в хондроцитите.

Ефектът от механичното разтягане може да бъде изследван върху култура от клетки, потопени в гел. Силата на разтягане може да бъде създадена чрез компютърно контролиран вакуум. Когато системата е в известна степен на вакуум, на дъното на петриева паничка с култура на клетки е удължен с известно количество, максимална деформация по краищата на дъното на чашата и минимум в центъра. Протягането се предава и се култивира в петриева паничка с хондроцити. С този метод, Holm-Вал К. И др (1995) показа, че култивират в колаген (II тип) гел хондросарком клетки увеличават експресията на иРНК и ₂ -integrina. На ₂ стр _R интегрин е способен да се свързва към колаген тип II. Той се счита за механорецептор, тъй като взаимодейства с актин-свързващи протеини, като по този начин свързва ЕСМ и цитоскелета.

Ефект на рН върху метаболизма на хондроцитите

РН на интерстициалния флуид на ЕСМ на хрущялната тъкан е по-кисел, отколкото в други тъкани. А. Maroudas (1980) определя рН на ставния хрущял при 6.9. W. Diamant и съавтори (1966) откриват рН 5,5 при патологични състояния. Известно е, че хондроцитите живеят при нисък PO2, което показва важната роля на гликолизата (95% от общия метаболизъм на глюкозата) в метаболизма на тези клетки; гликолизата се придружава от производството на голямо количество млечна киселина.

В допълнение към подкисляването на околната среда от продуктите на гликолизата самите матрични компоненти са от голямо значение. Голям брой фиксирана отрицателен заряд на извънклетъчните протеогликаните модифицира йонен състав: има висока концентрация на свободни катиони (например Н ⁺, Na ⁺, К ⁺ ) и ниска концентрация на аниони (например, O2, NPHS). Освен това, под действието на механично натоварване настъпва изключване на вода от ЕСМ, което води до повишени концентрации на дълготрайни отрицателни заряди и привличат повече катиони в матрицата. Това се придружава от понижаване на рН на екстрацелуларната среда, което влияе върху вътреклетъчното рН, като по този начин се променя метаболизма на хондроцитите. R. Wilkin и A. Hall (1995) изследва ефекта на рН на екстрацелуларни и интрацелуларни среда матрица биосинтеза изолирани хондроцитите рогат добитък. Те наблюдават двойна модификация на синтеза на матрици с намаляване на рН. Леко понижаване на рН (7.4 <рН <7.1) NA50% повишен включването на ³⁵ S0 ₄ и ³ H-пролин в хондроцити, докато дълбоко подкисляване (рН <7.1) инхибира синтеза от 75% в сравнение с контрол. Създаването на същото ниско рН (6.65) с амониеви йони причинява намаление на матричния синтез само с 20%. Получените резултати показват, че модификацията на рН на средата за синтез на извънклетъчна матрица не може да бъде обяснена само чрез промени в рН на вътреклетъчната среда. Освен това, хондроцити притежават способността да регулира вътреклетъчното рН от Na ⁺ Н ⁺ топлообменник, Са ⁺ -зависима С1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS и Н ⁺ / АТРаза.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Ефект на състава на средата за култивиране върху метаболизма на хондроцитите

Средството за култивиране на хондроцитите трябва да съответства на експерименталните условия. През последните години се използва телешки серум за оптимизиране на условията на култивиране. Въпреки това, когато се използва серум, трябва да се имат предвид редица важни точки:

• външен растеж на клетките от периферията на тъканта в органовите култури,
• вариабилността на състава на серуми от различни серии,
• наличието на неизвестни компоненти в тях,
• повишен риск от смущения, артефакти в изследването на влиянието на различни биологични фактори върху метаболитната активност на клетките.

Пример за последното е изследването на ефекта на EGF върху хрущялните хондроцити при плъхове. EGF стимулира включването на ³ H-тимидин и увеличаване на съдържанието на ДНК в културата. Този ефект е по-изразен при ниски серумни концентрации (<1%), но при високи концентрации (> 7,5%) ефектът изчезва.

Известно е, че нивата на синтез и разграждане в DMEM, обогатена с телешки серум, са значително повишени в сравнение с in vivo състояния. Разликите между in vivo и in vitro метаболизма могат да бъдат причинени от разликите между синовиалната течност и средата, в която клетките се култивират. D. Lee и сътр (1997) бяха култивирани хондроцити млади бикове агароза с помощта на хранителна среда, съдържаща DMEM, обогатена с 20% телешки серум и голям брой алогенна нормална синовиална течност. Наличието на синовиална течност в средата предизвиква увеличение на броя на протеогликаните до 80% от общото количество синовиална течност. Получените резултати показват, че синовиалната течност в културата индуцира метаболитна скорост, подобна на тази in vivo, с високо ниво на синтез на гликозаминогликани и ниско ниво на клетъчно делене.

G. Verbruggen сътр (1995) показва, че синтезът на ³⁵ S-arrpeKaHa човешки хондроцити култивират в агарозен в DMEM без серум е 20-30% от нивото на синтез наблюдава в DMEM, допълнена с 10% телешки серум. Авторите определят степента, при която IGF-1, IGF-2, TGF-P или намалени производствени инсулин агрекан в среда без серум. Авторите заключават, че на 100 нг / мл инсулин, IGF-1 или IGF-2 частично намалена синтеза на агрекан до 39-53% от контролните нива. При комбинация от тези фактори не са установени синергични или кумулативни явления. В същото време, 10 нг / мл на TGF-P в присъствието на 100 нг / мл инсулин стимулират синтеза на агрекан до 90% или повече от референтното ниво. Накрая, серумният трансферин, самостоятелно или в комбинация с инсулин, не влияе на синтеза на агкрекан. Когато телешкият серум беше заменен с говежди серумен албумин, агрегатното съдържание на агрекан беше значително намалено. Обогатяването на средата за инсулинова култура, IGF или TGF-P частично възстанови способността на клетките да произвежда агрегати от агрекан. В този случай IGF-1 и инсулинът са в състояние да поддържат хомеостаза в клетъчни култури. След 40 дни на културата в среда, допълнена с 10-20 нг / мл IGF-1, протеогликан синтез се поддържа на същото ниво или дори по-висока в сравнение със среда, съдържаща 20% телешки серум. Катаболните процеси протичат бавно в среда, допълнена с IGF-1, отколкото в среда, допълнена с 0.1% разтвор на албумин, но малко по-бързо в среда, допълнена с 20% серум. В дълготрайни култури, 20 ng / ml IGF-1 поддържа стабилно състояние на клетките.

D. Lee и сътр (1993) сравнение на ефекта на състава на културалната среда (DMEM, DMEM + 20% телешки серум, DMEM + 20 нг / мл IGF-1) за синтеза на ДНК в култура на експлант хрущял, еднослойна култура и в суспензия в агарозен , Когато се култивират в агарозен в присъствието на серум автори наблюдава тенденция за групиране на хондроцити в големи концентрации. Клетките се култивират без серум и с IGF1, запазват кръгла форма в агароза, се събират в малки групи, но не образуват големи агрегати. В монослой синтеза на ДНК, е значително по-висока в серум-съдържаща среда отколкото в среда, допълнена с IGF-1; Синтезът на ДНК в последната беше много по-висок, отколкото в необузданата среда. Когато култивиране хондроцити в суспензия в агарозен в неконцентриран среда и в среда с IGF-1, няма разлика в синтеза на ДНК. В същото време суспензията култивиране хондроцити в агарозен в среда, допълнена със серум, е придружен от повишена включване на радионуклеотид ³ Н-тимидин в сравнение с други среди.

Витамин С е необходим за активирането на ензими, участващи в образуването на стабилна спирална структура на колагенните фибрили. Хондроцитите, дефицитни по отношение на аскорбиновата киселина, синтезират подхидроксилирани не-спирални прекурсори на колагена, които бавно се секретират. Въвеждането на аскорбинова киселина (50 μg / ml) причинява хидроксилиране на колаген тип II и IX и секрецията им в нормални количества. Добавянето на витамин С не повлиява нивото на синтеза на протеогликани. Следователно секрецията на колаген се регулира независимо от секрецията на протеогликаните.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]