Стволови клетки и регенеративна пластична медицина

Днес малко са практикуващите лекари, които не знаят за развитието на ново направление в лечението на най-тежките заболявания, досега нелечими от традиционната и алтернативната медицина. Говорим за регенеративно-пластична медицина, базирана на използването на регенеративния потенциал на стволовите клетки. Около развиващото се направление се е появила безпрецедентна научна дискусия и псевдонаучен шум, до голяма степен създадени благодарение на информационните хиперболи на световната мрежа. За много кратко време лабораторните изследвания на терапевтичните възможности на стволовите клетки надхвърлиха експеримента и започнаха активно да се въвеждат в практическата медицина, което породи множество проблеми от научен, етичен, религиозен, правен и законодателен характер. Държавните и обществените институции очевидно се оказаха неподготвени за скоростта на прехода на стволовите клетки от петриеви панички към системи за интравенозно приложение, което не е от полза нито за обществото като цяло, нито за конкретно страдащ човек. Не е лесно да се разбере невъобразимото количество информация за възможностите на стволовите клетки, както по количество, така и по качество, дори за специалисти (каквито няма, тъй като всеки се опитва сам да овладее новата научна тенденция), да не говорим за лекари, които не се занимават пряко с регенеративна пластична медицина.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Защо са необходими подобни експерименти и необходими ли са изобщо?

На пръв поглед създаването на клетъчни междувидови химери е плод на необузданата фантазия на фанатичен учен, забравил за биоетиката. Именно този подход обаче значително разшири фундаменталните ни познания за ембриогенезата, тъй като позволи да се изчисли броят на клетките, необходими за органогенезата (образуването на черния дроб, мозъка, кожата и органите на имунната система). Освен това (може би това е основното в биологията на ембрионалните стволови клетки), генетиците получиха уникален инструмент, с помощта на който може да се установи функционалното предназначение на гените по време на химеризацията на ембрионите. Първо, се използва специална техника на двойно нокаутиране, за да се „изключи“ изследваната двойка гени в ембрионалните стволови клетки. След това такива ембрионални стволови клетки се въвеждат в бластоциста и се наблюдават промените, които настъпват в тялото на развиващия се химерен ембрион. По този начин бяха установени функциите на гените sf-1 (развитие на надбъбречната жлеза и половите органи), urt-l (бъбречен анлаж), muoD (развитие на скелетната мускулатура), gata-l-4 (анлаж на еритропоезата и лимфопоезата). Освен това, човешки гени, които все още не са изследвани, могат да бъдат въведени (трансфектирани) в ембрионалните стволови клетки (ESC) на лабораторни животни, за да се определи тяхната функция с помощта на химерен ембрион.

Но, като правило, оправдаването на експеримент чрез получаване на нови фундаментални знания не намира подкрепа от широка аудитория. Нека дадем пример за приложното значение на химеризацията с помощта на ембрионални стволови клетки (ESC). На първо място, това е ксенотрансплантация, тоест трансплантация на животински органи на хора. Теоретично, създаването на химери от човешко-свински клетки ни позволява да получим животно, което е много по-близко по антигенни характеристики до донора на ESC, което в различни клинични ситуации (захарен диабет, чернодробна цироза) може да спаси живота на болен човек. Вярно е, че за това първо трябва да се научим как да върнем свойството тотипотентност на генома на зряла соматична клетка, след което тя може да бъде въведена в развиващ се свински ембрион.

Днес способността на ембрионалните стволови клетки (ESC) да се делят почти безкрайно при специални условия на култивиране се използва за получаване на тотипотентна клетъчна маса с последващата ѝ диференциация в специализирани клетки, като допаминергични неврони, които след това се трансплантират в пациент с болестта на Паркинсон. В този случай трансплантацията задължително се предшества от целенасочена диференциация на получената клетъчна маса в специализирани клетки, необходими за лечение и пречистване на последните от недиференцирани клетъчни елементи.

Както се оказа по-късно, заплахата от канцерогенеза далеч не беше единствената пречка пред клетъчната трансплантация. Спонтанно, ембрионалните стволови клетки (ESC) в ембриоидните тела се диференцират хетерогенно, т.е. образуват производни на голямо разнообразие от клетъчни линии (неврони, кератиноцити, фибробласти, ендотелиоцити). В зрителното поле на микроскопа в този случай кардиомиоцитите се открояват сред клетките с различни фенотипове, всеки от които се свива в свой собствен ритъм. За лечението на пациент обаче е необходимо да има чисти клетъчни популации: неврони - при инсулт, кардиомиоцити - при миокарден инфаркт, β-клетки на панкреаса - при захарен диабет, кератиноцити - при изгаряния и др.

Следващият етап в развитието на клетъчната трансплантология е свързан с разработването на технологии за получаване на достатъчен брой (милиони клетки) такива чисти клетъчни популации. Търсенето на фактори, причиняващи насочена диференциация на ембрионалните стволови клетки (ESC), е емпирично по природа, тъй като последователността на техния синтез по време на ембриогенезата остава неизвестна. Първоначално е установено, че образуването на жълтъчния сак се индуцира чрез добавяне на цАМФ и ретиноева киселина към културата на ESC. Хематопоетичните клетъчни линии са образувани в присъствието на 1L-3, SCF, фибробластен растежен фактор (FGH), инсулиноподобен растежен фактор (IGF-1), 1L-6 и гранулоцитен колонии-стимулиращ фактор (G-СSF) в културалната среда. Клетки на нервната система са образувани от ESC след отстраняване на LIF и фибробластния слой, който е служил като хранилка. След третиране с ретиноева киселина в присъствието на фетален серум, ESC започват да се диференцират в неврони, а кардиомиоцитите са получени чрез добавяне на диметилсулфоксид (DMSO), който осигурява целенасочено доставяне на хидрофобни сигнални молекули до клетъчното ядро. В този случай, натрупването на активни кислородни видове в културалната среда, както и електрическата стимулация, допринесоха за образуването на зрели контрактилни кардиомиоцити.

Огромни усилия и ресурси бяха изразходвани за намиране на условия за диференциация на ембрионалните стволови клетки (ESC) в инсулин-продуциращи клетки на панкреаса. Скоро обаче стана ясно, че редица специализирани клетъчни линии (панкреатични β-клетки, имунни и ендокринни клетки, адипоцити) не възникват от ESC, когато са стимулирани съгласно принципа „един стимулиращ фактор - една клетъчна линия“. Този принцип се оказа валиден само за ограничен брой клетъчни линии. По-специално, образуването на неврони може да бъде индуцирано от ретиноева киселина, мускулна клетъчна линия - от трансформиращ растежен фактор-β (TCP-β), еритроидни линии - 1L-6, моноцитно-миелоидна линия - 1L-3. Освен това, ефектите на тези фактори върху диференциацията на ESC се оказаха строго дозозависими.

Започна етапът на търсене на комбинации от растежни фактори, които биха придвижили ембрионалните стволови клетки (ESC) до по-късни етапи на ембриогенезата с образуването на мезодерма (източник на кардиомиоцити, скелетни мускули, епител на бъбречните каналчета, миелоеритропоеза и гладкомускулни клетки), ектодерма (епидермис, неврони, ретина) и ендодерма (епител на тънките черва и секреторните жлези, пневмоцити). Природата сякаш принуждаваше изследователите да се движат напред по пътя на ембриогенезата, повтаряйки нейните етапи в петриева паничка, не давайки възможност за незабавно и лесно получаване на желания резултат. И такива комбинации от растежни фактори бяха открити. Активин А в комбинация с TGF-β се оказа мощен стимулатор на образуването на мезодермални клетки от ESC, като същевременно блокира развитието на ендодерма и ектодерма. Ретиноевата киселина и комбинацията от сигнали на костномозъчен морфогенетичен протеин (BMP-4) и епидермален растежен фактор (EGF) активират образуването на екто- и мезодермални клетки, спирайки развитието на ендодерма. Наблюдава се интензивен клетъчен растеж и на трите зародишни слоя с едновременното въздействие на два фактора върху ембрионалните стволови клетки (ESCs) - хепатоцитен растежен фактор (HGF) и нервноклетъчен растежен фактор.

По този начин, за да се получат необходимите клетъчни линии, е необходимо първо да се прехвърлят ембрионални стволови клетки до етапа на образуване на клетки от някакъв зародишен слой, а след това да се избере нова комбинация от растежни фактори, способни да индуцират насочена диференциация на екто-, мезо- и ендодерма в специализирани клетки, необходими за трансплантация на пациента. Броят на комбинациите от растежни фактори днес е хиляди, повечето от тях са патентовани, някои изобщо не се разкриват от биотехнологичните компании.

Време беше да се пречистят получените клетки от недиференцирани клетъчни примеси. Клетките, диференцирани в културата, бяха маркирани с маркери на зрели клетъчни линии и преминаха през високоскоростен лазерен имунофенотипен сортировчик. Лазерният лъч ги откриваше в общия клетъчен поток и ги насочваше по отделен път. Лабораторните животни бяха първите, които получиха получения пречистен клетъчен материал. Време беше да се оцени ефективността на използването на ESC производни върху модели на заболявания и патологични процеси. Един от такива модели беше експерименталната болест на Паркинсон, която се възпроизвежда добре при животни с помощта на химични съединения, разрушаващи допаминергични неврони. Тъй като заболяването при хората се основава на придобит дефицит на допаминергични неврони, използването на заместителна клетъчна терапия в този случай беше патогенетично оправдано. При животни с експериментален хемипаркинсонизъм около половината от допаминергичните неврони, получени от ESC и въведени в мозъчните структури, се утвърдиха. Това беше достатъчно, за да намали значително клиничните прояви на заболяването. Опитите за възстановяване на функцията на увредените структури на ЦНС при експериментални инсулти, травми и дори разкъсвания на гръбначния мозък се оказаха доста успешни.

Трябва да се отбележи обаче, че почти всички случаи на успешно използване на диференцирани ESC производни за корекция на експериментална патология са предприети в острия период на симулираната патологична ситуация. Резултатите от дистанционното лечение не са толкова утешителни: след 8-16 месеца положителният ефект от клетъчната трансплантация изчезва или рязко намалява. Причините за това са съвсем ясни. Диференциацията на трансплантираните клетки in vitro или in loco morbi неизбежно води до експресия на клетъчни маркери на генетична чуждост, което провокира имунна атака от организма на реципиента. За разрешаване на проблема с имунологичната несъвместимост е използвана традиционна имуносупресия, паралелно с която клиничните изпитвания започват да осъзнават потенциала на трансдиференциацията и генетичната корекция на автоложни хематопоетични и мезенхимни стволови клетки, които не предизвикват имунен конфликт.

Какво е регенеративна пластична медицина?

Еволюцията е определила два основни варианта за края на живота на клетката - некроза и апоптоза, които на тъканно ниво съответстват на процесите на пролиферация и регенерация. Пролиферацията може да се разглежда като вид жертвоприношение, когато запълването на дефекта на увредената тъкан се случва поради заместването ѝ с елементи на съединителната тъкан: при запазване на структурната цялост, тялото частично губи функцията на засегнатия орган, което определя последващото развитие на компенсаторни реакции с хипертрофия или хиперплазия на структурните и функционалните елементи, които остават непокътнати. Продължителността на компенсационния период зависи от обема на структурните лезии, причинени от факторите на първична и вторична промяна, след което в по-голямата част от случаите настъпва декомпенсация, рязко влошаване на качеството и намаляване на продължителността на човешкия живот. Физиологичната регенерация осигурява процеси на ремоделиране, т.е. заместване на стареещи и умиращи клетки чрез механизмите на естествена клетъчна смърт (апоптоза) с нови, произхождащи от резервите на стволовите клетки на човешкото тяло. Процесите на репаративна регенерация включват и клетъчните ресурси на стволовите пространства, които обаче се мобилизират при патологични състояния, свързани с болест или увреждане на тъканите, инициирайки клетъчна смърт чрез механизми на некроза.

Вниманието на учените, лекарите, пресата, телевизията и обществеността към проблема с изучаването на биологията на ембрионалните стволови клетки (ЕСК) се дължи, на първо място, на високия потенциал на клетъчната или, както я наричаме, регенеративно-пластична терапия. Разработването на методи за лечение на най-тежките човешки заболявания (дегенеративна патология на централната нервна система, увреждания на гръбначния мозък и мозъка, болести на Алцхаймер и Паркинсон, множествена склероза, миокарден инфаркт, артериална хипертония, захарен диабет, автоимунни заболявания и левкемия, изгаряния и неопластични процеси съставляват далеч не пълен списък) се основава на уникалните свойства на стволовите клетки, които позволяват създаването на нови тъкани, които да заместят, както се смяташе преди, необратимо увредените тъканни области на болния организъм.

Напредъкът на теоретичните изследвания в областта на биологията на стволовите клетки през последните 10 години се осъществява чрез спонтанно възникващи области на развиващата се регенеративно-пластична медицина, чиято методология не само е доста податлива на систематизация, но и изисква такава. Първата и най-бързо развиваща се област на практическо използване на регенеративния потенциал на стволовите клетки се превърна в заместващата регенеративно-пластична терапия. Нейният път е доста лесно проследим в научната литература - от експерименти върху животни с миокардна некроза до трудове от последните години, насочени към възстановяване на постинфарктния дефицит на кардиомиоцити или попълване на загубата на β-клетки на панкреаса и допаминергични неврони на централната нервна система.

Клетъчна трансплантация

Основата на заместителната регенеративно-пластична медицина е клетъчната трансплантация. Последната следва да се определи като комплекс от медицински мерки, по време на които тялото на пациента има директен контакт с жизнеспособни клетки с авто-, ало-, изо- или ксеногенен произход за кратък или дълъг период от време. Средството за клетъчна трансплантация е суспензия от стволови клетки или техни производни, стандартизирана по броя на трансплантационните единици. Трансплантационна единица е съотношението на броя на колониообразуващите единици в културата към общия брой трансплантирани клетки. Методи за клетъчна трансплантация: интравенозно, интраперитонеално, подкожно приложение на суспензия от стволови клетки или техни производни; приложение на суспензия от стволови клетки или техни производни в мозъчните вентрикули, лимфните съдове или цереброспиналната течност.

Ало- и автоложната клетъчна трансплантация използват два фундаментално различни методологични подхода за реализиране на плури-, мулти- или полипотентния потенциал на стволовите клетки - in vivo или in vitro. В първия случай въвеждането на стволови клетки в тялото на пациента се извършва без предварителна диференциация, във втория - след размножаване в култура, целенасочена диференциация и пречистване от недиференцирани елементи. Сред многобройните методологични техники на заместителната клетъчна терапия, три групи методи се разграничават съвсем ясно: заместване на костен мозък и кръвни клетки, заместване на клетки от органи и меки тъкани, заместване на твърди и солидни елементи на тялото (хрущял, кост, сухожилия, сърдечни клапи и капацитивни съдове). Последното направление следва да се определи като реконструктивна и регенеративна медицина, тъй като диференциращият потенциал на стволовите клетки се реализира върху матрица - биологично инертна или абсорбируема структура, оформена като заместената област на тялото.

Друг начин за повишаване на интензивността на регенеративно-пластичните процеси в увредените тъкани е мобилизирането на собствените стволови ресурси на пациента чрез използване на екзогенни растежни фактори, като гранулоцитни и гранулоцитно-макрофагни колонистимулиращи фактори. В този случай разкъсването на стромалните връзки води до увеличаване на освобождаването на хематопоетични стволови клетки в общия кръвен поток, които в областта на тъканното увреждане осигуряват процеси на регенерация поради присъщата им пластичност.

По този начин, методите на регенеративната медицина са насочени към стимулиране на процесите на възстановяване на загубената функция - или чрез мобилизиране на собствените стволови резерви на пациента, или чрез въвеждане на алогенен клетъчен материал.

Важен практически резултат от откриването на ембрионални стволови клетки е терапевтичното клониране, основано на разбирането на тригерите на ембриогенезата. Ако първоначалният сигнал за началото на ембриогенезата е пре-мРНК комплексът, разположен в цитоплазмата на ооцита, то въвеждането на ядрото на която и да е соматична клетка в енуклеираната яйцеклетка би трябвало да задейства програмата за развитие на ембриона. Днес вече знаем, че около 15 000 гена участват в изпълнението на програмата за ембриогенеза. Какво се случва с тях по-късно, след раждането, през периодите на растеж, зрялост и стареене? Отговорът на този въпрос е даден от овцата Доли: те се запазват. С помощта на най-съвременни методи на изследване е доказано, че ядрата на възрастните клетки запазват всички кодове, необходими за образуването на ембрионални стволови клетки, зародишните слоеве, органогенезата и рестрикционното съзряване (изход към диференциация и специализация) на клетъчни линии с мезенхимен, екто-, ендо- и мезодермален произход. Терапевтичното клониране като посока се е формирало още в най-ранните етапи от развитието на клетъчната трансплантология и предвижда връщане на тотипотентността към собствените соматични клетки на пациента, за да се получи генетично идентичен трансплантационен материал.

Откриването на стволовите клетки започва „от края“, тъй като терминът, въведен в биологията и медицината от А. Максимов, се отнася до стволови клетки от костен мозък, които дават началото на всички зрели клетъчни елементи на периферната кръв. Хематопоетичните стволови клетки обаче, подобно на клетките на всички тъкани на възрастен организъм, също имат свой собствен, по-малко диференциран предшественик. Общият източник за абсолютно всички соматични клетки е ембрионалната стволова клетка. Трябва да се отбележи, че понятията „ембрионални стволови клетки“ и „ембрионални стволови клетки“ в никакъв случай не са идентични. Ембрионалните стволови клетки са изолирани от Дж. Томсън от вътрешната клетъчна маса на бластоцистата и са прехвърлени в дългоживеещи клетъчни линии. Само тези клетки имат факсимиле на „ESC“. Лерой Стивънс, който открива ембрионални стволови клетки в експерименти върху мишки, ги нарича „ембрионални плурипотентни стволови клетки“, визирайки способността на ESC да се диференцират в производни на трите зародишни слоя (екто-, мезо- и ендодерма). Въпреки това, всички клетки на ембриона в по-късни етапи на развитие също са стволови клетки, тъй като те дават началото на огромен брой клетки, които формират тялото на възрастен. За да ги дефинираме, предлагаме термина „ембрионални плурипотентни прогениторни клетки“.

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Видове стволови клетки

Съвременната класификация на стволовите клетки се основава на принципа на тяхното разделяне по способност (потентност) да дават начало на клетъчни линии, която се определя като тоти-, плури-, мулти-, поли-, би- и унипотентност. Тотипотентност, т.е. способността за пресъздаване на генетично програмиран организъм като цяло, притежават зиготните клетки, бластомерите и ембрионалните стволови клетки (клетки от вътрешната маса на бластоцистата). Друга група тотипотентни клетки, които се образуват в по-късни етапи на ембрионалното развитие, е представена от първични зародишни клетки на ембрионалната генитална зона (генитални туберкули). Плурипотентността, която е способността да се диференцират в клетки на произволен орган или тъкан, е присъща на ембрионалните клетки на трите зародишни слоя - екто-, мезо- и ендодерма. Смята се, че мултипотентността, т.е. способността да се образуват всякакви клетки в рамките на една специализирана линия, е характерна само за два вида клетки: така наречените мезенхимни стволови клетки, които се образуват в невралния гребен и са предшественици на всички клетки от съединителнотъканната основа на тялото, включително невроглиалните клетки, както и хематопоетичните хематопоетични стволови клетки, които дават началото на всички кръвно-клетъчни линии. Освен това се разграничават би- и унипотентни стволови клетки, по-специално клетките-предшественици на миелоидните, лимфоидните, моноцитните и мегакариоцитните хематопоетични кълнове. Съществуването на унипотентни стволови клетки е ясно доказано на примера на чернодробните клетки - загубата на значителна част от чернодробната тъкан се компенсира от интензивното делене на диференцираните полиплоидни хепатоцити.

По време на развитието всички органи и тъкани се формират в резултат на пролиферацията и диференциацията на вътрешната клетъчна маса на бластоциста, чиито клетки са, в тесен смисъл, тотипотентни ембрионални стволови клетки. Първата работа по изолирането на ембрионални стволови клетки е извършена от Еванс, който показва, че бластоцисти, имплантирани в мозъка на мишки, дават началото на тератокарциноми, чиито клетки, когато се клонират, образуват линии от плурипотентни ембрионални стволови клетки (оригиналното наименование на тези клетки - ембрионални карциномни клетки или в съкращението ECС - понастоящем не се използва). Тези данни са потвърдени в редица други изследвания, в които ембрионални стволови клетки са получени чрез култивиране на бластоцистни клетки на мишки и други животински видове, както и на хора.

През последните години в литературата все по-често се съобщава за пластичността на стволовите клетки, която се разглежда не само като способността на последните да се диференцират в различни видове клетки на различни етапи на развитие, но и да претърпяват дедиференциация (трансдиференциация, ретродиференциация). Тоест, допуска се фундаменталната възможност за връщане на соматично диференцирана клетка към етапа на ембрионално развитие с рекапитулация (възвръщане) на плурипотентност и нейното прилагане при многократна диференциация с образуването на клетки от различен тип. По-специално се съобщава, че хематопоетичните стволови клетки са способни на трансдиференциация с образуването на хепатоцити, кардиомиобласти и ендотелиоцити.

Научните дебати относно разделянето на стволовите клетки според тяхната пластичност продължават, тоест терминологията и речникът на клетъчната трансплантация са в процес на формиране, което има пряко практическо значение, тъй като повечето методи на регенеративната пластична медицина се основават на използването на пластичните свойства и способността на стволовите клетки да се диференцират в различни клетъчни линии.

Броят на публикациите в областта на фундаменталните и приложни проблеми на регенеративно-пластичната медицина бързо се увеличава. Вече е очертан набор от различни методологични подходи, насочени към най-оптималното използване на регенеративно-пластичния потенциал на стволовите клетки. Кардиолози и ендокринолози, невролози и неврохирурзи, трансплантолози и хематолози са определили своите области на належащ интерес. Офталмолози, фтизиолози, пулмолози, нефролози, онколози, генетици, педиатри, гастроентеролози, терапевти и педиатри, хирурзи и акушер-гинеколози търсят решение на наболелите проблеми в пластичните възможности на стволовите клетки - всички представители на съвременната медицина се надяват да получат възможността да лекуват заболявания, които преди това са били считани за фатални.

Дали клетъчната трансплантация е следващото „панацея“?

Този въпрос съвсем основателно възниква у всички замислени лекари и учени, които анализират съвременното състояние на медицинската наука. Ситуацията се усложнява от факта, че от едната страна на полето на научната конфронтация са „здрави консерватори“, а от другата – „болни фанатици“ на клетъчната трансплантология. Очевидно истината, както винаги, е между тях – в „ничия земя“. Без да засягаме въпросите на правото, етиката, религията и морала, нека разгледаме плюсовете и минусите на обозначените области на регенеративно-пластичната медицина. „Лекият бриз“ на първите научни доклади за терапевтичните възможности на ембрионалните стволови клетки се превърна в „шквален вятър“ година след откриването им, който се завъртя в „информационно торнадо“ през 2003 г. Първата поредица от публикации се занимаваше с въпросите за култивирането на ембрионални стволови клетки, тяхното размножаване и насочена диференциация in vitro.

Оказа се, че за неограничено размножаване на ембрионални стволови клетки в култура е необходимо стриктно спазване на редица условия. В кондиционираната среда трябва да присъстват три фактора: интерлевкин-6 (IL-6), фактор на стволовите клетки (SCF) и инхибиторен фактор на левкоза (LIF). Освен това, ембрионалните стволови клетки трябва да се култивират върху субстрат (захранващ слой от клетки) от ембрионални фибробласти и в присъствието на фетален телешки серум. Ако тези условия са изпълнени, ембрионалните стволови клетки (ESC) в културата растат като клонове и образуват ембриоидни тела - агрегати от суспензионни клонове на сферични клетки. Най-важната характеристика на клона на ESC е, че в културата ембриоидното тяло спира да расте, когато в агрегата се натрупат 50-60, максимум 100 клетки. През този период настъпва равновесно състояние - скоростта на клетъчно делене вътре в клона е равна на скоростта на апоптоза (програмирана клетъчна смърт) по неговата периферия. След постигане на такова динамично равновесие, периферните клетки на ембриоидното тяло претърпяват спонтанна диференциация (обикновено с образуване на ендодермални фрагменти от жълтъчния сак, ангиобласти и ендотелиоцити) със загуба на тотипотентност. Следователно, за да се получи достатъчно количество тотипотентна клетъчна маса, ембриоидното тяло трябва да се дезагрегира ежеседмично с трансплантация на отделни ембрионални стволови клетки в нова хранителна среда - доста трудоемък процес.

Откриването на ембрионални стволови клетки не отговори на въпроса какво точно и как задейства програмите за ембриогенеза, закодирани в ДНК на зиготата. Остава неясно как се разгръща геномната програма по време на човешкия живот. Същевременно, изучаването на ембрионалните стволови клетки позволи да се разработи концепция за механизмите за поддържане на тоти-, плури- и мултипотентността на стволовите клетки по време на тяхното делене. Основната отличителна черта на стволовата клетка е способността ѝ да се самовъзпроизвежда. Това означава, че стволовата клетка, за разлика от диференцираната клетка, се дели асиметрично: едната от дъщерните клетки дава началото на специализирана клетъчна линия, а втората запазва тоти-, плури- или мултипотентността на генома. Остава неясно защо и как този процес протича в най-ранните етапи на ембриогенезата, когато делящата се вътрешна клетъчна маса на бластоцистата е изцяло тотипотентна, а геномът на ембрионалната стволова клетка (ESC) е в латентно (спящо, инхибирано) състояние. Ако по време на деленето на обикновена клетка процесът на дублиране задължително се предшества от активиране и експресия на цял комплекс от гени, то по време на деленето на ESC това не се случва. Отговорът на въпроса „защо“ е получен след откриването на предварително съществуваща иРНК (пре-иРНК) в ембрионалните стволови клетки (ESC), някои от които се образуват във фоликуларните клетки и се съхраняват в цитоплазмата на яйцеклетката и зиготата. Второто откритие отговаря на въпроса „как“: в ESC са открити специални ензими, наречени „едитази“. Едитазите изпълняват три важни функции. Първо, те осигуряват алтернативно епигенетично (без участието на генома) четене и дублиране на пре-иРНК. Второ, те осъществяват процеса на активиране на пре-иРНК (сплайсинг - изрязване на интрони, т.е. неактивни участъци от РНК, които инхибират процеса на синтез на протеини върху иРНК), след което започва сглобяването на протеинови молекули в клетката. Трето, едитазите насърчават образуването на вторични иРНК, които са репресори на механизмите на генна експресия, което поддържа плътното опаковане на хроматина и неактивното състояние на гените. Протеинови продукти, синтезирани върху такива вторични иРНК и наречени заглушителни протеини или пазители на генома, присъстват в човешките яйцеклетки.

Ето как днес се представя механизмът на образуване на безсмъртни клетъчни линии от ембрионални стволови клетки. Казано по-просто, сигналът за стартиране на програмата за ембриогенеза, чиито начални етапи се състоят във формирането на тотипотентна клетъчна маса, идва от цитоплазмата на яйцеклетката. Ако на този етап вътрешната клетъчна маса на бластоциста, т.е. ESC, бъде изолирана от по-нататъшни регулаторни сигнали, процесът на самовъзпроизвеждане на клетките протича в затворен цикъл без участието на гените на клетъчното ядро (епигенетично). Ако такава клетка бъде снабдена с хранителен материал и изолирана от външни сигнали, които насърчават диференциацията на клетъчната маса, тя ще се дели и ще възпроизвежда себеподобните си за неопределено време.

Първите резултати от експериментални опити за използване на тотипотентни клетки за трансплантация бяха доста впечатляващи: въвеждането на ембрионални стволови клетки в тъканите на мишки с имунна система, отслабена от имуносупресори, доведе до развитие на тумори в 100% от случаите. Сред клетките на неоплазмата, чийто източник бяха ембрионалните стволови клетки (ESC), имаше диференцирани производни на тотипотентния екзогенен клетъчен материал, по-специално неврони, но растежът на тератокарциномите намали стойността на получените резултати до нула. В същото време, в трудовете на Л. Стивънс, ESC, въведени в коремната кухина, образуваха големи агрегати, в които фрагментарно се формираха ембрионални мускули, сърце, коса, кожа, кости, мускулна и нервна тъкан. (Хирурзите, които отваряха дермоидни кисти, би трябвало да са запознати с тази картина). Интересното е, че суспендираните миши ембриобластни клетки се държат по абсолютно същия начин: въвеждането им в тъканите на възрастни имунокомпрометирани животни винаги причинява образуването на тератокарциноми. Но ако от такъв тумор се изолира чиста линия от ембрионални стволови клетки (ESC) и се въведе в коремната кухина, тогава отново се образуват специализирани соматични производни на всичките три зародишни слоя без признаци на канцерогенеза.

Така, следващият проблем, който трябваше да бъде решен, беше пречистването на клетъчния материал от примеси на недиференцирани клетки. Въпреки това, дори при много висока ефективност на целенасочена клетъчна диференциация, до 20% от клетките в културата запазват своя тотипотентен потенциал, който in vivo, за съжаление, се реализира при туморен растеж. Още една „прашка“ на природата - в мащаба на медицинския риск гаранцията за оздравяване на пациента балансира с гаранцията за неговата смърт.

Връзката между туморните клетки и ембрионалните плурипотентни прогениторни клетки (EPPC), които са по-напреднали в развитието си от ESC, е доста неясна. Резултатите от нашите изследвания показват, че въвеждането на EPPC в различни трансплантируеми тумори при плъхове може да доведе до разпадане на туморната тъкан (G), бързо увеличаване на туморната маса (D), нейното намаляване (E-3) или не повлиява размера на спонтанната централна фокална некроза на неопластичната тъкан (I, K). Очевидно е, че резултатът от взаимодействието на EPPC и туморните клетки се определя от общия набор от цитокини и растежни фактори, произвеждани от тях in vivo.

Прави впечатление, че ембрионалните стволови клетки, реагирайки с канцерогенеза на контакт с тъканите на възрастни, се асимилират перфектно с клетъчната маса на ембриона, интегрирайки се във всички органи на ембриона. Такива химери, състоящи се от собствените клетки на ембриона и донорските ембрионални стволови клетки (ESC), се наричат алофенни животни, въпреки че всъщност те не са фенотипни химери. Хематопоетичната система, кожата, нервната тъкан, черният дроб и тънките черва претърпяват максимална клетъчна химеризация, когато ESC се въвеждат в ранен ембрион. Описани са случаи на химеризация на гениталиите. Единствената неприкосновена зона за ESC са първичните зародишни клетки.

Тоест, ембрионът запазва генетичната информация на родителите си, което защитава чистотата и продължението както на рода, така и на вида.

При условия на блокиране на клетъчното делене на ранния ембрион с помощта на цитоклазин, въвеждането на ембрионални стволови клетки в бластоцистата води до развитието на ембрион, чиито първични зародишни клетки, както всички останали, са се образували от донорски ембрионални стволови клетки. Но в този случай самият ембрион е напълно донорски, генетично чужд на тялото на сурогатната майка. Механизмите на такова естествено блокиране на потенциала за смесване на собствена и чужда наследствена информация все още не са изяснени. Може да се предположи, че в този случай се реализира програмата за апоптоза, чиито детерминанти все още не са ни известни.

Трябва да се отбележи, че ембриогенезата на животни от различни видове никога не е координирана: при осъществяване на донорската програма на органогенезата в тялото на реципиентния ембрион от ксеногенни ембрионални стволови клетки, ембрионът умира in utero и се резорбира. Следователно, съществуването на химери „плъх-мишка“, „прасе-крава“, „човек-плъх“ трябва да се разбира като клетъчен, но не и морфологичен мозаицизъм. С други думи, когато ембрионалните стволови клетки (ESC) на един вид бозайник се въвеждат в бластоцистата на друг вид, винаги се развива потомство на майчиния вид, в което сред собствените клетки на почти всички органи се откриват включвания, а понякога и клъстери от структурни и функционални единици, състоящи се от генетично чужд материал от ESC производни. Терминът „хуманизирано прасе“ не може да се възприема като обозначение на някакъв вид чудовище, надарено с интелигентност или външни характеристики на човек. Това е просто животно, част от чиито телесни клетки произхождат от човешки ESC, въведени в бластоцистата на прасе.

Перспективи за използване на стволови клетки

Отдавна е известно, че заболяванията, свързани с генопатология на хематопоетичните и лимфоидните клетки, често се елиминират след алогенна трансплантация на костен мозък. Заместването на собствена хематопоетична тъкан с генетично нормални клетки от роднински донор води до частично, а понякога и пълно възстановяване на пациента. Сред генетичните заболявания, които се лекуват с алогенна трансплантация на костен мозък, заслужава да се отбележат синдромът на комбинирана имунодефицитност, Х-свързаната агамаглобулинемия, хроничната грануломатоза, синдромът на Уискот-Олдрич, болестите на Гоше и Хърлер, адренолевкодистрофията, метахроматичната левкодистрофия, сърповидно-клетъчна анемия, таласемията, анемията на Фанкони и СПИН. Основният проблем при използването на алогенна трансплантация на костен мозък при лечението на тези заболявания е свързан с избора на HbA-съвместим роднински донор, за успешното търсене на който са необходими средно 100 000 проби от типизирана донорска хематопоетична тъкан.

Генната терапия позволява коригиране на генетичен дефект директно в хематопоетичните стволови клетки на пациента. Теоретично, генната терапия предоставя същите предимства при лечението на генетични заболявания на хематопоетичната система, както алогенната трансплантация на костен мозък, но без всички възможни имунологични усложнения. Това обаче изисква техника, която позволява ефективно прехвърляне на пълноценен ген в хематопоетичните стволови клетки и поддържане на необходимото ниво на неговата експресия, което при определени видове наследствена патология може да не е много високо. В този случай дори леко попълване на протеиновия продукт на дефицитния ген дава положителен клиничен ефект. По-специално, при хемофилия B, 10-20% от нормалното ниво на фактор IX е напълно достатъчно за възстановяване на вътрешния механизъм на кръвосъсирване. Генетичната модификация на автоложен клетъчен материал се е доказала като успешна при експериментален хемипаркинсонизъм (едностранно унищожаване на допаминергичните неврони). Трансфекцията на ембрионални фибробласти от плъхове с ретровирусен вектор, съдържащ гена за тирозин хидроксилаза, осигурява синтеза на допамин в централната нервна система: интрацеребралното приложение на трансфектирани фибробласти рязко намалява интензивността на клиничните прояви на експериментален модел на болестта на Паркинсон при опитни животни.

Перспективата за използване на стволови клетки за генна терапия на човешки заболявания постави много нови предизвикателства пред клиницистите и експериментаторите. Проблемните аспекти на генната терапия са свързани с разработването на безопасна и ефективна система за генен транспорт в целевата клетка. В момента ефективността на генния трансфер в големи клетки на бозайници е много ниска (1%). Методически този проблем се решава по различни начини. Генният трансфер in vitro включва трансфекция на генетичен материал в клетките на пациента в култура, с последващото им връщане в тялото на пациента. Този подход трябва да се признае за оптимален при използване на гени, въведени в стволови клетки от костен мозък, тъй като методите за трансфер на хематопоетични клетки от тялото в културата и обратно са добре установени. Ретровирусите най-често се използват за генен трансфер в хематопоетични клетки in vitro. Въпреки това, по-голямата част от хематопоетичните стволови клетки са в латентно състояние, което усложнява транспорта на генетична информация с помощта на ретровируси и изисква търсене на нови начини за ефективен генен транспорт в латентни стволови клетки. В момента се използват методи за генен трансфер като трансфекция, директно микроинжектиране на ДНК в клетки, липофекция, електропорация, „генен пистолет“, механично свързване с помощта на стъклени перли, трансфекция на хепатоцити с рецептор-зависимо свързване на ДНК с асиалогликопротеин и аерозолно въвеждане на трансгена в клетките на алвеоларния епител на белите дробове. Ефективността на ДНК трансфера чрез тези методи е 10,0-0,01%. С други думи, в зависимост от метода на въвеждане на генетична информация, успех може да се очаква при 10 пациенти от 100 или при 1 пациент от 10 000 пациенти. Очевидно е, че все още не е разработен ефективен и същевременно безопасен метод за трансфер на терапевтични гени.

Фундаментално различно решение на проблема с отхвърлянето на алогенен клетъчен материал в клетъчната трансплантология е използването на високи дози ембрионални плурипотентни прогениторни клетки за постигане на ефекта на преинсталиране на системата за контрол на антигенната хомеостаза на възрастен организъм (ефектът на Кухарчук-Радченко-Сирман), чиято същност се състои в индуциране на имунологична толерантност чрез създаване на нова база от имунокомпетентни клетки с едновременно препрограмиране на системата за контрол на антигенната хомеостаза. След въвеждането на високи дози EPPC, последните се фиксират в тъканите на тимуса и костния мозък. В тимуса EPPC, под въздействието на специфична микросреда, се диференцират в дендритни, интердигитални клетки и епително-стромални елементи. По време на диференциацията на EPPC в тимуса на реципиента, наред със собствените молекули на главния комплекс за хистосъвместимост (MHC) на реципиента, се експресират MHC молекули, които са генетично определени в донорските клетки, т.е. установява се двоен стандарт на MHC молекулите, според който се осъществява положителна и отрицателна селекция на Т-лимфоцитите.

По този начин, обновяването на ефекторната връзка на имунната система на реципиента се случва чрез известните механизми на положителна и отрицателна селекция на Т-лимфоцитите, но чрез двойния стандарт на MHC молекулите - EPPC на реципиента и донора.

Препрограмирането на имунната система с помощта на EPPC не само позволява клетъчна трансплантация без последваща дългосрочна употреба на имуносупресори, но и отваря напълно нови перспективи в лечението на автоимунни заболявания и осигурява основа за развитието на нови идеи за процеса на стареене при човека. За да разберем механизмите на стареенето, предложихме теория за изчерпване на стволовите пространства на тялото. Според основната положения на тази теория, стареенето е трайно намаляване на размера на стволовите пространства на тялото, което се разбира като пул от регионални („възрастни“) стволови клетки (мезенхимни, невронни, хематопоетични стволови клетки, прогениторни клетки на кожата, храносмилателния тракт, ендокринния епител, пигментни клетки на цилиарните гънки и др.), попълващи клетъчните загуби на съответната тъкан в процеса на ремоделиране на тялото. Ремоделирането на тялото е обновяване на клетъчния състав на всички тъкани и органи благодарение на клетките на стволовите пространства, което продължава през целия живот на многоклетъчния организъм. Броят на клетките в стволовите пространства се определя генетично, което определя ограничения размер (пролиферативния потенциал) на всяко стволово пространство. От своя страна, размерът на стволовите пространства определя скоростта на стареене на отделните органи, тъкани и телесни системи. След изчерпване на клетъчните резерви на стволовите пространства, интензивността и скоростта на стареене на многоклетъчния организъм се определят от механизмите на стареене на соматични диференцирани клетки в рамките на границата на Хейфлик.

Следователно, на етапа на постнаталната онтогенеза, разширяването на стволовите пространства може не само значително да увеличи продължителността на живота, но и да подобри качеството на живот чрез възстановяване на потенциала за ремоделиране на организма. Разширяването на стволовите пространства може да се постигне чрез въвеждане на големи дози алогенни ембрионални плурипотентни прогениторни клетки, при условие че имунната система на реципиента е едновременно препрограмирана, което значително увеличава продължителността на живота на старите мишки в експеримента.

Теорията за изчерпване на стволовото пространство може да промени съществуващите представи не само за механизмите на стареене, но и за самото заболяване, както и за последствията от медикаментозното му лечение. В частност, заболяването може да се развие в резултат на патология на стволовите клетки (онкопатология). Изчерпването на резерва на мезенхимните стволови клетки нарушава процесите на ремоделиране на съединителната тъкан, което води до появата на външни признаци на стареене (бръчки, отпуснатост на кожата, целулит). Изчерпването на резерва на стволовите клетки от ендотелни клетки причинява развитие на артериална хипертония и атеросклероза. Първоначално малкият размер на тимусното стволово пространство определя ранната му трайна възрастова инволюция. Преждевременното стареене е следствие от първоначалното патологично намаляване на размера на всички стволови пространства на тялото. Лекарствената и нелекарствената стимулация на резервите на стволови клетки подобрява качеството на живот, като намалява неговата продължителност, тъй като намалява размера на стволовите пространства. Ниската ефективност на съвременните геропротектори се дължи на техния защитен ефект върху стареещите диференцирани соматични клетки, а не върху стволовите пространства на тялото.

В заключение бихме искали да отбележим още веднъж, че регенеративно-пластичната медицина е ново направление в лечението на човешки заболявания, основано на използването на регенеративно-пластичния потенциал на стволовите клетки. В този случай пластичността се разбира като способността на екзогенни или ендогенни стволови клетки да се имплантират и да дават начало на нови специализирани клетъчни кълнове в увредени тъканни области на болен организъм. Обект на регенеративно-пластичната медицина са фатални човешки заболявания, които в момента са нелечими, наследствена патология, заболявания, при които методите на традиционната медицина постигат само симптоматичен ефект, както и анатомични дефекти на тялото, чието възстановяване е цел на реконструктивно-пластичната регенеративна хирургия. Според нас е твърде рано да се разглеждат първите опити за пресъздаване на цели и функционално пълноценни органи от стволови клетки като отделна област на практическата медицина. Предмет на регенеративно-пластичната медицина са стволовите клетки, които в зависимост от източника на получаването им имат различен регенеративно-пластичен потенциал. Методологията на регенеративната пластична медицина се основава на трансплантацията на стволови клетки или техни производни.