Анализ на изпражненията за протозои

Анализът на протозои в изпражненията е група от лабораторни методи, предназначени за откриване на паразитни протозои в човешките черва. Ключовите патогени включват Giardia, чревни амеби, Cryptosporidium, Cyclospora, Cystoisospora и някои по-рядко срещани паразити. Традиционната основа за диагноза е микроскопия на нативни и оцветени препарати, използващи методи на концентрация. Този метод остава широко използван и остава стандарт за потвърждаване на много открития. [1]

Само микроскопията често е недостатъчна поради периодичното отделяне на цисти и ооцисти, ниското паразитно натоварване и човешкия фактор. Поради това широко се използват методи за бързо откриване на антигени и молекулярни тестове. Комбинирането на микроскопия с антигенни тестове или полимеразна верижна реакция повишава чувствителността и ускорява получаването на резултати. Този комбиниран подход се препоръчва от настоящите насоки и прегледи. [2]

Някои паразити не се откриват чрез рутинно изследване на изпражненията без специални багрила или специално искане. Например, Cryptosporidium и Cyclospora често се пропускат, освен ако лабораторията не използва модифицирано киселинно-устойчиво оцветяване, директна флуоресценция или молекулярни методи. Следователно, ако има клинично съмнение, лекарят трябва изрично да посочи въпросния патоген в направлението. [3]

Съвременните лаборатории все по-често предлагат мултиплексни PCR панели за диария. Те едновременно търсят бактериални, вирусни и паразитни агенти и предоставят бързи резултати. Такива панели са особено полезни при остра пътническа диария, огнища и имунокомпрометирани пациенти, но интерпретацията изисква клиничен контекст. [4]

Кога е предписан тестът?

Тестът е показан при продължителна диария, продължаваща повече от 7-10 дни, особено при загуба на тегло, подуване на корема, стеаторея, след пътуване, след пиене на непречистена вода и след контакт с болни хора. В тези сценарии вероятността от паразитна причина е по-висока и навременната диагноза позволява избора на подходящо лечение. Това е отразено в препоръките за инфекциозна диария. [5]

При имунокомпрометирани пациенти, включително тези, получаващи имуносупресия, и тези с тежко имунно увреждане, паразити като Cryptosporidium и Cystoisospora могат да причинят персистираща водниста диария и дехидратация. В такива случаи тестването трябва да се разшири и да се повтори, ако първоначалният резултат е отрицателен. Разбирането на ограниченията на всеки метод е от решаващо значение за намаляване на риска от фалшиво отрицателни резултати. [6]

Ако се подозира специфичен патоген, лекарят изисква подробен алгоритъм в направлението: концентрация плюс трихромно оцветяване за амеби и ламблии, модифицирано киселинно-устойчиво оцветяване за криптоспоридии, циклоспора и цистоизоспора, както и антигенни тестове или полимеразна верижна реакция. Този целенасочен подход увеличава процента на потвърдените диагнози. [7]

При остри огнища, при които се подозира наличието на хранителен патоген, е препоръчително да се използват панели за бърза полимеразна верижна реакция (PCR) и да се уведомят здравните власти, ако бъдат открити специфични паразити. Организираните алгоритми за вземане на проби и докладване подобряват управлението на огнищата и намаляват забавянията в диагностиката. [8]

Как да се подготвим и как правилно да съберем проба

Биоматериалът се събира в чист, сух контейнер, като се предотвратява замърсяване с урина или вода. Ако пробата се доставя в лабораторията бързо, без консервант, тя трябва да бъде доставена в рамките на 2 часа. Ако чакането е по-дълго, се използват консерванти за запазване на морфологията и антигените, като се спазват стриктно инструкциите на комплекта. Тези прости правила значително повишават информативната стойност на изследването. [9]

Класическият подход е пробата да се раздели на две части и да се консервира в 10% фиксатор от формалин и поливинилов алкохол или в разтвор на SAF, като се добави една част изпражнения към три части консервант и се разбърка добре. Този двоен протокол обхваща както концентриране, така и постоянно оцветяване. Важно е също така да се запази част от неконсервирания материал за антигенно изследване или полимеразна верижна реакция. [10]

Някои съвременни фиксатори без живак и формалин могат да заменят традиционните среди и да опростят логистиката на изхвърлянето, но тяхната пригодност за специфични методи трябва да се провери съгласно лабораторните инструкции. Не всички консерванти са съвместими с молекулярната диагностика. Формалдехидът, SAF и поливиниловият алкохол се считат за нежелани за полимеразно-верижна реакция. [11]

Преди вземане на пробата е препоръчително да се избягват лаксативи, средства, съдържащи бисмут, бариеви суспензии, антибиотици и лекарства против диария в продължение на поне 7-14 дни, освен ако не е предписано друго от лекар. Тези вещества изкривяват резултатите, нарушават визуализацията и намаляват чувствителността на методите. Пациентите трябва да следват инструкциите, предоставени от лабораторията. [12]

Таблица 1. Какво е важно по време на събиране и транспортиране

Стъпка	Какво да направите	Защо това е важно?
Събиране в чист контейнер	Без примес на урина и вода	Предотвратява разрушаването на плесента и разреждането на пробата
Консервиране по време на закъснения	1 част фекалии към 3 части консервант	Запазва морфологията и подобрява откриваемостта
Индивидуална порция без консерванти	Дръжте хладно и доставяйте бързо	Необходим за антигенни тестове и полимеразна верижна реакция
Спазване на меморандума	Избягвайте смущаващи вещества	Намалява риска от фалшиво отрицателни резултати

Въз основа на алгоритми и лабораторни насоки на Центровете за контрол и превенция на заболяванията. [13]

Колко проби трябва да бъдат представени и в какъв срок?

Протозоите се отделят с изпражненията периодично, така че традиционно се препоръчва да се представят множество проби, събрани в различни дни за период от 7-10 дни. В миналото серия от три проби се е използвала по-често, което е повишавало общата чувствителност на микроскопията. Тази стратегия все още се среща в много лабораторни насоки. [14]

Някои съвременни насоки и лаборатории препоръчват специално събиране на две проби през ден, ако се използват съвременни методи за концентриране и оцветяване. Освен това, за някои патогени, използването на антигенни тестове и полимеразна верижна реакция позволява вземането на една проба без компромис с чувствителността. Окончателното решение е на лабораторията, която взема предвид собствените си технологии. [15]

Изключенията включват целенасочено тестване за циклоспора и криптоспоридия: ако има силно съмнение, е за предпочитане да се разшири серията от тестове, тъй като рутинните методи могат да пропуснат ооцисти. Повтарянето на теста в комбинация със специални оцветители и полимеразна верижна реакция увеличава вероятността за откриване. Това е подчертано в клиничните насоки и документи за лекари. [16]

Времева рамка: Неконсервираните проби от изпражнения е най-добре да се доставят в лабораторията в рамките на 2 часа. Консервираните проби се съхраняват по-дълго съгласно инструкциите за фиксатора, но молекулярните тестове често изискват пресен или специално стабилизиран материал. Винаги следвайте инструкциите на съответната лаборатория. [17]

Какви методи се използват и какво показват те?

Микроскопията остава основният метод: използват се нативни препарати, методи за концентриране на седименти и перманентни оцветители. Трихромното оцветяване се използва широко за амеби и флагелати, докато модифицираното киселинно-устойчиво оцветяване се използва за кокцидии. Фракционното концентриране увеличава шанса за откриване на редки видове и се препоръчва като стандартна процедура. [18]

За Cryptosporidium, Cyclospora и Cystoisospora, модифицираните киселинно-устойчиви методи за оцветяване и флуоресценция значително подобряват откриването. Cyclospora също така показва автофлуоресценция, която се използва в ултравиолетова микроскопия, а ооцистите се оцветяват интензивно с „горещо“ оцветяване със сафранин. Задължително е целенасочено запитване за тези методи, ако е налице клинично съмнение. [19]

Антигенните тестове се използват за Giardia и Cryptosporidium и се предлагат под формата на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и директна флуоресценция. Те са високочувствителни и специфични в сравнение със самостоятелната микроскопия и могат да се извършват върху пресен или правилно консервиран материал. Изборът на специфичен комплект се определя от потенциалните ограничения на консервантите. [20]

Панелите с мултиплексна полимеразна верижна реакция (PCR) откриват нуклеинови киселини от множество патогени едновременно, спестявайки време и повишавайки общата чувствителност. Откриването на ДНК обаче не винаги показва активна инфекция, така че интерпретацията се основава на клиничната картина, продължителността на симптомите и факторите на експозиция. Насоките наблягат на този подход, основан на риска. [21]

Таблица 2. Патоген и оптимални методи за откриване

Патоген	Предпочитани методи
Гиардия	Концентрация плюс трихромно оцветяване, антигенни тестове, полимеразна верижна реакция
Ентамоба хистолитикум	Концентрация плюс трайни оцветявания, антигенен тест с диференциация от непатогенни видове, полимеразна верижна реакция
Криптоспоридий	Модифицирано киселинно-устойчиво оцветяване, директна флуоресценция, антигенни тестове, полимеразна верижна реакция
Циклоспора	Модифицирано киселинно-устойчиво оцветяване или "горещ" сафранин, автофлуоресценция, полимеразна верижна реакция
Цистоизоспора	Модифицирано киселинно-устойчиво оцветяване, полимеразна верижна реакция

Обобщение на методологични документи и прегледи. [22]

Как да интерпретираме резултатите и типични капани

Отрицателен единичен тест не изключва паразитоза при наличие на силно клинично съмнение. Необходими са повторни тестове, използващи методи, оптимални за специфичния патоген, и подходящ интервал от време за вземане на проби. Това е особено важно за циклоспора и криптоспоридия. Многократното вземане на проби повишава общата чувствителност. [23]

Положителният резултат изисква клинична проверка: важно е да се разграничи патогенната Entamoeba histolyticum от непатогенните видове, а също и да се вземе предвид възможността за асимптоматично носителство на определени протозои. В този случай са полезни видовете специфични антигенни тестове и молекулярната диференциация. Този подход намалява риска от свръхдиагностика. [24]

Когато се използват панели с мултиплексна полимеразна верижна реакция, лекарят съпоставя откритите агенти с клиничната картина, продължителността на заболяването и епидемиологията. Например, откриването на паразитна ДНК по време на облекчаване на симптомите не винаги изисква лечение, но в някои случаи лечението е показано, за да се предотврати продължителна прогресия и предаване. Решението се взема индивидуално. [25]

И накрая, фалшиво отрицателните резултати често са свързани с пред-аналитични грешки: замърсяване на урината, неспазване на процедурите за съхранение, забавена доставка или употреба на лекарства. Добре разработеният информационен лист за пациента и ясните инструкции за събиране значително намаляват честотата на подобни грешки. Това се потвърждава от насоките за събиране и транспортиране на биоматериал. [26]

Специални ситуации: пътуващи, деца, бременност, имунодефицит

При пътуващи с персистираща диария, продължителната ѝ продължителност, газове и стеаторея предполагат ламблиаза. Полезни са антигенни тестове и полимеразна верижна реакция. При тропическо излагане и консумация на сурови храни, търсенето на циклоспора се разширява, особено през лятото и началото на есента. Важно е целенасочено лабораторно изследване. [27]

При децата подходът е принципно същият, но при избора на тестове се взема предвид честото асимптоматично носителство на някои протозои и необходимостта от минимизиране на инвазивните процедури. За бърза проверка на Giardia и Cryptosporidium се предпочитат антигенни тестове и полимеразна верижна реакция, което намалява броя на повторните посещения. Практическите насоки подкрепят това. [28]

По време на бременност диагнозата се основава на неинвазивен анализ на изпражненията. Лечението се предписва въз основа на строги показания и само с лекарства с приемлив профил на безопасност. Стратегията за изследване се съгласува между акушер-гинеколог и специалист по инфекциозни болести, въз основа на тежестта на симптомите и гестационната възраст. [29]

При имунокомпрометирани пациенти е важно своевременно да се използват чувствителни тестове за криптоспоридии и цистоизоспора, често с многократно тестване. В някои юрисдикции положителните резултати за криптоспоридии подлежат на бързо докладване на здравните органи за епидемиологично наблюдение. Това ускорява прекъсването на веригите на предаване. [30]

Таблица 3. Кога да изберете кой метод

Клинична ситуация	Какво да попитате лабораторията
Дългосрочна диария след пътуване	Концентрация плюс трайни оцветявания, антигенен тест за Giardia и Cryptosporidium, полимеразна верижна реакция, ако е възможно
Водниста диария при имунокомпрометиран пациент	Модифицирано киселинно-устойчиво оцветяване, тест за антиген на криптоспоридиум, полимеразна верижна реакция
Сезонни огнища след консумация на пресни продукти	Целенасочено търсене на циклоспора с помощта на специални оцветители и автофлуоресценция, полимеразна верижна реакция
Отрицателна серия с голямо подозрение	Повтарящи се серии от тестове с интервал и използване на специални методи за предполагаемия патоген

Обобщение на препоръките и прегледите. [31]

Кратък информационен лист за пациента

1. Съберете изпражненията в чист контейнер, като избягвате замърсяване с урина и вода. 2) Ако доставката се забави, използвайте консерванти според указанията, обикновено 1 част изпражнения към 3 части разтвор. 3) Запазете отделна, малка, неконсервирана проба от изпражнения за антигенно изследване или полимеразна верижна реакция. 4) Ако е възможно, избягвайте приема на продукти, съдържащи бисмут, бариева суспензия, антибактериални и антидиарийни лекарства 7-14 дни преди теста – обсъдете това с Вашия лекар. Тези стъпки увеличават шансовете за точна диагноза от първия опит. [32]