Диагностика на херпес

Диагнозата на херпеса се основава на класическо изолиране на вируса върху чувствителни клетъчни култури, имунофлуоресцентни и серологични методи, колпоскопско изследване и използването на съвременни молекулярно-биологични методи (PCR, точкова хибридизация), което позволява диагностицирането на цялата група херпесни вируси, включително HHV-6 и HHV-7 типове.

Лабораторни диагностични методи за херпесна инфекция

Основните методи, насочени към изолиране на HSV или откриване на вирусни частици и/или техни компоненти	Спомагателни методи, насочени към откриване на антитела срещу HSV в биологични течности на човешкото тяло
Изолиране на HSV в чувствителни клетъчни и животински култури Директна и имунна електронна микроскопия Директни и индиректни варианти на IPA ИФА Молекулярно-биологични методи Реакция на латексова аглутинация	Реакция на неутрализация Кралска шофьорска книжка Определяне на антитела към неструктурни протеини на HSV-1,2

Беше показано, че при 76% от пациентите гениталният херпес (ГХ) е причинен от HSV-2, а при 24% - от HSV-1 тип. Освен това, ГХ като моноинфекция се е появил само при 22% от пациентите, като в 78% от случаите са открити микробни асоциации. При 46% от индивидите е открита паразитоценоза, причинена от два патогена, включително хламидия е открита в 40% от случаите. Гарднерела, трихомонада и гонококи са по-рядко откривани в натривки.

При 27% от пациентите паразитоценозата е била представена от три патогена, при 5,2% - от четири патогена. Освен това най-често е била наблюдавана комбинация от хламидия с гарднерела и гъбички Candida. Тези данни обосновават необходимостта от задълбочено бактериологично изследване на пациенти с генитален херпес, за да се идентифицират комбинации от патогенни агенти, както и задълбочено проучване на патогенезата на смесените инфекции на урогениталния тракт, което ще позволи диференцирана комплексна терапия на херпесната инфекция.

Материали, изследвани за изолиране на HSV в зависимост от локализацията на херпесните лезии

Локализация на лезиите	Съдържание на везикулите	Изстъргване на клетки				Цереброспинална течност (CSF)	Бронхиален аспират	Биопсия	Кръв
		1	2	3	4
Кожа	+								+
Очи			+						+
Гениталии				+					+
Анус	+				+				+
Уста	+	+							+
ЦНС	+					+		+	+
Бели дробове		+					+		+
Черен дроб								+	+
Вроден херпес	+	+	+				+		+

Методи за лабораторна диагностика на цитомегаловирусна инфекция

Методи	Време, необходимо за получаване на резултати	Бележки
ВИРУСОЛОГИЧЕН
Електронна микроскопия	3 часа	Не е много достъпно
Изолиране на вируса в клетъчна култура (VCI)	4-20 дни	Стандартен, Бавен
Имунофлуоресцентно оцветяване на ранен AG с помощта на моноклонални антитела	6 часа	По-малко специфични
ЦИТОЛОГИЧЕН	2-3 часа	По-малко специфични
СЕРОЛОГИЧЕН
Кралска шофьорска книжка	2 дни	Стандартен
РГА	1 ден	Трудоемко
РИФ	6 часа	Просто, специфично
НРИФ	6 часа	Трудно
РИМП	6 часа	Трудно
ELISA (IgM, DO)	6 часа	Бързо, просто
Имуноблот	6 часа	Скъпо
МОЛЕКУЛАРНО БИОЛОГИЧНО
МГ	5-7 дни	Скъпо, трудоемко
PCR	3 часа	Скъпо

Методи за диагностика на вируса на херпес зостер

Диагностични методи	Лабораторни техники
НЕПРЯКО
Избор	Тъканна култура, пилешки ембриони, лабораторни животни, съвместна култура с пермисивни клетки или помощни вируси
Идентифициране на изолатите	Реакция на неутрализация, RSC, IF, PIEF, реакция на преципитация на изолати, аглутинация, IF
ДИРЕКТНО
Цитология	Намазки: цветна имунофлуоресценция
Хистология	Патоморфология на клетката
Структура	Ембрионална микроскопия, имуноелектронна микроскопия
Определяне на антигени	АКО, ПИЕФ, РИМ, ИФА
Определяне на локалното производство на антитела	Ig M, Ig G, Ig A: ELISA, RIA
Молекулярно-биологични подходи	Молекулярна хибридизация, PCR

Лабораторна диагностика на инфекция, причинена от вируса на херпес зостер

Диагностични проблеми	Методи	Очаквани резултати
Остра първична инфекция	1	Откриване за 2 часа
	2	Нивата на антителата се повишават бавно
	3	Проявява се 3 дни след инфекцията
Остра реактивирана инфекция	1	Откриване на UUU след 2 часа
	2	Нивата на антителата се повишават бавно
	4	Появява се 4 дни след появата на обрива

1. определяне на везикули на VEGF в течност;
2. серология: CSC, ELISA, насочена към откриване
3. серология: ELISA, насочена към откриване на IgM;
4. серология: ELISA, насочена към откриване на IgA, IgM.

Методи за индикация на имунния отговор към инфекция с вируса на херпес зостер

Подход	Метод
Откриване на повишен титър на антитела във вторите серуми	RSK, RTGA, RPGA, IF неутрализационна реакция, RIM, ELISA
Откриване на специфични за клас Ig G, Ig A антитела в първата серумна проба	ELISA, IF, RIM, латексова аглутинация

Интерпретация на резултатите от серологично изследване на серуми на пациенти за херпесни вирусни инфекции (ELISA)

Име на инфекцията/маркера	Средни прагови стойности за инфекции
	Резултати от анализа	Тълкуване
Цитомегалия Анти-CMV IgG (1-20 U/ml) Анти-CMV IgM (100-300%)	Положителен 1-6 Положителен 6-10 Положителен >10 Отрицателен Положителен 100-300 Отрицателен <90 Съмнителен 90-100	Ремисия Обостряне на заболяването Остра фаза на заболяването Няма инфекция (заболяване) Остра фаза на заболяването Повторете анализа след 2-3 седмици
Херпес симплекс 1,2 серотипа Анти-HSV 1/2 общо (100-900%)	Положителни 100-400 Положителни 400-800 Положителни >800 Отрицателни <100	Ремисия Обостряне на заболяването Остра фаза на заболяването Няма инфекция (заболяване)

Таблицата представя основните методи за лабораторна диагностика на херпесвирусни инфекции, както и препоръчителни биологични материали, които се изследват при изолиране на HSV, като се взема предвид локализацията на херпесните лезии.

Надеждно изолиране на вируси на херпес симплекс и CMV чрез инфектиране на чувствителни клетъчни култури. Така, по време на вирусологично изследване на 26 пациенти по време на периода на рецидив, HSV е изолиран върху чувствителна Vero клетъчна култура в 23 случая (88,4%). Инфектираните култури показват картина на цитопатично действие, типична за HSV - образуване на многоядрени гигантски клетки или натрупване на заоблени и уголемени клетки под формата на клъстери. В 52,1% от случаите огнища на цитопатично действие на вируса могат да бъдат открити още 16-24 часа след инфектирането. Чрез 48-72 часа инкубация на инфектираните култури процентът на веществата, причиняващи специфично разрушаване на клетките, се увеличава до 87%. И само в 13% от случаите положителни резултати са открити 96 часа след инфектирането или повече или при многократно пасиране.

Методи за лабораторна диагностика на генерализирана херпесна инфекция

Основните методи, насочени към откриване (изолиране) на херпесни вируси, техните частици и техните компоненти

Спомагателни методи, насочени към откриване на антитела срещу херпесни вируси в биологични течности, откриване на ензимни промени в кръвния серум

Изолиране на херпесни вируси върху чувствителни клетъчни и животински култури. Директна и имунна електронна микроскопия. Директни и индиректни варианти на имунопероксидазния метод. Директни и индиректни варианти на метода с флуоресцентни антитела. Варианти на твърдофазен ензимен имуноанализ. Варианти на метода на молекулярна (ДНК-ДНК) хибридизация. Полимеразна верижна реакция. Реакция на латексна аглутинация.

Тест за неутрализация Тест за фиксация на комплемента Тест за латекс-аглутинация Косвена версия на метода с флуоресцентни антитела Косвена версия на метода с имунопероксидаза Варианти на твърдофазен ензимен имуноанализ Метод на имуноблотинг Метод на радиална фиксация на комплемента Определяне на нивата на аланин и аспартат аминотрансфераза

Серологичните методи се използват за диагностициране на инфекциозна мононуклеоза (инфекция, причинена от EBV). Реакцията на Paul-Bunnell с овчи еритроцити, диагностичен титър 1:28 или по-висок при еднократно изследване на кръвен серум или 4-кратно увеличение на антителата при изследване на сдвоени серуми. Използва се реакцията на Hoff-Bauer с 4% суспензия от формалинизирани конски еритроцити. Резултатът се взема предвид след 2 минути; при инфекциозна мононуклеоза реакцията е силно специфична.

В момента се разработва метод за ензимен имуноанализ (EIA) за диагностициране на инфекциозна мононуклеоза. В този случай IgG и IgM антителата в серума на пациента се определят чрез инкубирането му с лимфобласти, инфектирани с EBV, последвано от лечение с флуоресцентни антитела. В острия период на заболяването се определят антитела към вирусния капсиден антиген в титър 1:160 и по-висок.

При използване на редица вносни търговски тестови системи, ELISA може да открие: антитела към антитела от обвивката на EBV, антитела към ранния антиген на EBV, общи антитела към ранния антиген на EBV, определени в острата фаза на заболяването както в ядрото, така и в клетъчната цитоплазма, и ограничени антитела към ранния EBV, определени в острата фаза на заболяването както в ядрото, така и в клетъчната цитоплазма, ограничени антитела към ранния EBV антиген, определени в разгара на заболяването само в клетъчната цитоплазма, и антитела към ядрения антиген на EBV. Използването на тези тестови системи позволява диференциална диагностика на редица заболявания, свързани с EBV.

След положителен ELISA тест, който разкрива антитела срещу EBV, се провежда потвърдителна имуноблотинг реакция, която определя наличието на антитела към отделни EBV маркерни протеини (p-протеини): p23, p54, p72 (наличието на този протеин показва възможността за репродукция на EBV), p 138. Горните лабораторни методи се използват и за наблюдение на ефективността на лечението.

Чувствителността на вирусологичните методи е 85-100%, специфичността е 100%, времето за изследване е 2-5 дни. В практическата работа често се използва методът на директна имунофлуоресценция (DIF) с поликлонални или моноклонални антитела срещу HSV-1 и HSV-2. DIF методът е сравнително лесно възпроизводим в обикновена клинична лаборатория, не е скъп, чувствителността е над 80%, специфичността е 90-95%. Имунофлуоресцентната микроскопия разкрива наличието на цитоплазмени включвания, морфологични характеристики, процента на инфектираните клетки в натривки-остъргания от уретрата, цервикалния канал, шийката на матката, ректума.

PIF методът дава представа за морфологичните свойства на клетките и промените в локализацията на HSV антигените. В допълнение към преките признаци на клетъчно увреждане от херпесни вируси (откриване на специфична луминесценция), според PIF данните, съществуват и косвени признаци на херпесна инфекция:

• агрегация на ядрената материя, откъсване на кариолемата;
• наличието на така наречените „дупкови“ ядра, когато от клетъчното ядро остава само една кариолема;
• наличието на вътреядрени включвания - телца на Каудри.

При извършване на PIF, лекарят получава не само качествена, но и количествена оценка на състоянието на инфектираните клетки, която използвахме за оценка на ефективността на антивирусната терапия с ацикловир (AC). Така, 80 пациенти с прост генитален херпес (GH) бяха изследвани с помощта на PIF метода в динамика. Беше показано, че ако преди лечение с ацикловир, 88% от пациентите са имали висок процент инфектирани клетки (50-75% и повече) в натривките, то след един курс на ацикловир, здрави клетки са открити в натривките на 44% от пациентите, в 31% от случаите са отбелязани единични инфектирани клетки, а при 25% от пациентите е имало до 10% инфектирани клетки.

Съдържание на инфектирани клетки в натривки (PIF реакция) на пациенти с генитален херпес, лекувани с ацикловир

Периоди на заболяване	Процентно съдържание в намазки
	Заразени клетки					Нормални клетки
	Повече от 75%	50-75%	40-50%	10%	Единични клетки в зрителното поле
Рецидив (преди лечение)	25%	63%	12%
	(20)	(50)	(10)
Ремисия (след лечение)				25%	31%	44%
				(20)	(25)	(35)

Използвайки PIF и метода на точкова хибридизация в продължение на много години, е отбелязано, че резултатите от изследването съвпадат в почти 100% от случаите. Трябва да се отбележи, че за да се повиши надеждността на диагнозата херпес, особено в случаите на субклинични и слабо проявени форми на херпес, се препоръчва използването на 2-3 метода за лабораторна диагностика в работата, особено при изследване на бременни жени, жени с неблагоприятна акушерска анамнеза и лица с неуточнена гинекологична диагноза.

По този начин, при PCR диагностиката на вирусни и бактериални инфекции на урогениталния тракт е необходимо да се оценят получените положителни резултати, като се вземе предвид анамнезата, наличието (или отсъствието) на специфични клинични симптоми на заболяването. Ако хламидията се открие с помощта на PCR, тогава в този случай има висока вероятност за инфекция и въпросите за терапията могат да бъдат решени съответно. В случай на откриване на микоплазми (уреаплазми), които са опортюнистични микроорганизми, са необходими допълнителни културни изследвания за потвърждаване на диагнозата, т.е. посяване на материал от пациента върху чувствителни клетъчни култури. Само ако се получат положителни резултати при културния анализ, можем да говорим за лабораторно потвърждение на диагнозата микоплазмоза. Същият метод ще позволи, ако е необходимо, да се определи чувствителността на изолираните микоплазми към често използвани лекарствени форми (антибиотици, флуорохинолони и др.).

Възможна е едновременна инфекция с няколко вируса от семейство Herpesviridae. Често откривахме инфекция на един пациент с HSV-1, HSV-2 и CMV вируси. Пациенти с клинични и лабораторни прояви на вторични IDS (онкохематологични, онкологични, HIV-инфектирани пациенти) бяха значително по-често инфектирани с няколко херпесни вируса. По този начин е доказано, че клиничните и имунологичните нарушения, прогресиращи при HIV инфекция, са съпроводени с увеличаване на броя на херпесните вируси, открити чрез метода на молекулярната хибридизация. В този случай, най-прогностично значимо може да се счита за комплексното едновременно откриване на ДНК от тип HSV-1, CMV и HHV-6.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]