Прилагане на клетъчни технологии за подобряване на външния вид на белезите

Съвременната наука се характеризира с бързото развитие на редица сродни дисциплини, обединени под общото наименование „биотехнология“. Този раздел от науката, базиран на най-новите постижения в областта на биологията, цитологията, молекулярната генетика, генното инженерство, трансплантологията, има за цел да използва огромния потенциал, присъщ на растителните и животинските клетки - основните структурни единици на всички живи същества. „Живата клетка е готов биотехнологичен реактор, в който се реализират не само процесите, водещи до образуването на крайния продукт, но и редица други, които спомагат за поддържането на каталитичната активност на системата на високо ниво“ - Джон Удуърд, 1992. Началото на клетъчната наука е положено през 1665 г., когато английският физик Р. Хук създава първия микроскоп и открива клетки - cellulae („клетки“) в корк. През 1829 г. М. Шлайден и Т. Шван обосновават „клетъчната теория“, която доказва, че всички живи същества се състоят от клетки. През 1858 г. Р. Вирхов доказва, че всички болести се основават на нарушение на структурната организация и метаболизма на клетките. Той става основател на „клетъчната патология“. Фундаментален принос към науката за клетката е направен през 1907-1911 г. от Р. Харисън и А. А. Максимов, които доказват възможността за култивиране на клетки извън тялото. Тяхната работа показва, че за култивиране на клетки, животинските тъкани и растителните части трябва да бъдат механично разделени на малки парченца. За да се изолират клетките, тъканите се нарязват с остър нож или микротом на тънки срези, приблизително 0,5-1,0 мм. Физическото разделяне на клетките се нарича обездвижване. Изолираните клетки се получават чрез ензимно диспергиране на парченца растения или тъкани. След смилане с остри ножици, парченцата се обработват с трипсин или колагеназа, за да се получи суспензия - суспензия от отделни клетки или техни микроагрегати в специална среда. Алгинатните гелове (калциев алгинат) се използват широко за обездвижване на растителни клетки. Доказано е, че обездвижените растителни и животински клетки запазват способността си да биосинтезират. Продуктите на клетъчната биосинтеза се натрупват в клетките, тяхната експресия протича или спонтанно, или с помощта на специални вещества, които насърчават повишената пропускливост на клетъчните мембрани.

Култивирането на животински клетки е много по-сложен процес от култивирането на растителни клетки, изискващ специално съвременно оборудване, високи технологии, наличието на различни среди, растежни фактори, предназначени да запазят жизнеспособността на клетките и да ги поддържат в състояние на висока функционална активност. Установено е, че повечето клетки от твърди тъкани, като бъбречни, чернодробни и кожни тъкани, са повърхностно зависими, така че могат да се култивират in vitro само под формата на тънки листове или монослоеве, директно свързани с повърхността на субстрата. Продължителността на живота, пролиферацията и функционалната стабилност на клетките, получени чрез ензимна дисперсия на тъкани, до голяма степен зависят от субстрата, върху който се отглеждат. Известно е, че всички клетки, получени от тъкани на гръбначни животни, имат отрицателен повърхностен заряд, така че положително заредените субстрати са подходящи за тяхното обездвижване. Изолирани клетки, получени директно от цели тъкани, могат да се поддържат в първична култура в обездвижено състояние, като същевременно се запазва висока специфичност и чувствителност в продължение на 10-14 дни. Имобилизираните, повърхностно зависими клетки играят основна роля в биологията днес, особено в клиничните изследвания. Те се използват за изучаване на циклите на клетъчно развитие, регулирането на техния растеж и диференциация, функционалните и морфологични разлики между нормалните и туморните клетки. Имобилизираните клетъчни монослоеве се използват в биотестове, за количествено определяне на биологично активни вещества, както и за изучаване на ефекта на различни лекарства и токсини върху тях. Лекари от всички специалности проявяват голям интерес към клетката като терапевтично средство от десетилетия. Клетъчните технологии в момента се развиват бързо в тази посока.

Началото на тъканната и клетъчната терапия се свързва с името на известния руски учен В. П. Филатов, който през 1913 г. полага основите на доктрината за тъканната терапия, изучавайки резултатите от трансплантации на роговица от здрави донори на пациенти с катаракта. В процеса на работа с трансплантации на роговица той открива, че консервираната на студено в продължение на 1-3 дни при температура -2-4 градуса по Целзий роговица се вкоренява по-добре от прясната. Така е открито свойството на клетките да отделят някои вещества при неблагоприятни условия, които възбуждат жизненоважни процеси в трансплантираните тъкани и регенеративни в тъканите на реципиента. Тъканите и клетките, отделени от тялото, са в състояние на стрес, тоест забавят жизнената си дейност. Кръвообращението в тях спира, а следователно и храненето. Тъканното дишане е изключително затруднено, инервацията и трофиката са нарушени. Намирайки се в ново качествено състояние, адаптирайки се към новите условия на съществуване, клетките произвеждат специални вещества с лечебни свойства. Тези вещества с небелтъчен характер са наречени от В. П. Филатов биогенни стимуланти. Той установява заедно с В. В. Скородинская, че материал от животни и растения може свободно да се автоклавира при t 120 градуса C в продължение на един час след съхранение в неблагоприятни условия и не само не губи активност, а напротив, повишава я, което се обяснява с освобождаването на биологични стимуланти от консервираните тъкани. Освен това, той губи антигенни свойства, което значително намалява възможността за отхвърляне. Консервираният стерилен материал е въвеждан в тялото чрез имплантиране (плантация) под кожата или под формата на инжекции с екстракти, с адекватни резултати. Установява се също, че феталните тъкани съдържат значително по-голям брой биологично активни вещества от тъканите на възрастни индивиди, а някои фактори се срещат само в ембрионите. Инокулираните фетални тъкани не се възприемат от организма на реципиента като чужди поради липсата на протеини, отговорни за видовата, тъканната и индивидуалната специфичност (протеини на главния комплекс за хистосъвместимост) в цитоплазмените мембрани. В резултат на това инокулирането на животински фетални тъкани в човешкия организъм не задейства механизми на имунна защита и реакции на несъвместимост и отхвърляне. В. П. Филатов широко използвал човешка плацента и кожа в медицинската си практика. Курсовете на лечение се състояли от 30-45 инжекции с тъканни екстракти и 1-2 имплантации на автоклавирани тъкани.

След като започна изследванията си с човешки и животински тъкани и клетки, той пренесе обобщенията си върху растителния свят. Провеждайки експерименти с живи части на растения (алое, живовляк, агаве, цвекло, жълт кантарион и др.), той създаде неблагоприятни условия за тях, поставяйки отрязаните листа на тъмно място, тъй като растението се нуждае от светлина за жизнените си функции. Той също така изолира биогенни стимуланти от естуарна кал и торф, поради факта, че калта и торфът се образуват с участието на микрофлора и микрофауна.

Тъканната терапия получава нов етап от своето развитие в края на 70-те години, когато натрупаните през десетилетията знания и опит позволяват използването на животински и растителни тъкани и клетки на качествено ново ниво за лечение на хора и удължаване на активното им дълголетие. Така в някои местни клиники и редица чуждестранни жени във физиологична менопауза с климактеричен синдром или на фона на овариектомия започват да се подлагат на тъканна терапия с фетални тъкани на плацентата, хипоталамуса, черния дроб, яйчниците, тимуса и щитовидната жлеза, за да забавят процесите на стареене, развитието на атеросклероза, остеопороза, нарушения на имунната, ендокринната и нервната системи. В една от най-престижните геронтокозметологични клиники в Западна Европа инжекции с екстракти, получени от фетални тъкани на половите жлези на овни, се използват за същите цели от няколко десетилетия.

В нашата страна биостимулиращото лечение също е намерило широко приложение. Доскоро на пациенти с различни заболявания активно се предписваха инжекции с екстракти от плацента, алое, каланхое, седум майор (биосед), FiBS, пелоиден дестилат, пелоидин, торф, хумисол, приготвени по метода на В. П. Филатов. В момента е почти невъзможно да се закупят тези високоефективни и евтини домашни тъканни препарати от животински, растителен и минерален произход в аптеките.

Основата за получаване на различни биогенни препарати от човешки тъкани и органи от вносно производство, като румалон (от хрущялна тъкан и костен мозък), актовегин (от телешка кръв), солкосерил (екстракт от говежда кръв), както и местни препарати - стъкловидно тяло (от стъкловидното тяло на окото на говедата), керакол (от роговицата на говедата), спленин (от далака на говедата), епиталамин (от епиталамо-епифизната област), са също изследванията на В. П. Филатов. Обединяващото свойство за всички тъканни препарати е общият ефект върху целия организъм като цяло. Така „Тъканна терапия“ на академик В. П. Филатов е в основата на повечето съвременни разработки и направления в хирургията, имунологията, акушерството и гинекологията, геронтологията, комбустиологията, дерматологията и козметологията, свързани с клетката и продуктите от нейния биосинтез.

Проблемът с трансплантацията на тъкани тревожи човечеството от древни времена. Така, в папируса на Еберс, датиран от 8000 г. пр.н.е., вече се споменава за използването на трансплантация на тъкани за компенсиране на дефекти в отделни области на тялото. В „Книгата на живота“ на индийския учен Сушрута, живял 1000 години пр.н.е., има подробно описание на възстановяването на носа от кожата на бузите и челото.

Нуждата от донорска кожа нараства пропорционално на увеличаването на броя на пластичните и реконструктивни операции. В тази връзка започва да се използва кадаверна и фетална кожа. Има нужда от запазване на донорските ресурси и намиране на начини за заместване на човешката кожа с животински тъкани, както и различни варианти за моделиране на кожата. И именно в тази посока работят учените, когато през 1941 г. П. Медовар за първи път демонстрира фундаменталната възможност за растеж на кератиноцити in vitro. Следващият важен етап в развитието на клетъчните технологии е работата на Карасек М. и Чарлтън М., които през 1971 г. извършват първата успешна трансплантация на автоложни кератиноцити от първична култура върху рани на заек, използвайки колагенов гел като субстрат за култивиране на CC, което подобрява клетъчната пролиферация в културата. Й. Райнвалд. Х. Грийн. разработва технология за серийно култивиране на големи количества човешки кератиноцити. През 1979 г. Грийн и неговите съавтори откриват перспективите за терапевтичното приложение на клетъчната култура от кератиноцити при възстановяване на кожата при обширни изгаряния, след което тази техника, непрекъснато усъвършенствана, започва да се използва от хирурзи в центрове за изгаряния в чужбина и у нас.

В процеса на изучаване на живите клетки е установено, че клетките произвеждат не само биогенни стимулатори с непротеинов произход, но и редица цитокини, медиатори, растежни фактори, полипептиди, които играят важна роля в регулирането на хомеостазата на целия организъм. Установено е, че различни клетки и тъкани съдържат пептидни биорегулатори, които имат широк спектър на биологично действие и координират процесите на развитие и функциониране на многоклетъчни системи. Започва ерата на използване на клетъчната култура като терапевтично средство. В нашата страна трансплантацията на фибробластна суспензия и многослойни кератиноцитни клетъчни слоеве е възприета в комбустиологията през последните десетилетия. Такъв активен интерес към трансплантацията на кожни клетки на пациенти с изгаряния се обяснява с необходимостта от бързо затваряне на големи повърхности на изгаряния и недостиг на донорска кожа. Възможността за изолиране на клетки от малко парче кожа, способно да покрие ранева повърхност 1000 или дори 10 000 пъти по-голяма от площта на донорската кожа, се оказа много привлекателна и важна за комбустиологията и пациентите с изгаряния. Процентът на присаждане на кератиноцитния слой варира в зависимост от площта на изгарянето, възрастта и здравословното състояние на пациента от 71,5 до 93,6%. Интересът към трансплантацията на кератиноцити и фибробласти е свързан не само с възможността за бързо затваряне на кожен дефект, но и с факта, че тези трансплантации имат мощен биологично активен потенциал за подобряване на външния вид на тъканите, получени в резултат на трансплантация. Образуване на нови съдове, облекчаване на хипоксията, подобрен трофизъм, ускорено съзряване на незряла тъкан - това е морфофункционалната основа за тези положителни промени, настъпващи поради освобождаването на растежни фактори и цитокини от трансплантираните клетки. По този начин, благодарение на въвеждането в медицинската практика на прогресивни клетъчни технологии за трансплантация на многоклетъчни слоеве от автоложни и алогенни кератиноцити и фибробласти върху големи раневи повърхности, комбустиолозите успяха не само да намалят смъртността на жертвите на изгаряния с висок процент кожни лезии, но и да подобрят качествено белеговата тъкан, която неизбежно се образува на мястото на изгаряния от IIb, IIIa и b степен. Опитът на комбустиолозите, придобит при лечението на раневи повърхности при пациенти с изгаряния, подсказва идеята за използване на вече модифицирания метод на Грийн в дерматохирургичната практика при различни кожни и козметични патологии (трофични язви, витилиго, невуси, булозна епидермолиза, премахване на татуировки, свързани с възрастта кожни промени и за подобряване на външния вид на белези).

Използването на алогенни кератиноцити в хирургията, комбустиологията и дерматокозметологията има редица предимства пред използването на автоложни кератиноцити, тъй като клетъчният материал може да се приготвя предварително в неограничени количества, да се консервира и използва при необходимост. Известно е също, че алогенните кератиноцити (КК) имат намалена антигенна активност, тъй като при култивиране in vitro губят Лангерхансови клетки, които са носители на антигените на HLA комплекса. Използването на алогенни КК се подкрепя и от факта, че те се заместват с автоложни след трансплантация, според различни автори, в рамките на 10 дни до 3 месеца. В тази връзка днес в много страни са създадени клетъчни банки, благодарение на които е възможно да се получат клетъчни трансплантати в необходимото количество и в точното време. Такива банки съществуват в Германия, САЩ и Япония.

Интересът към използването на клетъчни технологии в дерматокозметологията се дължи на факта, че „клетъчните композиции“ носят мощен биоенергиен и информационен потенциал, благодарение на който е възможно да се получат качествено нови резултати от лечението. Автокините, секретирани от трансплантирани клетки (растежни фактори, цитокини, азотен оксид и др.), действат предимно върху собствените фибробласти на организма, повишавайки тяхната синтетична и пролиферативна активност. Този факт е особено привлекателен за изследователите, тъй като фибробластът е ключова клетка на дермата, чиято функционална активност определя състоянието на всички кожни слоеве. Известно е също, че след увреждане на кожата с каутеризация, лазер, игла и други инструменти, кожата се попълва с пресни стволови прекурсори на фибробласти от костен мозък, мастна тъкан и капилярни перицити, което допринася за „подмладяването“ на пула от телесни клетки. Те активно започват да синтезират колаген, еластин, ензими, гликозаминогликани, растежни фактори и други биологично активни молекули, което води до повишена хидратация и васкуларизация на дермата, подобрявайки нейната здравина.