Един флакон, две цели: Преносима CRISPR-базирана диагностика на туберкулоза със 100% чувствителност

В Science Advances беше публикувана статия за преносим тест за туберкулоза, който може да се направи директно от храчки, без сложно оборудване. Изотермична ДНК амплификация и CRISPR отчитане се комбинират в една епруветка; две консервативни инсерции на M. tuberculosis (IS6110 и IS1081) се тестват едновременно, плюс човешки ген като вътрешен контрол на пробата. В малък „сляп“ тест върху клинични проби, тестът дава 100% чувствителност (6/6) и 100% специфичност (7/7) в сравнение с културата; границата на откриване е ~69–81 CFU/ml в симулирана храчка. Резултатът може да се види на хартиена тест лента, а реактивите са лиофилизирани (съхранение без „студена верига“).

Предистория

Според СЗО, туберкулозата ще убие около 1,25 милиона души през 2023 г.; туберкулозата отново се превърна във водеща инфекциозна причина за смърт, с приблизително 10,8 милиона случая. Това прави достъпната и бърза диагностика критично важна, особено в условия на ограничени ресурси.

• Настоящите тестове са компромис между точност, скорост и цена. „Златният стандарт“ за култура е много точен, но бавен; микроскопията е бърза, но нечувствителна; PCR платформи като Xpert MTB/RIF Ultra са значително по-чувствителни (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), но изискват скъпо оборудване и патрони, което ограничава обхвата.
• Защо изотермично и CRISPR. Изотермичната RPA амплификация работи при 37–42 °C и не изисква термоциклери — удобно „на място“. CRISPR отчитането (Cas12/13) добавя видова специфичност и позволява визуален страничен поток („лента“) без сложна оптика. Като цяло, това е пътят към преносими и евтини PVR тестове.
• Защо две MBT мишени едновременно (IS6110 + IS1081). IS6110 е многокопиен инсерт от комплекса M. tuberculosis, но някои линии имат малко копия и тестовете само за IS6110 може да „пропуснат“. Добавянето на втори IS1081 инсерт намалява риска от фалшиво отрицателни резултати.
• Защо е необходим вътрешен човешки контрол. Пробите от дишане могат да съдържат инхибитори и „лоши“ проби. Ендогенният човешки контрол (напр. RNase P/геномна ДНК) потвърждава, че материалът е адекватен и реакцията не е потисната - в противен случай резултатът не може да се счита за отрицателен.
• Форматът с един съд е важен сам по себе си. Той намалява стъпките, намалява риска от замърсяване и улеснява работата извън лабораторията. Подобни подходи за туберкулоза вече са показали жизнеспособност; новата работа разширява идеята до формат с две мишени с вътрешни контроли, плюс демонстрира лиофилизация на реагенти и четец на ленти.
• Каква е стойността на настоящата статия? Авторите демонстрираха откриване директно от храчки след възможно най-опростена подготовка на пробата, граница на откриване от ~70–80 CFU/ml в симулирана храчка и 100% чувствителност/специфичност при малък сляп набор от клинични проби — добра „технологична демонстрация“ за по-нататъшни многоцентрови валидации.

Как работи това

• Учените комбинирали RPA (бърза изотермична амплификация на генетичен материал при 37 °C) с „режещите“ ензими Cas13a/Cas12a. След като избрали водещите РНК, те конфигурирали системата да се насочи едновременно към две MBT мишени и паралелно с човешката ДНК (проверявайки дали изобщо има материал в пробата и дали реакцията не е „застояла“).
• Цялата химия се събира в една епруветка; след инкубация резултатът се отчита или с флуориметър, или на латерална флоу-стрип - по същество като експресен тест.
• Обработката на храчки е опростена до нагряване и кратко центрофугиране – без екстрактори на нуклеинови киселини. За най-ограничените случаи авторите дори обсъждат ръчни алтернативи на центрофугата.

Какво показаха тестовете

• Граница на откриване: 69,0 CFU/ml (щам H37Rv) и 80,5 CFU/ml (BCG) в „шипови“ храчки. Не е открита кръстосана реактивност с други бактерии/гъбички.
• Клинична обстановка (слепи проби): върху 13 проби от реална практика - 100% чувствителност (6/6) и 100% специфичност (7/7) спрямо посявката. За сравнение, върху същия комплект GeneXpert Ultra показа съответно 100%/86%.
• Технически нюанси: от двата варианта за отчитане, Cas13a се оказа по-добър (за формата "еднопотенциометър" той е по-чувствителен от Cas12a). Освен това, паралелното тестване на две Mtb мишени намалява риска от фалшиви резултати.

Защо е необходимо това?

Днешните тестове са компромис между точност, скорост и наличност: посявката е много точна, но бавна; тампоните са бързи, но неточни; PCR системи като GeneXpert са точни и бързи, но изискват скъпи инструменти и патрони. Новият подход CRISPR има за цел да преодолее тази празнина: полева диагностика, която работи при 37°C, с отчитане на хартиени ленти и възможност за съхранение на реагенти без охлаждане.

Ограничения и какво следва

Това е ранна демонстрация върху малък клиничен набор - необходими са големи, многоцентрови тестове (включително коинфекция с ХИВ, при деца, с пауцибацилни форми и различни линии MBT). Авторите отделно отбелязват, че в самата „полева“ версия настолната центрофуга ще трябва да бъде заменена с изцяло ръчно решение. Но самата архитектура - „две мишени + вътрешен контрол“ в една епруветка - вече е доказала своята оперативност и осигурява ясен път към усъвършенстване за масово приложение.

Източник: Alexandra G. Bell et al. Опростен тест, базиран на CRISPR, за откриване на туберкулоза директно от храчки, Science Advances, онлайн 6 август 2025 г. (том 11, брой 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206