Лабораторна диагностика на туберкулозата

Туберкулозата е заболяване, което е лесно за диагностициране в съвременните условия и научни постижения. Лабораторната диагностика на туберкулозата заема централно място сред другите диагностични методи, на второ място след рентгеновите методи на изследване.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Клиничен кръвен тест

При пациенти с туберкулоза промените в общия кръвен тест не са патогномонични. При ограничени и нискоактивни форми на туберкулоза е характерна хипохромия на еритроцитите с нормален брой. При масивни инфилтрати или казеозна пневмония, с разпространен казеозен лимфаденит, специфично чревно увреждане, както и при големи белодробни или следоперативни кръвоизливи, се наблюдават еритропения и микроцитоза, олигохромазия, полихромазия. Макроцитозата и особено пойкилоцитозата се срещат много по-рядко, обикновено при тежка анемия. Броят на ретикулоцитите в компенсирания стадий на туберкулозата варира от 0,1 до 0,6%, в субкомпенсирания стадий - от 0,6 до 1,0%, а за декомпенсирания стадий са характерни 1% ретикулоцити.

В някои случаи на туберкулоза може да се наблюдава умерена левкоцитоза (до 15 хиляди левкоцити), по-рядко левкопения, която се среща в 2-7% от случаите при пациенти с ограничени и леки форми на процеса и в 12,5% при деструктивна и прогресираща белодробна туберкулоза.

Най-често се наблюдават промени в левкоцитната формула. Отбелязват се както относителна, така и абсолютна неутрофилия, умерено изместване на левкоцитната формула наляво към промиелоцитите. Миелоцитите се срещат много рядко при случаи на неусложнена туберкулоза. Увеличаването на броя на неутрофилите с патологична гранулираност в хемограмата на пациент с туберкулоза винаги показва продължителността на процеса: при пациенти с тежка туберкулоза почти всички неутрофили съдържат патологична гранулираност. Когато туберкулозното огнище отшуми, ядреното изместване се връща към нормалното сравнително бързо. Патологичната гранулираност на неутрофилите обикновено се запазва по-дълго от другите промени в хемограмата.

Съдържанието на еозинофили в периферната кръв също варира в зависимост от фазата на процеса и алергичното състояние на организма. Броят им намалява до анеозинофилия при тежки и продължителни огнища на заболяването и, обратно, се увеличава по време на резорбция на инфилтрати и плеврален излив, както и при ранни форми на първична туберкулоза.

Повечето форми на първична туберкулоза са съпроводени с лимфопения, която понякога се наблюдава в продължение на няколко години дори след зарастването на специфични промени. Вторичната туберкулоза в острата фаза, в зависимост от тежестта на процеса, може да бъде съпроводена или с нормален брой лимфоцити, или с лимфопения.

Сред тестовете за оценка на туберкулозния процес, специално място заема определянето на скоростта на утаяване на еритроцитите (СУЕ), която е важна за оценка на протичането на туберкулозния процес и идентифициране на активните му форми. Увеличаването на СУЕ показва наличието на патологичен процес (инфекциозно-възпалителен, гноен, септичен, хемобластоза, лимфогрануломатоза и др.) и служи като индикатор за неговата тежест, но нормалните стойности на СУЕ не винаги показват липса на патология. Ускоряването на утаяването на еритроцитите се улеснява от повишаване на съдържанието на глобулини, фибриноген, холестерол в кръвта и намаляване на вискозитета на кръвта. Забавянето на утаяването на еритроцитите е характерно за състояния, съпроводени с хемоконцентрация, повишаване на съдържанието на албумини и жлъчни киселини.

Хемограмата на пациентите с туберкулоза се променя по време на лечението. Колкото по-успешна е терапевтичната интервенция, толкова по-бързо изчезват хематологичните промени. Същевременно трябва да се има предвид и ефектът на различни антибактериални лекарства върху хематопоезата. Те често причиняват еозинофилия, в някои случаи - левкоцитоза, а по-често левкопения до агранулоцитоза и лимфоидно-ретикуларна реакция. Систематичното хематологично наблюдение и правилният анализ на получените данни са от съществено значение за оценка на клиничното състояние на пациента, динамиката на процеса и ефективността на лечението.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Клиничен анализ на урината

При туберкулоза на пикочните пътища, анализът на урината е основният лабораторен диагностичен метод. Могат да се наблюдават левкоцитурия, еритроцитурия, протеинурия, хипоизостенурия, туберкулозна микобактериурия, неспецифична бактериурия.

Левкоцитурията е най-честият симптом на туберкулоза на пикочните пътища преди специфична химиотерапия и отсъства само в изключителни случаи, като например пълно заличаване на лумена на уретера. Тестът на Нечипоренко (определяне на броя на левкоцитите в 1 ml урина) помага за по-обективна оценка на степента на левкоцитурия при нефротуберкулоза, а в някои случаи и за откриването ѝ при нормален общ анализ на урината. Трябва обаче да се има предвид, че левкоцитурия може да се появи при остър и хроничен пиелонефрит, цистит, уретрит, камъни в бъбреците и уретерите.

Еритроцитурията, подобно на левкоцитурията, се счита за един от най-честите лабораторни признаци на пикочно-полова туберкулоза. Честотата на хематурията зависи от разпространението на процеса; тя се увеличава с развитието на деструктивния туберкулозен процес в бъбреците. Еритроцитурията без левкоцитурия е по-типична за ранните стадии на бъбречната туберкулоза. Хематурията, преобладаваща над левкоцитурията, е важен аргумент в полза на бъбречната туберкулоза при диференцирането ѝ от неспецифичен пиелонефрит.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Биохимичен кръвен тест

При туберкулозата промените в някои биохимични показатели зависят предимно от фазата на процеса, усложненията и различните съпътстващи заболявания. При пациенти с неактивна туберкулоза на белите дробове и други органи общият протеин и протеиновите фракции на кръвния серум не се променят и определят нормалното им съдържание.

При остри форми на заболяването, както и при обостряне и прогресия на хронични форми на туберкулоза, албумин-глобулиновият коефициент намалява.

От съществено значение при оценката на функционалното състояние и органичните увреждания на черния дроб при туберкулоза и нейните усложнения е определянето на директен и общ билирубин, аспартат аминотрансфераза (AST), аланин аминотрансфераза (ALT) в кръвния серум. Динамичното определяне на нивото на аминотрансферазите. билирубин при лечението на пациенти с туберкулоза, особено в тежките ѝ форми, е задължителен компонент от биохимичното изследване на пациенти с туберкулоза и се провежда ежемесечно.

Оценката на функционалното състояние на бъбреците включва определяне на серумния креатинин и изчисляване на скоростта на гломерулна филтрация по формулата на Кокрофт-Голт. Изчисляването на скоростта на гломерулна филтрация с помощта на теста на Реберг дава по-малко точни резултати.

Основната цел на динамичните биохимични изследвания на пациенти с туберкулоза е проследяване на протичането на процеса, своевременно откриване на странични ефекти на лекарствата и адекватна корекция на възникващите нарушения на хомеостазата.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Приложение на биохимични методи за изследване при екстрапулмонална туберкулоза

Най-информативният показател се счита за съдържанието на туберкулостеаринова киселина в биологични течности, но определянето му е свързано с технически трудности (необходимостта от използване на газова хроматография и масспектрометрия).

Перспективно е да се измери активността на аденозин деаминазата - ензим, определян в течности: синовиална, перикардна, асцитна или цереброспинална. Основните производители на аденозин деаминаза са лимфоцитите и моноцитите. Определянето на активността на аденозин деаминазата в биологични течности улеснява диагностицирането на туберкулозен синовит, туберкулоза на лимфните възли, туберкулозен менингит, туберкулозен серозит.

Някои биохимични показатели, поради тяхната неспецифичност, се определят само в биологични течности в близост до лезията. Нивото на показателите се измерва в отговор на подкожно или интрадермално приложение на туберкулин (обикновено преди приложението и 48 и 72 часа след него). След това се изчислява степента на повишаване на нивото на маркера (в %) спрямо началното ниво.

Оптимално е активността на органоспецифичния ензим трансамидиназа да се определя в урината; появата му се отбелязва при бъбречни увреждания с различен произход. Изследването на трансамидиназата е оправдано само при условия на подкожно приложение на туберкулин с цел обостряне на локалния възпалителен процес. Активността на трансамидиназата се определя в урината първоначално и 24-72 часа след прилагането на 50 ТЕ туберкулин. Увеличаването на ферментурията 2 пъти или повече позволява в 82% от случаите да се диференцира активната туберкулоза на бъбреците от обостряне на хроничен пиелонефрит.

При туберкулоза на женските полови органи концентрациите на хаптоглобин и малонодиалдехид в кръвта се определят при условията на провокативен туберкулинов тест. Туберкулинът се прилага подкожно в доза от 50 TE и се извършва повторно биохимично изследване след 72 часа. При туберкулозна етиология степента на повишаване на нивото на хаптоглобин е най-малко 28%, а нивото на малонодиалдехид е 39% или повече. Използва се и определяне на активността на аденозин деаминазата в перитонеалната течност, получена от Дъгласовия джоб. Пункцията се изследва отново 72 часа след интрадермалното приложение на туберкулин в дози от 0,1 TE и 0,01 TE в областта на проекцията на вътрешните полови органи върху предната коремна стена. Увеличаването на активността на аденозин деаминазата с 10% или повече в сравнение с началната стойност показва туберкулозен процес.

В случай на увреждане на очите се изследва фокалната реакция, възникваща в окото в отговор на антигенна стимулация. В този случай развитието на рязко изразен отговор, съпроводен с намаляване на зрителните функции, е нежелателно. Тъй като оценката на минималните фокални реакции често е трудна, се препоръчва паралелно фокусиране върху степента на повишаване на хаптоглобина или аденозин деаминазата в кръвния серум, за да се обективизира заключението.

Всички биохимични изследвания трябва да се провеждат в комбинация с други методи.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Изследване на системата за кръвосъсирване

Актуалността на изучаването на състоянието на системата за кръвосъсирване във фтизиатрия се дължи на наличието на хемоптиза или белодробни кръвоизливи при редица пациенти с туберкулоза на белите дробове, както и на хемокоагулационни усложнения при хирургичното лечение на туберкулозата. Освен това, естествено съпътстващата латентна интраваскуларна хемокоагулация влияе върху протичането на заболяването и ефективността на химиотерапията.

При пациенти с белодробна туберкулоза с преобладаващ ексудативен компонент на възпалението се наблюдава намаляване на антикоагулантната активност на кръвта. При пациенти с ниска честота на специфични белодробни увреждания с преобладаващ продуктивен компонент на възпалението, интраваскуларната хемокоагулация е незначително изразена. При пациенти с белодробна туберкулоза с хемоптиза и белодробни кръвоизливи състоянието на системата за кръвосъсирване е различно: при пациенти с незначителна кръвозагуба в разгара на хемоптизата или веднага след нейното прекратяване се наблюдава рязко повишаване на коагулационния капацитет на кръвта поради изразено засилване на процесите на образуване на тромбин, като същевременно се поддържа повишена „структурна“ коагулация. При пациенти с масивна кръвозагуба се наблюдава намаляване на коагулационния потенциал поради намаляване на концентрацията на фибриноген, активността на фактор XIII и броя на тромбоцитите. На етапа на хирургично лечение при пациенти с ограничени форми на белодробна туберкулоза не се наблюдават значителни нарушения в хомеостазната система. При пациенти с широко разпространени процеси, при извършване на пневмонектомия или плевропневмонектомия, често се развива DIC синдром, който може да се прояви като „вторично заболяване“.

За да се следи състоянието на системата за кръвосъсирване при пациенти с белодробна туберкулоза, е необходимо да се определи активираното парциално тромбопластиново време (APTT), фибриногенът, тромбиновото време, протромбиновият индекс, както и времето на кървене и времето на кръвосъсирване.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Хормонални изследвания

Съвременните експериментални и клинични наблюдения показват наличието на промени в хормоналния статус при специфично туберкулозно възпаление на белите дробове. Доказано е, че коригирането на дисфункцията на хипофизно-надбъбречната, хипофизно-тиреоидната системи и панкреатичната функция в комбинация с противотуберкулозна терапия допринася за активиране на фиброгенезата и репарационните процеси във фокуса на специфичното възпаление.

Функционалното състояние на хипофизно-тиреоидната система се оценява по съдържанието на трийодтиронин (Т3), тироксин (Т4) и хипофизен тиреостимулиращ хормон (TSH) в кръвния серум _. Установено _е, че субклиничният хипотиреоидизъм се открива при 38-45% от пациентите с белодробна туберкулоза и най-често се диагностицира при дисеминирана и фиброзно-кавернозна форма на процеса. При тези форми нивата както на Т3, така и на Т4 са най-рязко намалени и _{се наблюдавадисбаланс} на тези хормони под формата на повишаване на _{съотношението Т4/} Т3.

Функцията на надбъбречната кора се оценява чрез нивото на серумния кортизол, а ендокринната функция на панкреаса - чрез концентрацията на имунореактивен инсулин. В острата фаза на инфекциозно заболяване нуждата от ендогенен кортизол и инсулин се увеличава. Хиперинсулинемията също показва инсулинова резистентност на телесните тъкани, което е типично за всеки активен възпалителен процес, по-специално за специфичен. Определянето на глюкокортикоидната функция на надбъбречните жлези при активна белодробна туберкулоза ни позволява да открием наличието на хиперкортицизъм при повечето пациенти. Нормалните концентрации на кортизол в кръвта при пациент с инфекциозно възпаление в острия период трябва да се разглеждат като относителна недостатъчност на глюкокортикоидната функция на надбъбречната кора, което може да послужи като основа за заместителна терапия с адекватни дози глюкокортикоиди.

Почти една трета от пациентите с белодробна туберкулоза имат ниско ниво на инсулинемия, приближаващо се до долната граница на нормата, докато 13-20% имат значителен хиперинсулинизъм. Както относителният хипо-, така и хиперинсулинизмът са високорискови фактори за развитие на нарушения на въглехидратния метаболизъм с различна тежест. Тези промени във функционалната активност на панкреатичните В-клетки изискват редовен гликемичен мониторинг при пациенти с туберкулоза и навременна профилактика на захарен диабет. Освен това това служи като допълнително основание за целесъобразността на използването на физиологични дози инсулин в комплексната терапия на туберкулозата.

Като цяло, намаляването на нивата на тиреоидните хормони, техният дисбаланс, хиперкортизолемията и хиперинсулинизмът са най-силно изразени при пациенти с тежък туберкулозен процес, с обширни белодробни лезии и изразени симптоми на туберкулозна интоксикация.

Микробиологична диагностика на туберкулозата

Микробиологичните изследвания са необходими за идентифициране на пациенти с туберкулоза, проверка на диагнозата, наблюдение и коригиране на химиотерапията, оценка на резултатите от лечението, с други думи, от момента на регистрация на пациент с туберкулоза до момента на отстраняването му от регистъра.

Всички епидемиологични програми и проекти се основават на оценката на броя на бактериоотделителите, което е невъзможно да се направи без използването на лабораторни методи за откриване на туберкулозни микобактерии. При изследване на привлекателността на така нареченото неорганизирано население процентът на бактериоотделителите достига 70 или повече, което прави лабораторните методи доста ефективно средство за идентифициране на пациенти с туберкулоза сред тази популационна група.

Традиционните микробиологични методи за диагностициране на туберкулоза са бактериоскопските и културалните изследвания. Съвременните методи включват култивиране на туберкулозни микобактерии в автоматизирани системи и PCR. Всички тези методи обаче задължително се комбинират с класически бактериологични методи.

Събиране на диагностичен материал

Ефективността на лабораторните изследвания до голяма степен зависи от качеството на диагностичния материал. Спазването на правилата за събиране, съхранение и транспортиране на диагностичен материал и прецизното изпълнение на алгоритъма за изследване на пациента пряко влияе върху резултата и гарантира биологична безопасност.

За изследване на туберкулоза се използват различни материали. Тъй като белодробната туберкулоза е най-често срещаната форма на туберкулозна инфекция, основният материал за изследване се счита за храчки и други видове трахеобронхиален секрет: секрет от горните дихателни пътища, получен след аерозоли; води от бронхиален лаваж; бронхоалвеоларни лаважи; материал, получен по време на бронхоскопия, транстрахеална и интрапулмонална биопсия: бронхиален аспират, ларингеални натривки, ексудати, натривки от рани и др.

Ефективността на изследването се увеличава, ако се извършва контролирано събиране на материал от пациента. За тази цел се отделя специално оборудвана стая или се закупуват специални кабини. Събирането на материал е опасна процедура, следователно материалът за изследване трябва да се събира в съответствие с правилата за безопасност при инфекции.

Материалът за изследване за Mycobacterium tuberculosis се събира в стерилни флакони с плътно завинтени капачки, за да се предотврати замърсяване на околната среда и да се защити събраният материал от замърсяване.

Епруветките за събиране на диагностичен материал трябва да отговарят на следните изисквания:

• трябва да е изработен от удароустойчив материал;
• трябва да се топи лесно при автоклавиране;
• да бъде с достатъчен обем (40-50 мл):
• имат широк отвор за събиране на храчки (диаметър не по-малък от 30 мм);
• да е лесен за работа, прозрачен или полупрозрачен, така че количеството и качеството на събраната проба да могат да се оценят без отваряне на капака.

За да се получат оптимални резултати от изследването, трябва да бъдат изпълнени следните условия:

• събирането на материал трябва да се извърши преди началото на химиотерапията;
• материалът за изследването трябва да се събере преди хранене или прием на лекарства сутрин;
• За изследването е препоръчително да се съберат поне 3 сутрешни проби от храчки. Храчките се събират в продължение на 3 последователни дни;
• Събраният материал трябва да бъде доставен в лабораторията възможно най-бързо:
• в случаите, когато е невъзможно материалът да се достави незабавно в лабораторията, той се съхранява в хладилник при температура на въздуха 4 °C за не повече от 48 часа;
• При транспортиране на материала е необходимо да се обърне специално внимание на целостта на бутилките.

Правилно събраните храчки имат слузест или мукопурулентен характер. Оптималният обем на изследваната порция храчки е 3-5 мл.

Храчките се събират под наблюдението на здравен работник. Лицата, отговорни за събирането на храчки, трябва да гарантират спазването на определени правила:

• Необходимо е да се обясни на пациента целта на изследването и необходимостта да се изкашля не слюнка или назофарингеална слуз, а съдържанието на дълбоките отдели на дихателните пътища. Това може да се постигне в резултат на продуктивна кашлица, която се появява след няколко (2-3) дълбоки вдишвания. Необходимо е също така да се предупреди пациентът, че първо трябва да изплакне устата си с преварена вода, за да се отстрани основната част от микрофлората, вегетираща в устната кухина, и хранителните остатъци, които затрудняват изследването на храчките;
• Медицинският работник, участващ в събирането на храчки, освен престилка и шапка, трябва да носи маска, гумени ръкавици и гумена престилка;
• Застанал зад пациента, той се съветва да държи бутилката възможно най-близо до устните си и веднага да отдели храчките в нея, докато ги изкашлява, като същевременно е необходимо да се гарантира, че въздушният поток е насочен далеч от здравния работник:
• След като събирането на храчки приключи, здравният работник трябва внимателно да затвори бутилката с капака и да оцени количеството и качеството на събраните храчки. След това бутилката се етикетира и поставя в специална кутия за транспортиране до лабораторията.

Ако пациентът не отделя храчки, то предната вечер и рано сутринта в деня на събиране на материала трябва да му се даде отхрачващо средство: екстракт от корените на ружа (мукалтин), бромхексин, амброксол и др. - или да се използва дразнеща инхалация, като се използва инсталирана в помещението за събиране на храчки апаратура. Събраният по този начин материал не подлежи на консервиране и трябва да се изследва в деня на събирането. За да се избегне „отхвърлянето“ му в лабораторията, в направлението трябва да се направи специална бележка.

Ако в дадена институция не се извършват микробиологични изследвания, събраният диагностичен материал трябва да се достави централно в лабораторията, при условие че материалът се съхранява в хладилник или с консерванти между доставките. Материалът се доставя в лабораторията в транспортни кутии, които могат лесно да се дезинфекцират. Всяка проба трябва да бъде снабдена с подходящ етикет, а цялата партида трябва да има попълнен придружаващ формуляр.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Начини и честота на преглед на пациентите

По време на първоначалния, така наречен диагностичен, преглед на пациент за туберкулоза е необходимо да се изследват поне 3 порции храчки, събрани под наблюдението на медицински персонал в продължение на 2 или 3 дни, което повишава ефективността на микроскопията.

Първичният скрининг за туберкулоза трябва да се извършва от всички лечебни и диагностични заведения на здравната система. Напоследък, за да се повиши ефективността на първичния преглед, на базата на клинични диагностични лаборатории са организирани т. нар. микроскопски центрове, оборудвани със съвременни микроскопи и оборудване за осигуряване на епидемична безопасност.

Противотуберкулозните заведения използват схема за изследване, която предвижда поне 3-кратно изследване на храчки или друг диагностичен материал в рамките на 3 дни. По време на лечението микробиологичните изследвания се провеждат редовно поне веднъж месечно във фазата на интензивна химиотерапия. При преминаване към фазата на проследяване изследванията се провеждат по-рядко - на интервали от 2-3 месеца, като честотата на изследванията се намалява до две.

Характеристики на събирането на диагностичен материал за екстрапулмонална туберкулоза

Характерна особеност на патологичния материал при екстрапулмонални форми на туберкулоза е ниската концентрация на микобактерии туберкулоза в него, което изисква по-чувствителни методи за микробиологично изследване, предимно методи за засяване върху хранителна среда.

При пикочно-полова туберкулоза, урината е най-достъпният материал за изследване. Събирането на урина трябва да се извършва от специално обучена медицинска сестра.

Външните полови органи се измиват с вода и сапун или слаб разтвор на калиев перманганат. Външният отвор на уретрата се обработва внимателно. Средната порция сутрешна урина се събира в стерилно шишенце: при мъжете - по естествен път, при жените - с помощта на катетър. Урината от бъбречното легенче се събира в стерилни епруветки по време на катетеризация на един или два бъбрека, в последния случай - задължително отделно от всеки бъбрек. Малко количество от тази урина се центрофугира, утайката се изследва.

При мъжете сперматозоидите, тестикуларните проби и секретите на простатата се центрофугират, за да се получи утайка. При всяка локализация на специфичен процес в гениталната област при мъжете, масажът на простатата може да насърчи отделянето на секрети, съдържащи туберкулозни микобактерии.

Менструална кръв се събира от жени чрез засмукване или с помощта на капачка на Кафка. Полученият материал се освобождава от еритроцитите чрез промиване с дестилирана вода и след това центрофугиране. Утайката се изследва.

Изпускането от цервикалния канал на матката се събира в някакъв контейнер или капачка на Кафка, т.е. е желателно да се натрупат 1-2 мл патологичен материал.

Материал, получен по време на хирургични интервенции на бъбреците, гениталиите, биопсии, ендометриални остъргвания, се хомогенизира. За целта се поставя в стерилен хаван и се раздробява старателно със стерилни ножици. Към получената суспензия се добавя стерилен речен пясък в количество, равно на масата ѝ, след което се добавят 0,5-1,0 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид и всичко се смила до образуване на кашообразна маса с добавяне на изотоничен разтвор на натриев хлорид (4-5 ml). След това масата се оставя да се утаи за 1-1,5 минути, супернатантата се изследва.

Туберкулоза на костите и ставите. Пункционната проба (гной от абсцеси), получена със стерилна спринцовка, се поставя в стерилен контейнер и незабавно се доставя в лабораторията. С помощта на стерилна пипета, предварително навлажнена със стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид, се вземат 2-5 ml гной, прехвърлят се в бутилка с мъниста и се добавят още 2-3 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид. Бутилката се затваря със запушалка и се разклаща в шейкър в продължение на 8-10 минути. Хомогенизираната суспензия се изследва.

При фистулни форми на костно-ставна туберкулоза гной се взема от фистулата. Обилният секрет се събира директно в епруветка. В случаите на оскъдно гнойно отделяне, фистулният тракт се промива със стерилен изотоничен разтвор на натриев хлорид, а събраните в епруветка промивни течности или парче тампон, напоено с гной, се изпращат за изследване.

Хирургичният материал, получен по време на хирургични интервенции върху кости и стави, може да се състои от гнойно-некротични маси, гранулации, белегова тъкан, костна тъкан, тъкан на синовиалната мембрана и други субстрати. Обработката му се извършва както при бъбречна туберкулоза.

Веднага след пункцията се извършва микробиологично изследване на синовиалната течност в 3% разтвор на натриев цитрат (в съотношение 1:1) за предотвратяване на съсирването.

Туберкулоза на лимфните възли. Гной, извлечен по време на пункция на лимфните възли, се изследва по същия начин, както гной от абсцеси. Тъкан от лимфни възли, получена по време на хирургични интервенции и биопсии, се изследва както при други форми на туберкулоза.

Изследването на изпражненията за Mycobacterium tuberculosis се извършва изключително рядко поради почти пълната липса на положителни резултати.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Микроскопия на микобактерии

Микроскопията на храчките е сравнително бърз, прост и евтин метод, който трябва да се използва във всички случаи, при които има съмнение за туберкулоза. Освен това, това изследване се провежда, за да се оцени ефективността на химиотерапията и да се потвърди възстановяването или неуспехът на лечението при липса на резултати от посявка.

Използват се два метода за микроскопско изследване:

• метод на директна микроскопия, когато намазка се приготвя директно от диагностичния материал;
• метод за микроскопия на седименти, приготвени от материал, третиран с деконтаминанти, за културни изследвания.

Първият метод се използва в лабораториите, където се провеждат само микроскопски изследвания (клинични диагностични лаборатории от общата медицинска мрежа).

Най-добрите резултати от микроскопското изследване се получават чрез концентриране на диагностичния материал (например чрез центрофугиране).

За да се открие Mycobacterium tuberculosis с 50% вероятност чрез микроскопия, 1 ml храчки трябва да съдържа повече от 5000 микробни клетки. Храчките от пациенти с белодробни форми на туберкулоза обикновено съдържат значителен брой киселинно-устойчиви бактерии, което позволява надеждното им откриване чрез бактериоскопия. Диагностичната чувствителност на този метод може да се повиши чрез изследване на няколко проби от храчки от един пациент. Отрицателният резултат от бактериоскопското изследване не изключва диагнозата туберкулоза, тъй като храчките на някои пациенти съдържат по-малко Mycobacterium, отколкото може да се открие чрез микроскопия. Лошата подготовка на натривките от храчки също може да бъде причина за отрицателен резултат от бактериоскопското изследване.

Най-разпространеният метод за откриване на киселинно-устойчиви микобактерии в натривка е оцветяването по Цил-Нилсен. Методът се основава на проникването на карболов фуксин в микробна клетка през мембрана, която включва восъчно-липиден слой, с едновременното действие на нагряване и силното ецващо действие на фенола. Последващото обезцветяване на натривката с 25% разтвор на сярна киселина или 3% солна киселина води до обезцветяване на всички некиселинно-устойчиви структури. Обезцветените елементи на натривката се оцветяват с 0,3% разтвор на метиленово синьо. Микобактериите не възприемат конвенционалните анилинови багрила, в резултат на което киселинно-устойчивите микобактерии се оцветяват в малиново-червено, а други микроби и клетъчни елементи се оцветяват в синьо.

За изследване на натривки, оцветени по Цил-Нилсен, се използва светлинен бинокулярен микроскоп с имерсионен обектив (90- или 100-кратно увеличение) и окуляр със 7- или 10-кратно увеличение. Изследват се 100 зрителни полета, което е достатъчно за откриване на единични микобактерии в натривката. Ако резултатът от такова изследване е отрицателен, се препоръчва да се изследват още 200 зрителни полета за потвърждение. Резултатите се записват, като се посочва броят на откритите киселинно-устойчиви микобактерии (АУМ).

В допълнение към този метод, за луминесцентна микроскопия се използва флуорохромно оцветяване, което позволява постигане на най-добри резултати. Използването на този метод повишава ефективността на микроскопията с 10-15%. Когато микобактериите се третират с луминесцентни багрила (аурамин, родамин и др.), тези вещества също се свързват с восъчните структури на микробната клетка. Когато оцветените клетки се облъчат с възбуждащ източник на светлина (определен спектър от ултравиолетова радиация), те започват да светят оранжево или яркочервено на черен или тъмнозелен фон. Благодарение на високата яркост и контраст на видимото изображение, общото увеличение на микроскопа може да се намали с 4-10 пъти, което разширява зрителното поле и намалява времето за гледане на препарата. Наред с това, поради значително по-голямата дълбочина на рязкост, може да се увеличи комфортът на изследването.

При използване на флуоресцентна микроскопия, оглеждането на една и съща област от натривка отнема значително по-малко време, отколкото светлинната микроскопия на натривки, оцветени по Цил-Нилсен. Ако микроскопистът огледа приблизително 20-25 такива натривки през един работен ден, то с помощта на флуоресцентна микроскопия той може да изследва повече от 60-80 проби за едно и също време. Опитните микроскописти знаят, че оцветяването на клетки със смес от аурамин и родамин е по някакъв начин специфично за киселинно-устойчивите микобактерии, които в този случай имат вид на златни пръчици. Сапрофитите се оцветяват зеленикаво.

Друго важно предимство на метода на флуоресцентната микроскопия е възможността за откриване на променени микобактерии, които са загубили своите киселинно-устойчиви свойства под влиянието на редица неблагоприятни фактори, по-специално интензивна химиотерапия, и следователно не се откриват чрез оцветяване по Цил-Нилсен.

Недостатъците на метода на флуоресцентната микроскопия включват относително високата цена на микроскопа и неговата експлоатация. Въпреки това, в централизирани или други големи лаборатории, където работното натоварване надвишава нормата от трима лаборанти, работещи с три конвенционални микроскопа, е по-евтино да се използва един флуоресцентен микроскоп.

Бактериоскопските методи имат сравнително висока специфичност (89-100%). Около 97% от положителните резултати, получени чрез който и да е микроскопски метод, са ясно потвърдени от резултатите от сеитбата.

Трябва да се отбележи, че микроскопското изследване на намазка от патологичен материал не позволява да се определи видът на откритите киселинно-устойчиви микобактерии. Микроскопският метод позволява да се направи заключение само за наличието или отсъствието на киселинно-устойчиви микроорганизми в препарата, което се обяснява с наличието в природата на голям брой нетуберкулозни киселинно-устойчиви микроорганизми, морфологично подобни на микобактериите от туберкулозния комплекс.

Оценката на резултатите от микроскопията се извършва в полуколичествени единици.

За да могат да се сравнят резултатите от различни микроскопски методи, се въвеждат емпирични коефициенти. Например, за да се сравнят резултатите от намазка, оцветена с флуоресцентни багрила, с данните от светлинно-микроскопско изследване (1000-кратно увеличение), е необходимо броят на киселинно-устойчивите микобактерии, открити с помощта на флуоресцентен микроскоп, да се раздели на съответния коефициент: при 250-кратно увеличение на микроскопа - на 10, при 450-кратно - на 4, при 630-кратно - на 2.

Характеристики на микроскопията при екстрапулмонална туберкулоза

Извършва се директна микроскопия, както и микроскопия на натривки, приготвени след обогатяване с последващо оцветяване по Цил-Нилсен или флуоресцентни багрила. Директната микроскопия на натривки е неефективна поради ниската концентрация на микобактерии в материала и затова е по-рационално да се използват методи за обогатяване. Най-ефективно е центрофугирането. Ако биологичният материал е вискозен, се използва центрофугиране с едновременно хомогенизиране и втечняване на материала, което се извършва с помощта на високоскоростни центрофуги със сила на центрофугиране 3000 g и разтвори на хипохлорит. Други методи за обогатяване, като микрофлотация, понастоящем не се използват поради образуването на биологично опасни аерозоли.

[ 37 ]

Култивационен метод за диагностициране на туберкулоза

Методът на посяване, или методът на култивиране, е по-чувствителен от микроскопията с натривка и има редица предимства пред последната. Той позволява откриването на няколко десетки жизнеспособни микобактерии в изследвания материал и има висока диагностична стойност. Това е особено важно при изследване на материал от новодиагностицирани или лекувани пациенти, които отделят малък брой микобактерии.

В сравнение с микроскопията, културалните изследвания позволяват да се увеличи броят на откритите пациенти с туберкулоза с повече от 15-25%, както и да се верифицира туберкулозата в по-ранни стадии, когато заболяването все още е лесно лечимо. Много важно предимство на културалните изследвания се счита за възможността за получаване на патогенна култура, която може да бъде идентифицирана и изследвана по отношение на лекарствената чувствителност, вирулентността и други биологични свойства.

Недостатъците на методите за култивиране включват тяхната продължителност (периодът на изчакване за материалите достига 10 седмици), по-висока цена и сложността на обработката на диагностичния материал.

Принципи на предсеитбената обработка на диагностичен материал

Конвенционалните микробиологични методи не могат да се използват за провеждане на туберкулозни тестове. Това се дължи на факта, че туберкулозните микобактерии растат много бавно и повечето клинични проби съдържат бързорастящи гнойни и гнилостни микроорганизми и гъбички. Бързият им растеж върху богати хранителни среди пречи на развитието на микобактериите и не позволява изолирането на туберкулозния причинител, така че диагностичният материал трябва да бъде предварително обработен преди засяване. Освен това, микобактериите, отделени от дихателните пътища на пациента, обикновено са обградени от голямо количество слуз, което затруднява концентрирането им. В тази връзка, преди засяване на храчки и други подобни материали, те трябва да бъдат втечнени и обеззаразени.

Всички детергенти и дезинфекционни средства имат по-силно изразен токсичен ефект върху микобактериите. В резултат на третирането, до 90% от микобактериите могат да загинат. За да се запази достатъчна част от микобактериалната популация, е необходимо да се използват щадящи методи на третиране, които позволяват, от една страна, да се потиснат бързорастящите гнойни и гнилостни микроорганизми, а от друга страна, максимално да се запази жизнеспособността на микобактериите, присъстващи в материала.

В зависимост от материала, неговата хомогенност и ниво на замърсяване, за предпосявна обработка се използват различни деконтаминанти: за храчки - 4% разтвор на натриев хидроксид, 10% разтвори на тринатриев фосфат, бензалкониев хлорид тринатриев фосфат, NALC-NaOH (N-ацетил-L-цистеин-натриев хидроксид) с крайна концентрация на NaOH 1%, за урина и други течни материали - 3% разтвор на сярна киселина, за замърсени проби, съдържащи мазнини материали - разтвор на оксалова киселина до 5%. Освен това, в някои случаи се използват ензими и повърхностноактивни вещества (детергенти). Използването на Tween и някои други детергенти е съпроводено с по-малка смърт на микобактериалните клетки (40-50% оцеляват). Те обаче могат да се използват само за течни материали. NALC-NaOH, произвеждан в комплекти, е най-широко използваният в света. Този метод позволява да се изолират повече от 85% от популацията на микобактериалните клетки. Деконтаминацията на твърди материали, съдържащи тъкани, е по-трудна, тъй като е трудно да се предположи степента на дисперсия на материала по време на хомогенизацията. Например, обработката на биопсии от лимфни възли често е съпроводена с повишена честота на замърсяване с чужда флора. В този случай може да се използва 1% етониум.

Нехомогенният материал се хомогенизира с помощта на стъклени перли в присъствието на деконтаминанти. Течните материали се центрофугират предварително и се обработва само утайката.

Техника на засяване и инкубация

След предварителна обработка материалът се центрофугира, което утаява микобактериите и увеличава съдържанието им в утайката („обогатяване на утайката“). Получената утайка се неутрализира и инокулира върху повърхността на плътни хранителни среди или епруветки с течни (полутечни) среди. От останалата утайка се приготвят намазки за микроскопско изследване. Техниката на посяване трябва да предотвратява кръстосано замърсяване на диагностичния материал.

За надеждна клинична интерпретация на резултатите от микробиологичните изследвания трябва да се спазва следното правило: микроскопските и културалните изследвания трябва да се извършват паралелно от една и съща проба от диагностичен материал.

Инокулираните епруветки се поставят в термостат при 37 ^° C за 2 дни в хоризонтално положение. Това осигурява по-равномерно абсорбиране на материала в хранителната среда. След 2 дни епруветките се преместват във вертикално положение и се затварят херметически с гумени или силиконови запушалки, за да се предотврати изсъхването на посятите среди.

Културите се съхраняват в термостат при 37 ^° C в продължение на 10-12 седмици с редовна седмична проверка. При всяка контролна проверка се записват следните параметри:

• период на визуално наблюдаем растеж от деня на засяване;
• темп на растеж (брой CFU);
• замърсяване на културата с чужда микробна флора или гъбички (такива епруветки се отстраняват);
• няма видим растеж. Тръбите се оставят в термостата до следващата проверка.

Хранителна среда

За култивиране на микобактерии се използват различни хранителни среди: твърди, полутечни, течни. Нито една от известните хранителни среди обаче не притежава свойства, които да осигуряват растежа на всички микобактериални клетки. В тази връзка, за да се подобри ефективността, се препоръчва едновременното използване на 2-3 хранителни среди с различен състав.

Като стандартна среда за първична изолация на туберкулозния патоген и определяне на неговата лекарствена чувствителност, СЗО препоръчва средата на Lowenstein-Jensen. Това е плътна яйчена среда, върху която се получава растеж на микобактерии на 20-25-ия ден след засяване на бактериоскопски положителен материал. Засяването на бактериоскопски отрицателен материал изисква по-дълъг инкубационен период (до 10-12 седмици).

В нашата страна е широко разпространена яйчената среда Finn-II, предложена от ER Finn. Тя се различава по това, че вместо L-аспарагин използва натриев глутамат, който задейства други пътища за синтез на аминокиселини в микобактериите. Растежът се появява върху тази среда малко по-рано, а честотата на изолиране на микобактерии е с 6-8% по-висока, отколкото върху средата Lowenstein-Jensen.

За повишаване на ефективността на бактериологичната диагностика на екстрапулмонална туберкулоза е препоръчително в комплекса от хранителни среди да се включи модифицирана среда Finn-II. За ускоряване на растежа, в хранителната среда Finn-II допълнително се въвежда 0,05% натриев тиогликолат, което намалява концентрацията на кислород. За защита на ензимните системи на микобактериите от токсични продукти на липидната пероксидация, в хранителната среда Finn-II се въвежда антиоксидантът α-токоферол ацетат в концентрация 0,001 μg/ml. Диагностичният материал се посява по стандартния метод.

В противотуберкулозните лаборатории в Русия се използват и други модификации на плътни хранителни среди: хранителната среда „Новая“, предложена от Г. Г. Мордовски, хранителните среди А-6 и А-9, разработени от В. А. Аникин, и др.

Поради факта, че по време на химиотерапията настъпват увреждания на различни метаболитни системи на микробната клетка, част от микобактериалната популация губи способността си да се развива нормално върху конвенционални хранителни среди и изисква осмотично балансирани (полутечни или течни) хранителни среди.

Оценка и записване на резултатите от диагностичната материална култура

Някои щамове и видове микобактерии растат бавно, растежът може да се появи дори до 90-ия ден. Броят на такива култури е малък, но това налага посевите да се държат в термостат в продължение на 2,5-3 месеца.

Вирулентните култури на Mycobacterium tuberculosis обикновено растат върху твърди яйчни среди като R-форма колонии с различен размер и външен вид. Колониите са сухи, набръчкани, с цвят на слонова кост и леко пигментирани. Върху други среди колониите на Mycobacterium tuberculosis може да са по-влажни. След курс на химиотерапия или по време на лечение могат да бъдат изолирани гладки колонии с влажен растеж (S-форми).

При изолиране на култури се използва набор от специални изследвания за разграничаване на туберкулозните микобактерии от нетуберкулозните микобактерии и киселинно-устойчивите сапрофити.

Положителен отговор се дава след задължително микроскопско изследване на натривка от порасналите колонии, оцветена по Цил-Нилсен. В случай на растеж на микобактерии, в натривките се откриват яркочервени пръчици, разположени поединично или на групи, образувайки струпвания под формата на филц или плитки. В младите култури, особено тези, изолирани от пациенти, лекувани с химиотерапия дълго време, микобактериите се отличават с изразен полиморфизъм, до наличието на къси, почти кокоидни или удължени варианти, наподобяващи гъбичен мицел, наред с пръчковидни форми.

Интензивността на микобактериалния растеж се определя по следната схема: (+) - 1-20 CFU в епруветка (ниско бактериално отделяне); (++) - 20-100 CFU в епруветка (умерено бактериално отделяне); (+++) - >100 CFU в епруветка (обилно бактериално отделяне). При лабораторната диагностика на туберкулозата не е достатъчно да се даде отговор, показващ дали микобактериите са открити чрез определен метод. Необходимо е също така да се има подробна представа за обема и естеството на микобактериалната популация, нейния състав и свойства. Именно тези данни позволяват правилно да се интерпретира състоянието на процеса, да се планира тактика и своевременно да се коригира лечението.

През последните години бяха предложени хранителни среди на агар-агарна основа с различни добавки за растеж и използването на специална газова смес за ускоряване на растежа на микобактериите. За да се получи растеж на микобактериите върху тези среди, по време на култивирането се създава атмосфера с повишено съдържание на въглероден диоксид (4-7%). За тази цел се използват специални CO2 инкубатори _. Най-голямо развитие обаче са получили автоматизираните системи за култивиране на микобактерии: MGIT-BACTEC-960 и MB/Bact.

Една от такива системи е системата MGIT (епруветка за индикация на растежа на микобактерии), която е високотехнологична разработка и е предназначена за ускорена бактериологична диагностика на туберкулоза и определяне на чувствителността на микобактериите към лекарства от първа линия и някои лекарства от втора линия. MGIT е предназначена за употреба като част от устройството VASTEC-960. Микроорганизмите се култивират в специални епруветки с течна хранителна среда на базата на модифицирана среда Middlebrook-7H9. За стимулиране на растежа на микобактериите и потискане на растежа на чужда микрофлора се използват добавката MGIT Growth Supplement и смес от антибактериални лекарства PANTA.

Растежът на микроорганизмите се регистрира оптически. Той се основава на флуоресценцията, която възниква, когато микобактериите консумират кислород по време на растежа си. Кислород-зависим флуорохромен багрило се съдържа на дъното на специална епруветка и е покрито със слой силикон. Размножаването на микобактериите води до намаляване на количеството кислород в епруветката и намаляване на неговата концентрация, което причинява увеличаване на флуоресценцията, която става видима, когато епруветката се облъчи с ултравиолетова светлина и се регистрира автоматично от фотосензори, вградени в устройството VASTES-960. Интензитетът на луминесценцията се регистрира в растежни единици (GU). Данните за растежа се въвеждат автоматично в компютър, където могат да бъдат запазени. Компютърният анализ на кривите на растеж може да предостави информация за наличието на различни пулове от микобактерии, включително нетуберкулозни, а също така помага за оценка на растежните свойства на микобактериите.

В резултат на въвеждането на подобни системи, времето за растеж на микобактериите е значително намалено, като средно е 11 дни на VASTEC-960 и 19 дни на MB/Bact спрямо 33 дни на стандартна плътна хранителна среда. Трябва да се отбележи, че тези системи изискват висококвалифициран персонал. Засяването на материал върху течни среди е задължително съпроводено със засяване върху средата на Lowenstein-Jensen, която играе ролята на резервна в случаите, когато туберкулозните микобактерии не растат върху други среди.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Определяне на лекарствената чувствителност на микобактериите

Определянето на спектъра и степента на чувствителност на микобактериите към противотуберкулозни лекарства е от голямо клинично значение, както и за епидемиологичната оценка на разпространението на лекарствено-резистентна туберкулоза. Освен това, мониторингът на лекарствената резистентност ни позволява да оценим ефективността на противотуберкулозната програма като цяло, като е неразделен показател за работата на всички компоненти на противотуберкулозните мерки.

Честота и време на тестване за лекарствена чувствителност:

• преди началото на лечението, веднъж, за да се определи стратегията и тактиката на лечение:
• При изолиране на култури от различни материали от пациент (храчки, BAL, урина, ексудати, цереброспинална течност и др.), всички изолирани щамове се изследват:
• в края на интензивната фаза на лечение при липса на клинична и радиологична динамика:
• ако е необходимо да се промени режимът на лечение в случай на:
  • липса на негативност на храчки;
  • повторна култура след отрицателен резултат от храчки;
  • рязко увеличение на количеството на AFB в натривка след първоначално намаление. Добре известно е, че от материал от пациент с туберкулоза се изолират щамове на Mycobacterium tuberculosis с различна лекарствена чувствителност. Чувствителността на щамовете към противотуберкулозни лекарства може да се различава по спектър на лекарствата, степен, честота и скорост на развитие на резистентност.

Степента на лекарствена резистентност на Mycobacterium tuberculosis се определя в съответствие с установени критерии, които са фокусирани върху клиничното значение на резистентността и зависят от противотуберкулозната активност на лекарството, неговата фармакокинетика, концентрация в лезията, максималната терапевтична доза и др.

Определянето на лекарствената чувствителност на микобактериите понастоящем се извършва с помощта на микробиологични методи:

• абсолютни концентрации (метод на разреждане върху твърди или течни хранителни среди),
• пропорции,
• коефициент на съпротивление.

Обикновено резистентността се проявява под формата на визуално наблюдаван растеж на колонии от микобактерии туберкулоза, но съществуват методи, които индуцират растеж в ранните етапи на клетъчното делене на микобактериите под формата на цветни реакции. Тези методи намаляват времето за тестване от 3-4 на 2 седмици.

Методът на абсолютна концентрация, препоръчан от Комитета по химиотерапия на СЗО, е получил широко разпространение в Русия като унифициран метод. От методологична гледна точка той е най-простият, но изисква висока стандартизация и прецизност на лабораторните процедури. Тестът за лекарствена чувствителност се състои от набор от епруветки с хранителна среда, модифицирана с противотуберкулозни лекарства. Комплектът се състои от 2-3 епруветки с различни концентрации на всяко от използваните лекарства, една контролна епруветка със среда без лекарството и една епруветка, съдържаща 1000 μg/ml натриев салицилат или 500 μg/ml паранитробензоена киселина за откриване на растежа на нетуберкулозни микобактерии.

За приготвяне на набор от среди с препарати се използва модифицирана среда на Lowenstein-Jensen (без нишесте), която се излива в колби. Към всяка от колбите се добавя определен обем от съответното разреждане на противотуберкулозното лекарство. Съдържанието на колбите се разбърква добре, излива се в епруветки и се коагулира в наклонено положение в продължение на 40 минути при температура 85°C. Препоръчва се средата да се коагулира в електрически коагулатор с автоматичен контрол на температурата. Среда с противотуберкулозни лекарства

Първият ред може да се съхранява в хладилник при 2-4 °C в продължение на 1 месец, с лекарства от втори ред - не повече от 2 седмици. Съхранението на среди с лекарства при стайна температура е неприемливо. При приготвяне на разтвори на противотуберкулозни лекарства се взема предвид тяхната активност, като концентрацията се изчислява с корекция за молекулното тегло на неспецифичната част на лекарството, чистотата и др. За определяне на лекарствената чувствителност се използват само химически чисти вещества.

Принципът на метода е да се определи концентрацията на противотуберкулозно лекарство, която потиска растежа на значителна част от популацията на микобактериите. Когато се прилага правилно, този метод е с добра надеждност.

Преди провеждане на теста е необходимо да се уверите, че изолираната култура от Mycobacterium tuberculosis не съдържа странична микрофлора. От културата от микобактерии в 0,9% разтвор на натриев хлорид се приготвя хомогенна суспензия, съдържаща 500 милиона микробни тела в 1 ml (оптичен стандарт за мътност 5 единици). Получената суспензия се разрежда с 0,9% разтвор на натриев хлорид (1:10) и по 0,2 ml от суспензията се добавят към всяка епруветка от комплекта хранителни среди. Инокулираните епруветки се поставят в термостат при 37 °C и се държат хоризонтално в продължение на 2-3 дни, така че наклонената повърхност на хранителната среда да се инокулира равномерно със суспензията от Mycobacterium tuberculosis. След това епруветките се преместват във вертикално положение и се инкубират в продължение на 3-4 седмици. Резултатите се записват след 3-4 седмици.

Тъй като времето, необходимо за изолиране на патогена от клиничен материал върху хранителни среди, е най-малко 1-1,5 месеца, резултатите от определянето на лекарствената чувствителност с този метод могат да бъдат получени не по-рано от 2-2,5 месеца след посяването на материала. Това е един от основните недостатъци на метода.

Резултатите от тестовете за чувствителност на микобактериите към лекарства се интерпретират въз основа на определени критерии. Върху твърди среди културата се счита за чувствителна към концентрацията на лекарството, съдържащо се в средата, ако броят на микобактериалните колонии, култивирани в дадена епруветка с лекарството, не надвишава 20 с обилен растеж в контролна епруветка без лекарства. Само ако има повече от 20 колонии, културата се счита за резистентна към дадена концентрация. На практика, когато се получат резултати от растеж в епруветки, близки до 20 CFU, е необходимо да се уведоми клиничното звено, че чувствителността или резистентността в този случай е гранична, тъй като това понякога може да обясни неясната динамика на клиничните показатели.

За различните препарати се установява определена концентрация, при която се наблюдава възпроизвеждането на критична част от микобактериалната популация. Тези концентрации се наричат „критични“. Мащабът на растеж на микобактериалната популация върху хранителна среда с препарат в критична концентрация се използва като критерий за стабилност.

В домашната фтизиатрична практика, при определяне на лекарствената резистентност, те не се ограничават само до определяне на критични концентрации. Това се дължи на факта, че разширеното определение на нивото на лекарствена резистентност на патогена позволява на клинициста по-правилно да формулира химиотерапевтични тактики, използвайки знания за потенциращия ефект на лекарствените комбинации, да предвиди кръстосана резистентност или да използва по-ефективни лекарства от използваната група противотуберкулозни лекарства.

Методът на абсолютната концентрация е най-простият, но и най-чувствителен към грешки, допускани при прилагането му. По-надежден, особено при определяне на чувствителността към лекарства от втора линия, и широко разпространен извън Русия е методът на пропорциите. Той отчита недостатъците на метода на абсолютната концентрация, но е по-трудоемък за прилагане.

Методът е много подобен на метода на абсолютната концентрация. Подготовката на епруветките с лекарства е същата, както при метода на абсолютната концентрация. Посевната доза на суспензията на туберкулозните микобактерии обаче е намалена 10 пъти, което елиминира честотата на спонтанна резистентност на някои щамове на туберкулозни микобактерии към лекарства като етамбутол, протионамид, капреомицин. Като контроли се използват 2 или 3 епруветки с посевна доза, равна на тази в епруветките, последователно разредени 10 и 100 пъти. Критерият за резистентност е делът на визуално наблюдавания растеж на туберкулозните микобактерии. За лекарства от 1-ва линия критерият за резистентност е излишен растеж от 1% от началната популация, за лекарства от 2-ра линия - растеж от 1 или повече от 10% от началната, в зависимост от избраната критична концентрация.

През 1997 г. работната група на СЗО и Международния съюз срещу туберкулозата за откриване на резистентност към противотуберкулозни лекарства направи корекции в тези критерии, като предложи да се считат за резистентни микобактериите, растящи върху плътната яйчена среда на Ловенщайн-Йенсен при следните концентрации:

• дихидрострептомицин - 4 μg/ml;
• изониазид - 0,2 µg/ml:
• рифампицин - 40 мкг/мл:
• Етамбутол - 2 мкг/мл.

През 2001 г. бяха предложени критични концентрации за следните лекарства от втора линия (за критична пропорция от 1%):

• капреомицин - 40 мкг/мл;
• протионамид - 40 мкг/мл;
• канамицин - 30 μg/ml;
• виомицин - 30 μg/ml;
• циклосерин - 40 мкг/мл;
• аминосалицилова киселина - 0,5 мкг/мл;
• офлоксацин - 2 мкг/мл.

Резултатите от растежа се оценяват след 4 седмици като предварителни и след 6 седмици култивиране като окончателни.

За определяне на лекарствената чувствителност към пиразинамид, който се използва широко в съвременната химиотерапия на туберкулоза, препоръчителната критична концентрация е 200 μg/ml. Все още обаче няма общоприет метод за определяне на лекарствената резистентност към това лекарство върху твърди хранителни среди, тъй като антибактериалната му активност се проявява само в киселинна среда (pH <6), което е технически трудно за поддържане. Освен това, много клинични култури на Mycobacterium tuberculosis не са склонни да растат върху яйчни среди с киселинна среда.

За да се оцени качеството на резултатите от определянето на лекарствената чувствителност на микобактериите, се препоръчва всяка нова партида от средата на Lowenstein-Jensen да се контролира чрез паралелно определяне на чувствителността на стандартния музеен щам H37Rv. Освен това, съществуват определени микробиологични критерии, които трябва да бъдат изпълнени, за да могат методите да дадат добре възпроизводим и правилно интерпретиран резултат. Те включват жизнеспособността на културата от туберкулозни микобактерии, правилата за получаване на хомогенна суспензия и суспензия, правилата за избор на култури от туберкулозни микобактерии и представителността на избраната бактериална маса. Надеждността на определянето на лекарствената резистентност намалява при изключително лошо бактериално отделяне.

Наскоро методът за определяне на лекарствена чувствителност с помощта на автоматизирани системи е признат за обещаващ. Най-модерните в тази област са разработките, базирани на VASTEC MGIT-960. В този случай лекарствената чувствителност на туберкулозните микобактерии се определя въз основа на метод на модифицирана пропорция. По време на определянето се сравнява скоростта на растеж на туберкулозните микобактерии в контролната епруветка и в епруветките с лекарства. За определяне на чувствителността към стрептомицин, изониазид, рифампицин и етамбутол се използват обогатяващи добавки и антибиотици, включени в комплекта SIRE. За определяне на чувствителността към пиразинамид се използва комплектът PZA. По време на теста епруветките с лекарства се инокулират със суспензия от туберкулозни микобактерии, както и контролни епруветки със 100-кратно разреждане на суспензията за всички лекарства, с изключение на пиразинамид, където разреждането на суспензията е 10 пъти. Критерият за стабилност е индикаторът за растеж на микобактериите от 100 GU, когато растежът в контролната епруветка достигне 400 GU (вижте „Културални методи за изолиране на микобактерии“). Резултатите се записват и интерпретират автоматично и се задават от въведената или избраната програма.

Крайните концентрации в епруветката с течна хранителна среда се използват като критични концентрации. Понастоящем критични концентрации са разработени както за лекарства от първа линия, така и за някои лекарства от втора линия. Трябва да се отбележи, че определянето на чувствителността на туберкулозните микобактерии към циклосерин и аминосалицилова киселина се извършва само върху яйчни хранителни среди.

Подробен протокол за работа с описаната система позволява изследване на лекарствената чувствителност както върху изолирана култура (с плътна хранителна среда), така и с помощта на първичен растеж на микобактерии в MGIT епруветка. Последният вариант значително намалява времето, необходимо за провеждане на културални изследвания, позволявайки получаването на пълни резултати от културата на туберкулозните микобактерии (включително информация за лекарствената чувствителност) в рамките на 3 седмици след събиране на материала, докато традиционният метод може да осигури това едва до 3-тия месец. Навременните резултати, когато пациентът е в интензивната фаза на лечение, могат да компенсират относително високата цена на изследванията.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Диференциация на микобактерии

Като се има предвид, че използваните хранителни среди не са строго селективни, последващата диференциация на изолираните микобактерии се счита за задължителна. Необходимостта от диференциация на микобактериите се дължи на редица особености на патологичните процеси, причинени от представители на рода: различен ход и изход на туберкулозата и микобактериозата, наличие на естествена лекарствена резистентност към някои противотуберкулозни лекарства.

Признато е, че първичната идентификация на микобактериите от комплекса M. tuberculosis от нетуберкулозни микобактерии се извършва според следните характеристики: скорост на растеж върху плътни хранителни среди, образуване на пигменти, морфология на колониите, наличие на киселинна устойчивост и температурен оптимум за растеж.

За съжаление, няма един-единствен лабораторен метод, който може надеждно да разграничи микобактериите от комплекса M. tuberculosis от други киселинно-устойчиви микобактерии; въпреки това, комбинацията от описаните по-горе признаци с резултатите от редица биохимични тестове, дадени по-долу, позволява идентифицирането на микобактериите от комплекса M. tuberculosis с вероятност до 95%.

За да се диференцират микобактериите от комплекса M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii и други) от бавно растящите нетуберкулозни микобактерии, се използват основни биохимични тестове за откриване на наличието на следните признаци:

• способност за производство на никотинова киселина (ниацинов тест):
• нитратредуктазна активност;
• термостабилна каталаза;
• растеж върху среда с натриев салицилат (1 mg/ml).

Като допълнителен тест могат да се използват и тестове за растеж върху среда, съдържаща 500 μg/ml пара-нитробензоена киселина или 5% натриев хлорид.

Много бактериологични лаборатории идентифицират тези микроорганизми само на комплексно ниво, което се дължи на ограничените възможности на лабораториите и методологичните възможности на специалистите.

В повечето случаи на практика следните тестове са достатъчни за диференциране на M. tuberculosis и M. bovis: ниацин, нитрат редуктаза, пиразинамидаза и регистрация на растежа върху среда, съдържаща 2 μg/ml тиофен-2-карбоксилна киселина хидразид. Взема се предвид, че микобактериите от комплекса M. tuberculosis се характеризират със следния набор от характеристики:

• бавен растеж (повече от 3 седмици);
• температура на растеж в рамките на 35-37 ^° C;
• липса на пигментация (цвят на слонова кост);
• изразено киселинно-устойчиво оцветяване;
• положителен тест за ниацин;
• положителен тест за нитрат редукция;
• липса на термостабилна каталаза (68 ^° C).
• липса на растеж върху среда на Lowenstein-Jensen, съдържаща:
  • 1000 µg/ml натриева салицилова киселина,
  • 500 мкг/мл пара-нитробензоена киселина,
  • 5% натриев хлорид:
• растеж в присъствието на 1-5 μg/ml тиофен-2-карбоксилна киселина.

Актуалността на диференциацията на изолираните микобактерии ще се увеличи значително с нарастването на честотата на регистрация на случаи на ХИВ/СПИН, свързани с туберкулоза или микобактериоза. В момента няма абсолютна сигурност за готовността на практическите регионални лаборатории да извършват правилно този обем работа.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Имунологична диагностика на туберкулозата

Съществуват редица универсални явления, препарати и имунологични тестове, които първоначално са открити специално при туберкулоза или в модела на имунен отговор към микобактерии. Те включват БЦЖ и туберкулин, явление като кожен DST (туберкулинови проби - реакции на Пирке и Манту), реакцията към подкожно приложение на туберкулин на сенсибилизирани животни (феномен на Кох). Някои от първите антитела при инфекциозни заболявания също са открити при туберкулоза. Разбира се, колкото по-дълбоко е разбирането на механизмите на противотуберкулозния имунитет и техния генетичен контрол, толкова по-широко може да се използва имунологичните методи и препарати, влияещи върху имунитета, за решаване на практически проблеми на фтизиатрия.

Най-важният и сложен практически проблем в момента се счита за откриването на туберкулоза в процеса на масов скрининг на населението. Въпреки многобройните съобщения за „успехи“ (върху ограничен материал), обаче, няма имунологичен метод (възпроизводим във „всякакви ръце“) или лекарство, подходящо за тези цели.

Имунологичните методи, по-специално серологичните изследвания (определяне на антигени, антитела) и туберкулиновите провокационни тестове, се използват широко в клиничната практика.

Серологичните методи, които определят антигени и антитела в различни среди на тялото, са на първо място сред имунологичните изследвания, използвани в диференциалната диагностика.

Специфичността на определянето на антитела срещу микобактерии туберкулоза зависи от антигените, използвани в имунния анализ. Предложени са значителен брой антигени, първият от които е туберкулинов PPD:

• PPD и други сложни препарати от културална течност;
• ултразвуков дезинтегратор;
• Екстракт от тритон и други сложни препарати от клетъчни стени;
• 5-антиген (Даниел);
• 60-антиген (Coccito);
• липоарабиноманан;
• кордов фактор (трехалоза-6,6-ди-миколат);
• фенолни и други гликолипиди;
• липополизахариди;
• фибронектин-свързващ антиген;
• протеини (най-често рекомбинантни); 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15.12 KDA и др.

В резултат на дългогодишни изследвания на руски и чуждестранни учени бяха идентифицирани основните модели на образуване на антитела и ефективността на серологичната диагностика на туберкулозата: колкото по-сложен е антигенът, толкова по-висока е чувствителността и по-ниска специфичност на тестовете. Специфичността варира в различните страни в зависимост от инфектираността на населението с M. tuberculosis и нетуберкулозни микобактерии, от BCG ваксинацията и др. При децата информативността на серодиагностиката е по-ниска, отколкото при възрастните. При първична туберкулоза (по-често деца) определянето на IgM е по-информативно; при вторична туберкулоза - IgG. При HIV-инфектирани хора информативността на серодиагностиката при определяне на антитела е намалена. Ефективността на определянето на антитела зависи от редица „клинични моменти“: активността на процеса (наличие или отсъствие на „изолиране“ на микобактерии, наличие на кариозни кухини, степен на инфилтрация), разпространението на процеса, продължителността на неговия ход.

Чувствителността на метода на ензимния имуноанализ (EIA) е около 70%. Недостатъчната ефективност на изследването се дължи на ниската му специфичност. Преди това бяха разгледани възможностите за използване на серологичен скрининг при групи с висок риск, по-специално сред хора с посттуберкулозни промени в белите дробове.

За повишаване на специфичността на ELISA се търсят по-специфични антигени, включително получени чрез генно инженерство: ESAT-6 и др. (виж по-горе). Използването на строго специфични антигени (38 kDa, ESAT) повишава специфичността, но значително намалява чувствителността на анализа. Наред с ELISA (експериментални лабораторни тестови системи, като Pathozyme ELISA kit), се предлагат и имунохроматографски комплекти с латерална филтрация (Mycodot), както и други подобни тестове (мембранен точков анализ) с визуална оценка на резултата от теста. При провеждането на тези тестове анализът отнема 10-30 минути; те не изискват специално оборудване, изискват визуална оценка на резултатите, което е свързано с известна субективност. Тези методи имат приблизително същите характеристики на чувствителност и специфичност (съответно 70% и 90-93%) като традиционния ELISA.

Използването на методи за имунен анализ има определена стойност като допълнителен метод, взет предвид в комплекса от методи, използвани в диференциалната диагноза на туберкулозата, особено при диагностицирането на нейните екстрапулмонални форми. ELISA методът е най-ефективен при диагностицирането на туберкулозен менингит при изследване на цереброспиналната течност. В този случай чувствителността на анализа е 80-85%, а специфичността е 97-98%. Има информация за ефективността на определянето на антитела към Mycobacterium tuberculosis в слъзната течност при диагностицирането на туберкулозен увеит.

Индукция на синтеза на гама интерферон in vitro

Гама интерферонът (IFN-γ) е фактор на специфична имунна защита, реализирана чрез активиране на ензимните системи на макрофагите. Индуцирането на синтеза на IFN-γ от сенсибилизирани Т-лимфоцити се дължи на взаимодействието им с микобактериални антигени.

Като антигени се използват както туберкулинов PPD, така и специфични антигени, получени чрез генно инженерство, по-специално антиген ESAT-6 (ранно секретиран антиген с молекулно тегло 6 kDa) и CFP-10 (протеин на културален филтрат, 10 kDa). Генетично модифицирани или рекомбинантни антигени липсват в клетките на BCG ваксината и други микобактерии. При използване на туберкулин резултатите от IFN-γ индукционния тест са сравними с резултатите от туберкулиновия кожен тест (директна корелация). При използване на генетично модифицирани антигени резултатите от теста са по-специфични и не зависят от предишна BCG ваксинация. При изследване на ваксинирани лица, които не са имали контакт с туберкулозна инфекция, специфичността на теста е 99%. Чувствителността на теста сред пациенти с туберкулоза варира от 81 до 89%.

Разработени са тестове и диагностични методи, базирани на краткосрочно култивиране на цели кръвни клетки или мононуклеарни клетки, изолирани от кръв с антигени на туберкулозни микобактерии in vitro, последвано от определяне на концентрацията на IFN-γ или преброяване на броя на Т-лимфоцитите, синтезиращи IFN-γ. Концентрацията на синтезиран интерферон в епруветка се определя чрез ELISA, използвайки моноклонални антитела, които се свързват с IFN-γ. След това, чрез калибриране на стандартния IFN-γ, се определя неговата концентрация в епруветката или ямките на плаката.

В Elispot теста, броят на Т-клетките, синтезиращи IFN-γ, се преброява върху повърхността на блюдо, покрито с антитела срещу IFN-γ.

Разработчиците на ин витро IFN-γ индукционната диагностика, одобрена от Американската агенция по храните и лекарствата (FDA), твърдят, че тестът не може да разграничи латентната туберкулозна инфекция от активната туберкулоза. Следователно, в региони с висок процент на инфекция, тестът няма пряка диагностична стойност. В нашата страна обаче той може да се използва за разграничаване на туберкулозната инфекция при деца от постваксинална алергия, както и за оценка на нивото на специфичен имунитет по време на лечение.

В момента се проучва вътрешна тестова система за определяне на индуцирането на синтеза на IFN-γ от специфични туберкулозни антигени in vitro.

Имунен статус и протичане на туберкулозата, имунокорекция

По време на лечението на туберкулоза при хората настъпват промени в антигенемията и състоянието на имунната система.

Данните за промените в ексудатите и тъканите са до голяма степен противоречиви. Единственото, което може да се отбележи с пълно основание, е, че туберкулозните грануломи, като правило, съдържат значителен брой активирани Т-лимфоцити.

Има смисъл да се спрем на още два момента, които са необходими, за да се разбере ролята на имунологичните механизми при лечението на туберкулоза при хората:

• Пациентите със СПИН имат особено висока честота на развитие на множествена лекарствена резистентност;
• В случай на множествена лекарствена резистентност (и при липса на HIV инфекция), имунните нарушения (предимно Т-клетъчният имунитет) са особено значими.

При туберкулозата широко се използват различни методи за имунокорекция: на първо място, това са лекарства, които действат главно върху Т-клетъчния имунитет и мононуклеарната фагоцитна система (тимусни хормони, изофон, ликопид, полиоксидоний и др.), както и цели (атенюирани) микобактерии и техните компоненти.

Молекулярно-биологична диагностика на туберкулозата

Методите на молекулярната биология в диагностиката на инфекциозните заболявания включват главно методи, базирани на манипулиране на геномни материали на бактериални и вирусни патогени с цел идентифициране на специфичен генетичен материал - ДНК секции с нуклеотидна последователност, специфична за даден вид или щам на патогена, за анализ на специфични ДНК последователности в гени, които определят чувствителността на патогена към определени лекарства, както и за анализ на функционалната активност на определени гени на патогена. Молекулярно-биологичните методи са получили широко разпространение в научните изследвания и практическото приложение в диагностиката и мониторинга на различни бактериални и вирусни инфекции след откриването на полимеразната верижна реакция през 1985 г. от Кари Мълис (носител на Нобелова награда. 1989 г.).

Принципи и възможности на метода на полимеразно-верижната реакция

PCR позволява амплификация (умножение) на нуклеотидна последователност (фрагмент от патогенна ДНК) в епруветка за няколко часа милиони пъти. Провеждането на реакцията в присъствието на единични ДНК вериги определя изключително високата чувствителност на анализа.

Нуклеотидната последователност на определени участъци от ДНК веригата определя генетичната уникалност на микроорганизма, което обяснява високата специфичност на PCR.

Значението на този метод за откриване и изследване на характеристиките на Mycobacterium tuberculosis се дължи на биологичните характеристики на микроорганизма, който има много бавен растеж: времето за удвояване на ДНК на Mycobacterium tuberculosis по време на култивирането им е 12-24 часа.

Принципът на PCR метода е амплификация - многократно, милионно умножаване на секции от специфична ДНК последователност в микрообем на епруветка с циклично повторение на следните три реакционни етапа, всеки от които протича при различен температурен режим:

• Етап I - денатурация на двуверижна ДНК при нагряване с разминаване на нейните вериги;
• Етап II - комплементарно свързване (хибридизация) на праймери (праймиращи олигонуклеотиди) с крайните секции на веригите на строго специфичен ДНК фрагмент, избран за амплификация;
• Етап III – завършване на веригата на ДНК фрагмента с помощта на термостабилна ДНК полимераза.

За амплификация епруветката трябва да съдържа молекули матрична ДНК. Четири вида дезоксинуклеозидни трифосфати (нуклеотиди), съдържащи съответните азотни бази: аденин (А), тимин (Т), гуанин (G), цитозин (С); изкуствено синтезирани праймерни олигонуклеотиди (праймери), състоящи се от 18-20 базови двойки; термостабилен ензим, ДНК полимераза, с температурен оптимум от 68-72 ^° C и магнезиеви йони.

Специфичността на PCR зависи от избора на ДНК фрагмент. В съответствие с него се синтезират фланкиращи праймерни олигонуклеотиди. Специфичността на хибридизацията и завършването на ДНК веригата се определя от принципа на комплементарност на следните двойки азотни бази: аденин-тимин, гуанин-цитозин.

За определяне на генома на микобактериите от туберкулозен комплекс, най-ефективната цел за амплификация в повечето тестови системи е ДНК фрагментът IS6110, който в повечето щамове на туберкулозни микобактерии има значителен брой (10-20) повторения в генома, което осигурява, наред със специфичността, висока чувствителност на анализа. Същевременно са описани щамове на туберкулозни микобактерии с малък брой повторения или липса на фрагмента IS6110.

Екстракция на ДНК молекули от биологична проба

За да се извърши PCR, ДНК молекулите на патогена трябва да бъдат изолирани от биологичния материал в минимален обем, с минимално количество неспецифична ДНК и различни инхибитори на ензима - ДНК полимераза.

Подготовката на пробите трябва да се извършва при условия, които предотвратяват кръстосано замърсяване на изследваните проби с изолирани ДНК молекули. Това изисква предварителна обработка на помещението с ултравиолетова светлина, подовете и работните повърхности на маси и устройства - с разтвори, съдържащи хлор. Необходимо е също така да се използват чисти ръкавици, епруветки за еднократна употреба и накрайници за автоматични пипети.

За да се изолира ДНК на Mycobacterium tuberculosis от клинични проби (цереброспинална течност, бронхиален лаваж), които не съдържат голям брой левкоцити, клетъчни остатъци или соли, е достатъчно пробата да се центрофугира при 3-4 хиляди оборота в минута, да се добавят 20-30 µl от 2% разтвор на Triton X-100 към утайката и да се нагрее при 90 ^° C в продължение на 30 минути.

Приготвянето на проба от храчки изисква ефикасно втечняване, обикновено с използване на 4% натриев хидроксид и N-ацетил-L-цистеин (NALC) в количество 50-80 mg на проба, в зависимост от вискозитета на пробата. Разтворът на NALC трябва да се приготви ex tempore или NALC прах може да се добави сух директно към пробата. След втечняване пробите трябва да се центрофугират в продължение на 15 минути при 3500-4000 rpm (3000 g) в 50 ml епруветки с винтова капачка, т.е. при същите условия, препоръчани за приготвяне на храчки преди култивиране.

За екстрахиране на ДНК от седимент най-често се използва метод, базиран на използването на 5-6 моларен разтвор на гуанидин изотиоцианат като лизиращ реагент и микропорести частици силициев оксид („диатомит“), които сорбират ДНК молекули. Неспецифичните вещества, включително евентуални инхибитори, след това се промиват в 2,5 моларен разтвор на гуанидин изотиоцианат и етанолов разтвор, след което ДНК молекулите се десорбират във вода и тези проби се използват за извършване на PCR. За да се опрости технологията на екстракция на ДНК, „диатомитът“ често се заменя с магнитни микрочастици, покрити със силициев оксид. В този случай вместо центрофугиране се използва специална магнитна стойка за микроепруветки за утаяване на частиците.

В Русия е разработен оригинален метод за имуномагнитно разделяне на микобактерии с последваща екстракция на патогенна ДНК. За имуномагнитно разделяне на туберкулозни микобактерии се използват ферочастици с размер 3-5 μm, покрити със силициев оксид, към които чрез химическа връзка се прикрепят поликлонални (заешки) антитела към туберкулозни микобактерии. Пробите от храчки след алкално лизиране се неутрализират с киселинен разтвор на Tris-HCl и се инкубират с имуномагнитен сорбент. След това имуноферочастиците се събират с помощта на магнитна пръчка със сменяем връх, прехвърлят се в микроепруветка и се утаяват. Добавят се 20-30 μl от 2% разтвор на Triton X-100 и се нагряват 30 минути при 90 ^° C. Супернатантът се използва като ДНК матрица за PCR анализ.

Труден проблем е екстракцията на ДНК на туберкулозни микобактерии от биопсични проби. За биопсичен лизис се използва ензимът протеиназа К в крайна концентрация от 200-500 mg/l при температура 56 ^° C в продължение на една нощ. След това се екстрахира с помощта на един от известните методи. Излишната неспецифична ДНК в PCR анализа на биопсични проби често води до инхибиране на реакцията, което изисква повторна екстракция на ДНК.

Методи за откриване на резултати

След завършване на реакцията, амплифицираните фрагменти от патогенна ДНК се идентифицират с помощта на различни методи.

Методът на гел електрофореза е добре познат. В този случай полученият ДНК фрагмент се идентифицира чрез положителна контрола, съдържаща желания специфичен ДНК фрагмент, или чрез предварително известен размер (брой нуклеотидни двойки) на фрагмента, който се определя с помощта на стандартен молекулярен маркер.

В присъствието на специфично багрило - етидиев бромид, което е включено в двуверижната ДНК, синтезираният ДНК фрагмент се разкрива като лента, която свети под въздействието на ултравиолетова светлина.

Размерът на ДНК фрагмента, определен чрез електрофореза въз основа на изминатото разстояние от началото, трябва да съответства на известен маркер за молекулно тегло или положителен контрол.

Други методи за определяне на PCR резултатите се основават на хибридизацията на едноверижни PCR продукти с комплементарен олигонуклеотид - ДНК сонда, белязана с биотин, последвано от откриване с помощта на ензимна реакция, например чрез свързване на конюгат стрептавидин-алкална фосфатаза с биотин.

На базата на този тип откриване са създадени PCR анализатори, при които откриването на PCR резултатите се извършва автоматично в резултат на отчитане на оптичната плътност в пробите след протичане на ензимната реакция.

Недостатъците на тези методи включват възможността за вътрешнолабораторно замърсяване с доста къси фрагменти от ДНК молекули. Когато тези молекули попаднат в новотествани проби, те се превръщат в матрица за PCR и водят до фалшиво положителни резултати.

В тази връзка, за да се предотвратят фалшиво положителни резултати, се въвеждат строги правила за отделяне и изолиране на помещения: за екстракция на ДНК от биологични проби; помещения за откриване на резултати (електрофореза) от чистата зона. Тези помещения представляват зона на вероятно замърсяване. Друга изолирана зона е чисто помещение за въвеждане на изследваните ДНК проби в епруветки с реакционната смес за PCR. И накрая, предполага се, че основното устройство - ДНК усилвателят - трябва да бъде изнесено в отделна, евентуално офисна, стая.

За да се предотврати замърсяване с продуктите от предишни реакции - ампликони, някои PCR тестови системи съдържат дезоксинуклеозид уридин вместо дезоксинуклеозид тимидин, който се изгражда в съответната позиция по време на in vitro верижния синтез, т.е. азотната база тимин, присъстваща в нативната ДНК, се замества с урацил. Урацил ДНК гликозилазата, добавена към реакционната смес на анализирания материал, разрушава само замърсяващи фрагменти с дезоксиуридин, но не и нативната анализирана ДНК, съдържаща дезокситимидин. Последващото нагряване при 94 ^o C инактивира този ензим и не пречи на амплификацията в PCR.

Съществува тестова система, базирана на изотермична амплификация на рРНК, за която първо се извършва обратна транскрипция и синтез на ДНК молекули, които от своя страна са матрицата за последващ синтез на РНК молекули. РНК ампликоните се откриват с помощта на оцветена с акридин ДНК сонда по време на хибридизация в разтвор в реакционна епруветка. Този метод, освен високата чувствителност, има предимството да провежда анализа в една епруветка, което предотвратява замърсяване. Според авторите, чувствителността на този метод в респираторни проби достига 90% със специфичност от 99-100%.

В PCR в реално време се внедряват нови методи за откриване. Тези методи се различават главно по това, че PCR и откриването на резултатите от нея се извършват едновременно в една затворена епруветка. Това не само технологично опростява метода на анализ, но и предотвратява замърсяването на лабораторните помещения и пробите с продукти от предишна PCR.

При PCR в реално време резултатите се откриват чрез флуоресценция, произтичаща от хибридизацията на флуорогенна ДНК сонда със специфичен ДНК фрагмент, амплифициран по време на PCR. Структурата на флуорогенните ДНК сонди е конструирана по такъв начин, че флуоресцентният маркер се освобождава в резултат на ензимна реакция или се дистанцира от молекулата на гасителя на флуоресценцията само при специфична хибридизация с желаната ДНК молекула, амплифицирана по време на PCR. С увеличаването на броя на молекулите, хибридизирани със сондата, увеличаването на флуоресценцията до откриваемо ниво е пропорционално на броя на молекулите на амплифицирания продукт. Тъй като броят на молекулите на ДНК фрагмента се удвоява по време на всеки PCR цикъл, номерът на цикъла, от който се открива и увеличава флуоресценцията, е обратно пропорционален на броя на ДНК молекулите в оригиналната проба. Ако в реакцията се въведат няколко различни известни концентрации на молекули от съответния фрагмент от ДНК на туберкулозния микобактериум като калибратор, тогава броят на ДНК геномите в изследвания материал може да се изчисли с помощта на компютърна програма.

Всяка стандартна проба се дублира. Количественият критерий е минималният брой PCR цикли, необходими за началото и растежа на откриваема флуоресценция. Абсцисната ос е броят на циклите; ординатната ос е стойността на флуоресценцията. Концентрациите на ДНК са обратно пропорционални на броя цикли, необходими за появата на флуоресценция. Прозорците в дясната колона (21-32) показват номерата на циклите за съответните концентрации. Разликите между 10-кратните концентрации на ДНК фрагменти 10² ^-10⁶ ml са 3,2-3,4 цикъла. За двама пациенти концентрациите на IS6110 фрагменти са били около 10³ ^/ml и ^10⁴ /ml. Като се вземе предвид броят на повторенията (6-20) на анализираните фрагменти в генома на Mycobacterium tuberculosis, броят на Mycobacterium tuberculosis в клиничните проби е съответно около 100 и 1000 клетки.

Приложение на PCR в диагностиката на туберкулоза

PCR методът се използва в най-голяма степен за бърза диагностика на туберкулоза - откриване на Mycobacterium tuberculosis в клинични проби: храчки, бронхиални промивки, плеврален ексудат, урина, цереброспинална течност, остеолизни пункции, аспирати от женския генитален тракт и различни биопсии. В проучване в Холандия на около 500 проби от храчки и бронхиални промивки от 340 пациенти с потвърдена диагноза белодробна туберкулоза е изследвана сравнителната чувствителност на PCR, културалната и натривната микроскопия. Чувствителността на анализа е съответно 92,6, 88,9 и 52,4%. Специфичността на всички методи е около 99%.

Направено е сравнение на ефективността на откриване на Mycobacterium tuberculosis чрез натривна микроскопия, посяване върху среда Lowenstein-Jensen, тест системата VASTES и PCR анализ. PCR показа чувствителност от 74,4%, микроскопия - 33,8%, посяване върху твърда среда - 48,9% и VASTES - 55,8%. Средното време за откриване при посяване върху среда Lowenstein-Jensen е 24 дни, VASTES - 13 дни, PCR - 1 ден.

Обсъжда се и потенциалът за използване на PCR като чувствителен и бърз метод за наблюдение на ефективността на лечението на туберкулоза.

Откриването на ДНК на Mycobacterium tuberculosis чрез PCR метода с ефективна химиотерапия се определя за по-дълъг период от време - средно 1,7 месеца в сравнение с бактериалната екскреция, определена чрез флуоресцентна микроскопия, и 2,5 месеца в сравнение с бактериологично изследване.

Диагностика на екстрапулмонални форми на туберкулоза

Значението на PCR като чувствителен метод е особено голямо за екстрапулмонални форми, тъй като именно при тези форми клиничните и радиологичните методи и традиционните бактериологични методи за определяне на Mycobacterium tuberculosis в диагностични материали са неефективни.

При изследване на проби от урина, резултатите от PCR анализа са положителни при 16 от 17 пациенти с активна туберкулоза на пикочната система и отрицателни при 4 пациенти с неактивна бъбречна туберкулоза и 39 пациенти с нетуберкулозни заболявания на пикочната система.

Демонстрирана е ефикасността на PCR анализа при изследване на аспирати от костен мозък при пациенти с треска с неизвестен генезис и съмнение за туберкулозен характер на заболяването. За диагностициране на туберкулозен лимфаденит при деца са изследвани 102 пункционни аспирата и биопсични проби от 67 деца със съмнение за туберкулозен лимфаденит. Получени са положителни резултати: чрез PCR в реално време - 71,6%, флуоресцентна микроскопия - 46,3%, културално изследване - 41,8%. При изследването на 50 биопсии на лимфни възли при пациенти с болестта на котешката драскотина всички резултати са отрицателни. По този начин е демонстрирана 100% специфичност на PCR анализа. В същата работа е показана възможността за откриване на M. avium при пункционна биопсия на лимфни възли.

Диагностицирането на женска генитална туберкулоза при безплодие е известно като един от най-трудните диагностични проблеми. Положителни резултати са получени при PCR изследвания на ендометриални биопсии, ендометриални аспирати и проби от течност от Дъгласов торбичка при 14 (56%) от 25 пациенти, изследвани лапароскопски със съмнение за туберкулоза. Микроскопията с натривка и културалните изследвания дават съответно 1 и 2 положителни резултата. Тези случаи също са PCR-положителни. Повечето PCR-положителни резултати са в случаи с характерни белези на туберкулозата според хистологичното изследване; по-малък брой са в случаи със съмнение за туберкулоза според лапароскопия. Само един положителен PCR резултат е получен при липса на лапароскопски данни за туберкулоза.

При диагностициране на екстрапулмонални форми на туберкулоза, клиницистите често имат въпрос относно възможността за идентифициране на патогена при изследване на кръвни проби с помощта на PCR метода. Литературните данни показват, че откриването на ДНК на Mycobacterium tuberculosis от кръвни проби е възможно при напреднали форми на HIV инфекция. ДНК на Mycobacterium tuberculosis е открита само при генерализирана туберкулоза на различни органи при пациенти с трансплантиран бъбрек и имуносупресия.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Видова идентификация на микобактерии

PCR методът може да бъде доста ефективен за бързо идентифициране на микобактерии от туберкулозния комплекс и някои видове нетуберкулозни микобактерии след получаване на техния първичен растеж. В този случай използването на PCR може да спести 7-10 дни, необходими за последваща културална идентификация на положителен резултат. PCR изследването е технически много просто, тъй като не изисква сложна подготовка на пробата от клиничен материал за постигане на висока чувствителност. При изследване на 80 положителни култури в такава тестова система (MB BacT. от Organon), всички положителни резултати от PCR анализа са строго специфични и са проведени в рамките на 1 ден. За идентифициране на други видове микобактерии, когато са получени в култура, ДНК на патогена се хибридизира със специфични ДНК сонди, маркирани с акридин, а щамовете се откриват чрез появата на хемилуминесценция с помощта на хемилуминометър или върху нитроцелулозни ленти с визуална оценка след хибридизация. Този комплект идентифицира ограничен брой видове: Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. avium complex, M. kansasii и M. gordonae.

А. Теленти и др. също разработиха относително прост и евтин метод за видова идентификация на клинично важни микобактерии, базиран на PCR и последваща обработка с два рестрикционни ензима (ензими, които имат способността да режат ДНК молекула в специфични точки). В този случай се амплифицира ДНК фрагмент, кодиращ топлинно-шоков протеин (65 kDa), след което полученият при PCR ДНК фрагмент с размер 439 нуклеотидни двойки се обработва отделно с два ензима - Bste II и Нае III. След това, с помощта на електрофореза в агарозен гел, двата получени продукта се анализират, като се определят техните размери (брой нуклеотидни двойки) с помощта на набор от стандартни ДНК фрагменти (молекулярни ДНК маркери) с дължина от 100 до 1000 нуклеотидни двойки. Във всеки от дефинираните видове (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) се откриват 2 или 3 ДНК фрагмента с различни размери за всеки рестрикционен ензим. Комбинацията от получените ДНК фрагменти с различни размери позволява тези видове да бъдат диференцирани един от друг.

Разработва се технология за биологични ДНК микрочипове, която ще помогне за идентифицирането на повече от 100 вида микобактерии в едно проучване.

Идентифицирането на видовете може да се извърши и чрез PCR амплификация на вариабилния регион на 16S рРНК, последвано от секвениране на ампликоните в сравнение със съответната първична структура, което позволява идентифицирането на повече от 40 вида микобактерии.

PCR може да се използва и за идентифициране на видове в рамките на туберкулозния микобактериален комплекс, включително диференциация между M. bovis и M. bovis BCG. Това се прави чрез анализ на наличието или отсъствието на определени гени в геномните региони RD1, RD9 и RD10. RD1 липсва в M. bovis BCG, но присъства във вирулентни видове, включително M. bovis.

Определяне на лекарствената чувствителност на Mycobacterium tuberculosis чрез PCR

Задачите на молекулярно-генетичните методи за определяне на лекарствената чувствителност или резистентност на Mycobacterium tuberculosis се свеждат до идентифициране на мутации в определени нуклеотидни последователности на известни гени. Основните методи се основават или на директно отчитане (секвениране) на тези последователности след амплификация, или на хибридизация на амплифицирани по време на PCR ДНК фрагменти, маркирани с биотин, с ДНК сонди. И двата варианта включват идентифициране на замествания в нуклеотидни последователности, които при използване на ДНК сонди водят до липса или непълна хибридизация върху нитроцелулозна мембрана с помощта на ензимен конюгат (стрептавидин-алкална фосфатаза) - методът LIPA-Rif-TB.

Методът за измерване на флуоресценцията в локално фиксирани ДНК сонди върху микрорегиони, комплементарни на известни мутации в PCR-амплифицирани генни региони, отговорни за лекарствената чувствителност или резистентност, се нарича метод на микробиочипове. Основният алгоритъм за провеждане на това изследване е следният. След изолиране на ДНК от клинична проба или микобактериална култура, трябва да се извърши PCR, за да се амплифицират съответните фрагменти от гена groB, отговорен за лекарствената чувствителност към рифампицин, или гените katG и inhA, кодиращи микобактериалните протеини, отговорни за чувствителността към изониазид. Резултатите от PCR се оценяват с помощта на електрофореза в агарозен гел, която потвърждава получаването на съответните ДНК фрагменти с желаната дължина. След това се извършва втори кръг PCR, за да се въведе флуоресцентен маркер в ДНК. Резултатите от PCR се потвърждават отново чрез гел електрофореза. След това се извършва хибридизация (инкубация за една нощ) с последващо промиване на получения материал върху биочип, който представлява голям брой къси ДНК вериги (сонди), фиксирани върху малка стъклена плака, комплементарни на нуклеотидните последователности на лекарствено-чувствителния тип туберкулозни микобактерии в точките на възможни мутации, както и на мутантните последователности, отговорни за лекарствената резистентност. Местоположението на ДНК сондите върху плаката е строго определено и се установява нивото на флуоресценция, наблюдавано по време на хибридизацията, за да се определи резултатът с помощта на специално четящо устройство. В тази връзка резултатите от анализа се определят с помощта на специална компютърна програма.

През последните години са разработени алтернативни методи за определяне на лекарствената чувствителност на Mycobacterium tuberculosis, базирани на технологията за PCR в реално време, което позволява тези изследвания да се провеждат в режим на затворена епруветка.

Фигура 13-13 показва резултата от анализа на клинични култури на Mycobacterium tuberculosis при определяне на лекарствена резистентност към рифампицин, използвайки PCR в реално време: 218 - контролна проба (чувствителна към рифампицин); 93 - положителен контрол за Ser-Trp TCG-TGG мутацията; 4482 - положителен контрол за Ser-Leu TCG-TTG мутацията; 162-322 - експериментални проби. Резултатът от изчисляване на кинетичните криви на амплификация за 4 канала: канал 1: 393 - положителен контрол за Ser-Trp TCG-TGG мутацията; канал 2: 4482 - положителен контрол за Ser-Leu TCG-TTG мутацията; 162, 163, 172, 295 - експериментални проби; канал 4: кинетични криви на амплификация на всички проби, участващи в експеримента. Положителен контрол на реакцията на амплификация. Заключения: Анализът разкри следните мутации, които определят резистентност към рифампицин: в проби 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG-TTG. Същият принцип е използван за определяне на лекарствената резистентност към изониазид чрез гените katG и inhA, които определят най-честите мутации.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Идентифициране на щам на Mycobacterium tuberculosis

Най-изследваният метод за идентифициране на щамове на Mycobacterium tuberculosis е технология, наречена полиморфизъм на дължината на рестрикционните фрагменти (RFLP), която се основава на фрагментация (рестрикция) на ДНК на Mycobacterium tuberculosis от ензима Pvu II и последваща хибридизация на получените фрагменти с определени специфични последователности върху ДНК на неговия повтарящ се елемент IS6110. Вътревидовата вариабилност се реализира поради различния брой IS6110 повторения и тяхното разположение върху ДНК, както и разнообразието от разстояния между определени точки на атака на рестрикционния ензим (рестрикционни сайтове) и елемента IS6110. Тази технология е много сложна и трудоемка. След третиране на ДНК, изолирана от културата на туберкулозния микобактериум, с рестрикционен ензим, се извършва гел електрофореза, след което ДНК фрагменти с различна дължина се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана, хибридизират се с фрагменти от елемента IS6110 и резултатите се откриват с помощта на ензимна реакция. Полученият специфичен лентов модел характеризира ДНК на специфичен щам на туберкулозния микобактериум. Компютърният анализ разкрива идентичността или родствената връзка на щамовете. Въпреки факта, че RFLP методът е най-дискриминационен, т.е. разкрива най-голям брой разлики в анализираните щамове, той е неефективен при малък брой (по-малко от 5) IS6110 повторения, наблюдавани при някои щамове. Фигури 13-14 показват резултатите от RFLP типизирането на щамовете.

Алтернатива може да бъде методът на сполиготипизиране - анализ на полиморфизма на спейсърните ДНК последователности - междинни между директните повторения на DR региона. При провеждане на сполиготипизиране на щамове, PCR се извършва с праймери, ограничаващи DR региона, след което се образуват фрагменти с различна дължина, които се хибридизират с вариабилни междинни ДНК региони. Анализът на спейсърните последователности на DR региона изглежда, според изследователите, по-прост, по-продуктивен и подходящ за първичен скрининг на щамове и предварителен епидемиологичен анализ, както и за директно изучаване на клиничен материал.

Очевидно е, че по-ефективен и технологично достъпен метод е VNTR (съкращение от английски думи) или методът за определяне на променливия брой точни тандемни повторения в ДНК на Mycobacterium tuberculosis. Този метод се основава само на използването на PCR и не изисква допълнителни манипулации. Тъй като броят на тандемните повторения в различните щамове и в различните локуси е различен, фрагменти с различни размери се определят и анализират върху получената електрофореграма на PCR продуктите. Според изследователите, с помощта на VNTR се постига по-голяма степен на дискриминация на щамовете, отколкото с метода RFLP.

През последните години се обръща голямо внимание на разпространението на щамове на Mycobacterium tuberculosis от семейство W-Beijing (понякога наричани щам Beijing), които са до голяма степен устойчиви на лекарства.

Основни изисквания за качеството на молекулярно-биологичните изследвания

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Основни регулаторни документи за провеждане на PCR

Заповеди на Министерството на здравеопазването на Руската федерация: № 45 от 7.02.2000 г.; № 109 от 21.03.2003 г.; № 64 от 21.02.2000 г. Указания: 1.3.1888-04 „Организация на работата по време на PCR изследване на материал, заразен с патогенни биологични агенти от III-IV групи патогенност“; 1.3.1794-03 „Организация на работата по време на PCR изследване на материал, заразен с микроорганизми от I-II групи патогенност“. 2003 г.; 3.5.5.1034-01 „Дезинфекция на тестов материал, заразен с бактерии от I-IV групи патогенност, при работа с PCR метода“, 2001 г. Приложение 11 към Инструкциите за унифицирани методи за микробиологични изследвания при откриване, диагностика и лечение на туберкулоза.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Персонал

Молекулярнобиологични изследвания могат да се извършват от лекари по клинична лабораторна диагностика, бактериолози, вирусолози, биолози по клинична диагностична лаборатория, както и специалисти със средно медицинско образование, преминали специализация и повишаване на квалификацията по установения начин.

Подреждане на лабораторни помещения

Необходими са следните лабораторни съоръжения:

• Зона за обработка на проби - лаборатория, пригодена за работа с инфекциозни агенти от групи патогенност III-IV, в съответствие с Методически указания 13.1888-04.
• Зоната за приготвяне на PCR реакционни смеси е лабораторно помещение, което осигурява защита от вътрешно лабораторно замърсяване - „чиста“ зона.
• • Ако за анализ на PCR продукти се използва електрофореза или хибридизация, лабораторното помещение, в което амплифицираните ДНК фрагменти се извличат от амплификационната епруветка и съответно могат да попаднат в околната среда, в съответствие с изискванията за PCR лаборатории (Методологични насоки 1.3.1794-03, Методологични насоки 1.3.1888-04), трябва да бъде напълно изолирано от помещенията, посочени в предходните параграфи. Движението на персонал, оборудване, материали и предмети от зоната за електрофореза до зоната за обработка на пробите и „чистата“ зона, както и преносът на въздух през вентилационната система или в резултат на течение, трябва да бъдат изключени. Тази зона не е необходима за флуориметрично откриване на PCR продукти.
• Стаята за документиране и обработка на резултатите е оборудвана с компютри и необходимото офис оборудване. Тази стая може да съдържа оборудване, което осигурява откриване на PCR продукти без отваряне на епруветката. - флуоресцентни PCR детектори и термоциклери за PCR в реално време.

Санитарно-епидемиологичните изисквания за първична обработка на храчки са подобни на стандартните микробиологични изисквания за работа с Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Пълен комплект лабораторно оборудване за PCR диагностика

Лабораторният комплект включва оборудване за следните помещения.

• стая за подготовка на проби, съдържа следното оборудване: ламинарен капак с клас на защита II "SP-1.2"; твърдотелен термостат с отопляем капак за епруветки Eppendorf; микроцентрофуга при 13 000 об/мин; центрофуга ("Vortex"); хладилник с температурен диапазон от -20 ^° C до +10 ^° C; пипети с променлив обем от серията "Proline"; помпа с колба-уловител OM-1; стойка за пипети; стойка за работна станция 200x0.5 ml; стойка за работна станция 50x1.5 ml; стойки за съхранение на епруветки 80x1.5 ml;
• стая за приготвяне на реакционната смес: защитна камера PCR кутия („Laminar-C. 110 cm); центрофуга „Vortex“; пипети с променлив обем от серията „Proline“; стойка за пипети; стойка за работно място 200x0.2 ml; стойки за съхранение на епруветки 80x1.5 ml; хладилник с температурен диапазон от -20 ^° C до +10 ^° C;
• Стая за електрофореза: хоризонтална камера за електрофореза; източник на захранване; трансилюминатор;
• ДНК усилвател или анализатор на нуклеинови киселини (PCR в реално време) с компютър и софтуер; може да се постави във всяка свободна стая. Ако се използва технология за PCR в реално време, не е необходима стая за електрофореза.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Външен контрол на качеството

За да гарантират получаването на обективно надеждни резултати, лабораториите трябва да участват в система за външна оценка на качеството на лабораторните изследвания.

Участниците в системата за контрол на качеството получават: 12 ампули с лиофилизирани суспензии от бактериални клетки, две от които съдържат E. coli, 3 ампули с туберкулозни микобактерии (авирулентен щам) с концентрация 10² ^/ ml; 3 ампули с клетки от подобен щам с концентрация 10² ^/ ml; по 2 ампули с нетуберкулозни микобактерии M. avium-intracellulare и M. kansasii с концентрация 10³ ^/ ml.

Тестовете, изпратени за външна оценка на качеството, са предварително тествани в две независими лаборатории с богат опит в тази област.

[ 85 ], [ 86 ]