Фагоцитоза: Лабораторна оценка на функцията на имунните клетки

Фагоцитозата не е единична реакция, а сложна верига от събития във вродения имунитет. Тя включва разпознаване на микроби, прикрепване, излизане на клетките от съда във възпалителното място, поглъщане, образуване на фагозома, сливане с гранули и последващо вътреклетъчно разрушение, включващо реактивни кислородни видове и ензими. Следователно, тестването за фагоцитоза не може да се сведе до един-единствен, универсален тест: дефект може да възникне на всеки от тези етапи. [1]

В клиничната имунология „тестване за фагоцитоза“ най-често се отнася до оценката на функцията на неутрофилите и по-рядко на функцията на моноцитите. На практика лекарите търсят отговор не на абстрактния въпрос „функционира ли имунната система правилно?“, а на много по-специфичен: дали има вроден дефект в клетките, които би трябвало да поглъщат и унищожават бактерии и гъбички, да мигрират към мястото на възпалението и да генерират адекватен вроден отговор. [2]

Фагоцитните дефекти представляват приблизително 10%-15% от първичните имунодефицити. Най-известните включват хронична грануломатозна болест, дефицит на левкоцитна адхезия, синдром на Чедиак-Хигаши и циклична неутропения. Не само редките вродени нарушения обаче са клинично важни: вторична неутрофилна дисфункция се среща и при тежък сепсис, недохранване, експозиция на определени лекарства и тежки хронични възпалителни състояния. [3]

Ето защо съвременната диагностика протича на етапи. Първо се оценява клиничната картина, пълната кръвна картина, кръвната натривка и наличието на типични инфекции. След това се преминава към по-специфични тестове: оценка на респираторния взрив, експресия на адхезионни молекули, понякога тестове за директна абсорбция и бактерицидни тестове и накрая, молекулярно потвърждение. [4]

Ключовият практически извод, който произтича от това, е, че тестването за фагоцитоза е панелен подход, а не единичен „имунен анализ“. Колкото по-точно лекарят разбира кой етап от вродения имунен отговор е нарушен – миграция, оксидативен взрив, гранулиран апарат или самото поглъщане – толкова по-кратък е пътят до диагнозата и по-малък е рискът от погрешно тълкуване. [5]

Стадий на фагоцитен отговор	Какво може да бъде нарушено	Кой тест е най-важен?
Адхезия към ендотела и излизане от съда	Дефицит на интегрини и селектинови лиганди	Флоуцитометрия CD11a, CD11b, CD18, CD15s
Окислителна експлозия	Дефект на никотинамид аденин динуклеотид фосфат оксидазен комплекс	Тест с дихидрородамин 123
Гранулиран апарат и вътреклетъчна обработка	Първични гранулирани дефекти	Намазка, специализирани имунологични и генетични тестове
Абсорбция и бактерицидна активност	Функционална неутрофилна дисфункция	Тестове за фагоцитоза и унищожаване на кръв от цяла кръв в специализирани центрове

Източници за таблицата: MSD Manual, ARUP, GeneReviews, текущи прегледи за хронична грануломатозна болест. [6]

Кога е наистина необходимо изследването на фагоцитозата?

Най-типичната индикация са повтарящи се тежки бактериални и гъбични инфекции, особено дълбоки абсцеси, лимфаденит, остеомиелит, чернодробни, белодробни и кожни инфекции. Фагоцитните дефекти се характеризират особено с повтарящи се стафилококови, грам-отрицателни и аспергилозни инфекции, както и с възпалителни грануломи и лошо заздравяване на тъканите.[7]

Възрастта и видът на проявлението са много важни. Ако детето редовно претърпява тежки гнойни инфекции в ранна детска възраст и патогените са повтарящи се или необичайни, вероятността от вроден фагоцитен дефект се увеличава. Особено тревожни са инфекциите, които изискват интравенозни антибиотици, слабо реагират на стандартно лечение и рецидивират в множество органи. [8]

Отделна класическа ситуация е съмнението за дефицит на адхезия на левкоцитите. Тя се характеризира със забавяне на отделянето на гръбначния стълб с повече от 3 седмици, тежки некротични инфекции на меките тъкани, липса на гной по време на инфекции, изразена левкоцитоза и тежък пародонтит. В такива случаи изследването на „фагоцитозата“ в тесен смисъл не трябва да се ограничава до функционални тестове: приоритет се дава на флоуцитометрията на адхезионните рецептори. [9]

Трябва да се имат предвид и вторичните състояния. При тежък сепсис, недохранване, някои възпалителни заболявания и при деца с тежко забавяне на растежа, функцията на неутрофилите може да бъде намалена или нарушена без вроден дефект. Това не прави теста безполезен, но променя интерпретацията: анормален резултат в този случай не винаги се равнява на първичен имунодефицит. [10]

Накрая, фагоцитното изследване е показано не само за пациента, но и за членовете на семейството. При хронично грануломатозно заболяване и дефицит на левкоцитна адхезия, генетичното консултиране на роднини има клиничен смисъл, а при Х-свързано хронично грануломатозно заболяване, тест с дихидрородамин 123 може да разкрие мозаичен модел при женски носители. [11]

Клинична ситуация	Колко релевантно е проучването?
Рецидивиращи дълбоки бактериални или гъбични инфекции	Много подходящо
Абсцеси на черния дроб, белите дробове, кожата, лимфните възли	Много подходящо
Забавено отделяне на пъпната връв и инфекция без гной	Особено важно за изключване на дефицит на адхезия на левкоцитите
Необяснима тежка левкоцитоза при кърмаче	Изисква оценка на дефектите на адхезията и миграцията
Тежък сепсис и вторична имунна дисфункция	Функционалната оценка е възможна, но интерпретацията е по-трудна
Фамилна анамнеза за хронична грануломатозна болест	Необходими са функционални и генетични методи

Източници за таблицата: MSD Manual, GeneReviews, Immune Deficiency Foundation, 2024 Chronic Granulomatous Disease Review. [12]

Какви методи се използват днес?

Основният съвременен метод за оценка на респираторния взрив е тестът с дихидрородамин 123. Той се основава на флоуцитометрия и измерва способността на неутрофилите да окисляват дихидрородамин 123 до флуоресцентен продукт след стимулация, обикновено с форбол 12-миристат 13-ацетат. По същество той е функционален заместител на активността на никотинамид аденин динуклеотид фосфат оксидазния комплекс и основният скринингов тест за хронично грануломатозно заболяване. [13]

Анализът с нитросиньо тетразолиев анализ исторически е бил стандартът, но сега е заменен от анализа с дихидрородамин 123 по отношение на чувствителност, количествено определяне и възпроизводимост. Той обаче не е изчезнал напълно: в условия с ограничени ресурси, той все още може да се използва като работещ диагностичен инструмент, въпреки че в лаборатории с флоуцитометрия се счита за резервен и по-малко удобен вариант. [14]

Ако се подозира дефицит на адхезия на левкоцитите, фенотипизирането на повърхността на неутрофилите с помощта на флоуцитометрия се превръща в ключов метод вместо теста за респираторен взрив. За тип 1, CD18 и свързаните с него CD11a и CD11b се оценяват предимно, докато за тип 2, CD15s се оценява допълнително. Намаляването или отсъствието на тези молекули корелира добре с нарушена миграция и адхезия на неутрофилите. [15]

Съществуват също така директни анализи на фагоцитоза от цяла кръв и вътреклетъчно убиване. Те обикновено използват маркирани бактерии или частици и позволяват количествена оценка на това колко мишени са били погълнати от неутрофилите и колко ефективно те впоследствие убиват микроорганизма. Такива методи обаче не са станали толкова универсални, колкото анализа с дихидрородамин 123, и се използват по-често в изследователски или високоспециализирани центрове. [16]

След функционално изследване, молекулярното потвърждение е все по-необходимо. При хронично грануломатозно заболяване с рецидивираща респираторна дисфункция се препоръчва да се анализират поне CYBA, CYBB, NCF1, NCF2, NCF4, CYBC1 и RAC2. При дефицит на левкоцитна адхезия, генетиката е особено важна за семейно консултиране и окончателно потвърждаване на подтипа на дефекта. [17]

Метод	Какво оценява?	Където е особено полезно
Тест с дихидрородамин 123	Неутрофилен респираторен взрив	Скрининг за хронична грануломатозна болест, носителство и мониторинг след трансплантация
Тест с нитросин тетразолий	Оксидативен отговор на неутрофилите	Метод за архивиране и исторически данни, понякога полезен, когато ресурсите са ограничени.
Флоуцитометрия CD18, CD11a, CD11b, CD15s	Адхезия и миграция на неутрофилите	Диагностика на дефицит на левкоцитна адхезия
Тестове за директна фагоцитоза	Абсорбция на частици или бактерии	Спомагателни и специализирани ситуации
Вътреклетъчни тестове за убиване	Способността да унищожава погълнатите микроби	Специализирани центрове и сложни случаи
Генетично тестване	Причинно-следствен молекулярен дефект	Потвърждаване на диагнозата и семейно консултиране

Източници за таблицата: GeneReviews, ARUP, MSD Manual, Immune Deficiency Foundation, преглед от 2024 г. [18]

Защо тестовете могат да бъдат неверни или трудни за интерпретиране

Предварителният анализ е от решаващо значение за анализа с дихидрородамин 123. ARUP уточнява, че живите неутрофили, хепаринизираната цяла кръв и пробата не трябва да се съхраняват в хладилник или замразяват, а много протоколи изискват едновременна контролна кръвна проба. Ако времето за транспортиране и доставка е нарушено, резултатите стават трудни за интерпретиране или дори ненадеждни. [19]

Дори при висококачествена проба съществуват биологични капани. Докладите на ARUP описват междинен модел между нормална и анормална флуоресценция, която може да възникне по време на остро възпаление. В такива ситуации самата лаборатория препоръчва повторение на теста след отшумяване на възпалителния процес, вместо да се прави окончателно заключение въз основа на един единствен анализ. [20]

Отделен проблем е миелопероксидазният дефицит. Той може да доведе до картина, подобна на хроничното грануломатозно заболяване, особено ако се разчита единствено на теста с дихидрородамин 123. Съвременните изследвания подчертават, че тези състояния трябва да се разграничават: при хроничното грануломатозно заболяване дихателният взрив е нарушен във всички фагоцити, докато при миелопероксидазен дефицит картината вече е биологично различна. [21]

Съществуват и интерференции, свързани с лекарства. Преглед от 2024 г. отбелязва, че са възможни фалшиво положителни резултати от тестове за дихателна функция при пациенти, приемащи парацетамол, метамизол или месалазин. Това е рядък, но важен детайл: ако се подозира първичен имунодефицит, без да се вземе предвид анамнезата за лекарства, може да се поеме по фалшив диагностичен път. [22]

Накрая, самият клиничен контекст влияе върху интерпретацията. Тежката неутропения може да направи функционалните тестове ненадеждни, сепсисът може парадоксално да промени различните неутрофилни функции в различни посоки, а вторичните имунодефицити често водят до смесена картина. Следователно, изследването за фагоцитоза винаги е контекстуален анализ, а не лабораторен „диагностичен печат“.

Причина за изкривяване	Как се проявява?	Какво да направите
Неправилно транспортиране или охлаждане на пробата	Фалшиво намалена неутрофилна функция	Повторете проучването с подходяща логистика
Остро възпаление	Междинен модел на теста с дихидрородамин 123	Повторете анализа след отшумяване на възпалението.
Дефицит на миелопероксидаза	Симулация на дефект на дихателния взрив	Допълнително изследване за миелопероксидаза
Парацетамол, метамизол, месалазин	Възможни фалшиво положителни функционални резултати	Вземете предвид историята на употребата на наркотици
Тежка неутропения	Технически ненадежден тест	Първо, изчислете абсолютния брой неутрофили
Няма контролна проба	Трудна интерпретация на анормален резултат	Сравнете с контролна кръв от същия ден

Източници за таблицата: ARUP, преглед на диагностиката на хронични грануломатозни заболявания от 2024 г. [24]

Какви заболявания се търсят най-често с помощта на тези тестове?

Най-честата диагноза е хронична грануломатозна болест. Това е вроден дефект на никотинамид аденин динуклеотид фосфат оксидазния комплекс, при който фагоцитите не са в състояние да генерират реактивни кислородни видове. Клинично заболяването причинява повтарящи се тежки бактериални и гъбични инфекции, особено на кожата, белите дробове, черния дроб, лимфните възли и костите, както и грануломатозно възпаление. [25]

Вторият най-важен дефект е дефицитът на адхезия на левкоцитите. Тук проблемът не е респираторният взрив, а по-скоро неспособността на неутрофилите да се прилепят правилно към ендотела, да излязат от съда и да влязат в тъканите. Клиничните признаци са класически: забавено отделяне на гръбначния стълб, изразена левкоцитоза, инфекции на меките тъкани без образуване на гной, лошо заздравяване на рани и тежък пародонтит. [26]

Синдромът на Чедиак-Хигаси е по-рядък, но от фундаментално значение вариант. Характеризира се с аномалии на гранулирания апарат на фагоцитите, рецидивиращи инфекции, окулокутанен албинизъм, хепатоспленомегалия, лимфаденопатия, неврологични прояви и склонност към кървене. Стандартен „тест за фагоцитоза“ рядко е достатъчен в този случай, а кръвна натривка, морфология на гранулите и генетика играят важна роля. [27]

Важно е да се помни, че не всеки анормален резултат показва вродена имунна недостатъчност. Вторична неутрофилна дисфункция може да възникне при тежки инфекции, недохранване, прием на някои лекарства и хронично възпаление. Следователно, анормална DHR, намалена бактерицидна активност или атипично неутрофилно поведение без характерните клинични характеристики на първичния дефект трябва да накарат да се обмислят вторични причини. [28]

На практика, изследването на фагоцитозата е особено ценно, защото помага за стесняване на диференциалната диагноза. То разграничава дефекти на оксидативния взрив от миграционни дефекти и истински вродени синдроми от вторична имунна дисфункция. Въпреки това, окончателната диагноза почти винаги изисква комбинация от клиничен преглед, функционално изследване, фенотипизиране и генетично потвърждение. [29]

Болест	Какво е счупено?	Най-характерният лабораторен акцент
Хронична грануломатозна болест	Дихателен взрив	Патологично изследване с дихидрородамин 123
Дефицит на адхезия на левкоцитите тип 1	CD18 и свързани интегрини	Намалени CD11 и CD18 върху неутрофилите
Дефицит на адхезия на левкоцитите тип 2	Фукозилиране и CD15s	Намалени или липсващи CD15
Синдром на Чедиак-Хигаши	Гранули и лизозомен трафик	Морфологични и генетични характеристики, а не един универсален функционален тест
Дефицит на миелопероксидаза	Псевдодефект в някои функционални тестове	Необходима е диференциация с хронична грануломатозна болест.
Вторична неутрофилна дисфункция	Функцията е нарушена за втори път	Резултатът се чете само в клиничен контекст.

Източници за таблицата: MSD Manual, GeneReviews, ARUP, преглед от 2024 г. [30]

Какво да правите след необичаен резултат

Ако за първи път се получи анормален резултат, първата стъпка е да се провери надеждността на самия тест. Важно е да се определи дали пробата е доставена навреме, дали е имало остро възпаление, дали е имало достатъчно неутрофили, дали е имало контролна проба и дали пациентът е приемал лекарства, които биха могли да повлияят на резултата. Без това е лесно да се започнат скъпи и обезпокоителни последващи изследвания по грешен път. [31]

Ако анормалният резултат се отнася до респираторен взрив и се потвърждава многократно, следващата стъпка е молекулярна проверка на хронично грануломатозно заболяване и свързани с него дефекти. Настоящ преглед препоръчва тестване на поне седем гена, свързани с никотинамид аденин динуклеотид фосфат оксидазния комплекс, за повтарящи се аномалии. Това вече не е просто диагностична стъпка, а решение за дългосрочно лечение на пациента и семейството. [32]

Ако проблемът се крие в зоната на адхезия и миграция, анормален резултат от панела за CD11, CD18 или CD15s изисква потвърждение и бързо преназначаване. При тежък дефицит на левкоцитна адхезия, основната терапия остава профилактичното лечение с антибиотици, понякога трансфузии на гранулоцити, а трансплантацията на хемопоетични стволови клетки се счита за единствения наистина ефективен и потенциално лечебен метод. При тип 2 може да се обмисли корекция с фукоза. [33]

При хронична грануломатозна болест, след като диагнозата бъде потвърдена, лечението далеч надхвърля лабораторните изследвания. Настоящите прегледи препоръчват антибактериална и противогъбична профилактика, намалено излагане на плесени и редовно специализирано наблюдение. Трансплантацията на хемопоетични стволови клетки вече се счита за потенциално лечебна опция, а не само за „последна мярка“ за изключително тежки случаи. [34]

Ако резултатът е граничен или несъвместим с клиничната картина, е по-разумно да не се бърза с редки диагнози, а вместо това да се преоцени целият имунологичен контекст. Понякога, след нормален тест с дихидрородамин 123 и адхезионен панел, е необходимо да се върнем към по-основни тестове: абсолютен брой неутрофили, кръвна натривка, имуноглобулини, антителни отговори към ваксини, комплементна система и вторични причини за имунодефицит. Този подход често е най-ефективният начин да се избегне пропускането на истинската причина за инфекциите. [35]

Ситуация след резултата	Следващата интелигентна стъпка
Граничен тест с дихидрородамин 123 при наличие на остро възпаление	Повторете изследването извън острата фаза
Повторете патологичния тест с дихидрородамин 123	Генетично потвърждение на дефект в никотинамид аденин динуклеотид фосфат оксидазен комплекс
Намалени CD18, CD11 и/или CD15	Потвърдете дефицита на адхезия на левкоцитите и обсъдете специализирано лечение
Нормален тест за дихидрородамин 123 при тежки инфекции	Потърсете други дефекти на неутрофили, комплемент, антитела и вторични причини
Потвърдена хронична грануломатозна болест	Превенция на инфекции, генетично консултиране, обсъждане на трансплантации
Потвърден дефицит на адхезия на левкоцитите	Превенция, оценка на тежестта, маршрутизиране на трансплантацията

Източници за таблицата: Наръчник на MSD, редакция от 2024 г., ARUP, Фондация за имунен дефицит. [36]

ЧЗВ

1. Фагоцитозният тест и тестът с дихидрородамин 123 едно и също нещо ли са?
Не. Тестът с дихидрородамин 123 оценява само една част от фагоцитния отговор – неутрофилния респираторен взрив. Фагоцитозният тест, като по-широко понятие, включва също адхезия, миграция, поглъщане, вътреклетъчно убиване и понякога генетично потвърждение на дефекта. [37]

2. Кой тест понастоящем се счита за основен скринингов метод за хронична грануломатозна болест?
Тестът с дихидрородамин 123 флоуцитометрия се счита за основен скринингов метод. Той е по-чувствителен и количествено информативен от историческия нитросин тетразолиев тест. [38]

3. Напълно остарял ли е нитросинят тетразолиев тест?
Не съвсем. В лаборатории с налична флоуцитометрия той е по-лош от съвременния дихидрородамин 123 тест, но в условия с ограничени ресурси все още може да се използва като работещ диагностичен инструмент. [39]

4. Защо стандартният „тест за фагоцитоза“ е недостатъчен, когато се подозира дефицит на адхезия на левкоцитите?
Защото проблемът с това заболяване е предимно нарушаването на адхезията и освобождаването на неутрофили от съда, а не самият оксидативен взрив. Следователно, CD11, CD18 и, ако е необходимо, CD15s панелите стават ключови. [40]

5. Може ли острото възпаление да повлияе на резултатите?
Да. Съобщени са междинни и трудни за интерпретация модели за теста с дихидрородамин 123 при наличие на остро възпаление, така че лабораториите често препоръчват повторение на теста след отшумяване на възпалението. [41]

6. Кои лекарства могат да повлияят на тестовете за дихателна функция тип „burst“?
Неотдавнашен преглед идентифицира парацетамол, метамизол и месалазин като лекарства, които могат да доведат до фалшиво положителни резултати при тестовете за дихателна функция тип „burst“. [42]

7. Какво представлява миелопероксидазният дефицит и защо е важно да се помни?
Това състояние може да имитира хронично грануломатозно заболяване по отношение на функционалните тестове. Следователно, ако резултатът от теста за дихидрородамин 123 е анормален, винаги е важно да се прави разлика между тези две състояния. [43]

8. Може ли да се постави диагноза само въз основа на един анормален резултат?
Обикновено не. Съвременният подход изисква поне повторен тест, ако резултатите са съмнителни, клинични съображения, а понякога и фенотипизиране на повърхността на неутрофилите и генетично потвърждение. [44]

9. Какво да правим, ако детето е често болно, но тестът за дихидрородамин 123 е нормален?
Необходимо е по-широко проучване. Ако респираторният взрив е нормален, струва си да се оценят адхезионните молекули, броят на неутрофилите, кръвната натривка, имуноглобулините, антителните отговори към ваксини, комплементната система и вторичните причини за имунодефицит. [45]

10. Кои заболявания се потвърждават най-често след подобно изследване?
Най-често се търсят хронична грануломатозна болест и дефицит на левкоцитна адхезия. По-рядко се откриват синдром на Чедиак-Хигаши, миелопероксидазен дефицит и други редки неутрофилни дефекти. [46]