Експериментална работа по трансплантация на алогенни кератиноцити върху изкуствено създадени белези от бели плъхове

Желанието да се използва клетъчен потенциал и необходимостта от търсене на нови ефективни методи за подобряване на естетическия вид на белезите доведоха до идеята да се опита да се проучи възможността за трансплантация на кератиноцити до белези.

За да се докаже възможността за използване на кератиноцитите културата за подобряване на външния вид на белези експериментална работа е свършена в бели лабораторни плъхове, които са създадени на белега. Модел плъхове белези се получават чрез изкуствено зарастващи рани, нанесени на гърба, по протежение на гръбначния стълб. Плъховете бяха нарязани на части от същия кожата, размера на 2x3 cm. След 2.5 месеца след операция "симулация белези" плъхове се провежда дермабразио хирургия (отстраняване на горните слоеве чрез ignioperation търбуха) и трансплантирани алогенни кератиноцитите, изолирани от кожата на млади плъхове 2-4 дни след раждането.

Изолирането и растежът на епидермоцитите на плъхове се извършва в лабораторията на клетъчните технологии на Института по цитология RAS на следната технология.

Кожата се промива с физиологичен разтвор на Hank разтвор, съдържащ 200 U / мл гентамицин, нарязани на малки парчета, с площ от 0.2-0.5 cm ². Кожните кожи се инкубират в 0.5% разтвор на дисаспаза в балансиран разтвор на буфериран физиологичен разтвор с фосфат при 37 ° С за един час. След това парчетата се прехвърлят в солеви буферирани с Dulbecco фосфат и епидермисът се отделя от дермата. Епидермисът се инкубират в 0,125% разтвор на трипсин в продължение на 10-15 минути при разбъркване със скорост 50 об / мин, след което ензимът се спира чрез прибавяне на 5% фетален говежди серум. Една трета от получената клетъчна суспензия се използва в чист вид за една от опциите за трансплантация белези, втората трета отглежда върху вътрешния биосъвместим филмово покритие "Polipor", третият - за петриево блюдо без субстрат. Операция дермабразио получава белези при плъхове с последващо прехвърляне към тях epidermotsitov плъх под етерна анестезия се извършва чрез използване обгаряне.

Първата група плъхове след дермабразио на полиран, промива се с физиологичен разтвор и се изсушава повърхността стерилни търбуха насложени парчета на тревата, която е депозирана бъркани суспензия алогенна плъх epidermotsitov при концентрация от 1.5 милиона клетки на 1 мл (според Института по цитология). Батистовските парчета се вписват в полиран белег, така че клетките да лежат на повърхността на белега. Превръзка на върха на няколко слоя марля, която се пришити към краищата на белега.

Част от получената клетъчна суспензия се посява в петриеви блюда върху стерилни филми Polypore, нарязани във формата на чаши, а другата част върху петриеви блюда без филм. Култивирането се провежда в среда FAD, състояща се от смес от DMEM и F12 в съотношение 3: 1. С добавяне на 10% фетален говежди серум, 5 ug / ml инсулин (Sigma), 0.5 ug / ml хидрокортизон хемисукцинат (Sigma). 10 μg / ml епидермален растежен фактор EGF (Институт по цитология RAS, Санкт Петербург). Втората и третата група от плъхове със 7 индивида са експлоатирани 6 дни след първата. По това време многослойни слоеве се образуват от суспензията от засяти кератиноцити в петриеви блюда, които са били трансплантирани на плъхове. Втората група е трансплантирана с епидермоцити върху филма, третата група - с многопластов слой без субстрат. След 7 дни, многослойните слоеве от алогични кератиноцити (MPALK), засети на филми Polypore, се трансплантират чрез култура директно върху повърхността на раната. По-горе, филмът, за да се избегне извличането му, е фиксиран с многослойна превръзка от марля и пришит към кожата на плъховете.

Преди разсаждане кератиноцити трета група от плъхове, отглеждани без субстрата, като се получава разделяне на PAC от дъното на лечението ястие диспаза на Петри, имащо способността селективно да прекъсне дермо-епидермален съобщението. Под действието на многослоен резервоар диспаза разрушава връзката на базалния клетъчен слой на дъното на чашката на Петри и в много по-малка степен, това се отразява на междуклетъчната комуникация, което прави възможно да се "отделяне" на целия слой. Отделянето на многослойния клетъчен слой от устройството се извършва по следния начин. От петрита смесени транспортна среда, клетъчните листове се промиват три пъти със среда, съдържаща антибиотици, по-специално - гентамицин (0.2 мг / мл). Многослойни слоеве се изливат 0,125% разтвор диспаза ( «Sigma») и се поставят в инкубатор, където те се инкубират при Т = 37 ° С в продължение на 20-30 минути. Външният вид на бяло венче, лющене около периферията на резервоара - показател за началото на процеса на отделянето от краищата и дъното на чашката на Петри. Няколко минути след началото на процеса на отделяне, диспаза разтвор се изпразват 2-3 пъти епителните слоеве се промиват със среда. На се прилага на повърхността на епидермалния слой, изрязани на чаша парче стерилна превръзка на рана "Leith-цвят, който се разцепва отделя диспаза формация, допълнително отделяне на дъното на чашата с шпатула. Използване на офталмологични пинсети слой заедно с покритието на салфетката" Leith-цвят "(на руски ) проби от дъното на петриево блюдо и внимателно прехвърля в подготвената повърхност на белега. Салфетки "Лита цвят" съдържа в състава си и гентамицин eksolin (колаген екстракт), която, когато влажна среда остава кълнове в бъдеще Сим физиологичен разтвор набъбна и стана модерно рана покритие, което осигурява добра защита от външни инфекции и бързо заздравяване поради започващо овлажняване на структурата.

Полипроп филмите и салфетките Lita-color бяха наслоени с марлеви превръзки, които бяха зашити върху кожата на плъховете за по-трайно фиксиране. Всеки плъх е засаден в отделна клетка, за да се създадат оптимални условия за неговото поддържане и присаждане на трансплантирани кератиноцити. Превръзки плъхове че трансплантираните суспензия и многослоен резервоар epidermotsitov удар диспаза, всеки ден по няколко пъти на ден, навлажнени с стерилен физиологичен разтвор за създаване на най-благоприятни условия клетките за присаждане. Като се има предвид, че филмът "Полипор" е непроницаем за водата, плъховете от втората група не навлажняват превръзките, което е едно от предимствата пред трансплантациите без филми. След 10 дни превръзките се отстраняват. Клиничната картина на белезите след клетъчната трансплантация се различаваше малко от белезите без трансплантация, с изключение на по-розово оцветяване (поради дермабразио) и по-голям пилинг. Този факт подсказва това. Че непосредствено след изчезването на покритията от рани с IPC не настъпиха промени в сперматозоидите.

Приемане на биопсичен материал при плъхове.

След 1, 2, 5 и 9 месеца след трансплантацията на кератиноцити на плъх allogichnyh земята белези бели плъхове, като произведен материал за хистологично, cytomorphological и електрон микроскопски изследвания. Като контролни проби от нормална кожа и белег на плъх бяха взети без трансплантация на клетки. Анестезията при плъхове се извършва с етерна анестезия.

След анестезия, от маркираните области, в които се трансплантират кератиноцитите, се използва биопсичен пробойник с диаметър 2 mm. Частите от тъканта на белег бяха взети и поставени в 2.5% разтвор на глутаралдехид за приготвяне на материала за електронна микроскопия. Парчета от тъкан, взети за хистологично изследване се поставят в 10% разтвор на неутрален формалин, последвани от чрез окабеляване алкохоли и напълнени в парафин, последвано от намаляване на ултратънки части и ги гледане в микроскоп светлина оптичен.

Контрол I. Нормална кожа на плъхове.

За да се види разликата между микроскопичната картина на нормалната белодробно изменена кожа на плъхове и белези в определени моменти след IPC трансплантацията, се демонстрират снимки и описания към тях на всички етапи на това изследване.

Епидермиса на нормалната кожа се състои от 7-9 слоя клетки. Сламен слой с умерена дебелина. На места се състои от 6-8 слоя рогови везни. Базовият слой е представен от клетки с цилиндрична форма с голяма светлина, обикновени ядра и няколко нуклеоли. Дезмомалните връзки между клетките и основната мембрана са ясно изразени. Съгласно добре дефинирана базалната мембрана, която има фини издатини в подкожно слой лежат успоредно на нежни връзки на колаген и еластинови влакна, включително удължени фибробласти, малки плавателни съдове. В по-дълбоките слоеве, връзките на колаген и еластин влакна се намират в различни посоки. Сред тях има много съдове с тънки стени от същия калибър, клетъчни елементи (фибробласти, мастни клетки, левкоцити). В голям брой космени фоликули, мастните жлези.

Контрол 2. Белег на плъх на възраст 2 месеца.

Клинична картина. Белезите са бледо розови, с пилинг, на места остават кората. Тяхната площ се намалява поради свиване на колагенови влакна и да стане приблизително 3.0-3.5 cm ^:. Присъединяването към кожата отсъства.

Микроскопична картина. Епидермиса се състои от 3-5 слоя клетки, нагънати, представени чрез заоблени базалните клетки, един ред тънък, 1-2 реда keratohyalin гранули с зърна в горния слой, има части от вътреклетъчното оток. Стената на роговицата е променена хетерогенно от много тънка до сгъстена. Има сгъване на брадата поради (свиване) на белези. Гънките проникват в папиларния слой и създават впечатление за папили. Границата между епидермиса и дермата е права линия. Базалната мембрана не може да бъде проследена навсякъде. В долната част на по-дълбоките и по-дълбоки слоеве - съдове с дебела, разхлабена стена, много изоставени, със застояли явления. Около съдовете - клъстер от макрофаги, фибробласти. Макрофагите заобикалят еритроцитите, излизащи от капилярите, и фагоцитизират ги. В по-повърхностните слоеве - малки капиляри. Под епидермиса колагеновите влакна са насипни. В по-дълбокия слой на румените - груби връзки от колагенни влакна, сред които има много фибробласти.

Белези на плъх месец след трансплантацията на кератиноцити от плъхове от плъх MPAl.

Клинична картина. Белезите розови, площта им намалява, особено в диаметър и средно 2,5-3 см ². Косата и мастните жлези отсъстват.

Това микроскопско изследване на материала, получен от плъхове с трансфер MPAlK MPAlK на филма и субстрата без по същество идентични. Въпреки това, технически, работа с MPAlK неподдържан много по-трудно и трудоемко, отколкото когато се отглежда MPAlK върху субстрата, така че по-нататъшното изследване на въпроса за трансплантацията kertainotsitov белези ние се използва като основа за отглеждане ( "основа") пластове морава.

Микроскопична картина. Има сгъстяване на епидермиса до 15-20 слоя, почти до средата на които кератиноцитите имат тесни, удължени, вертикални форми и компактна подредба. Базовите клетки са разположени в неравномерна линия. Техните ядра са леки, големи, кръгли във форма с един или два нуклеоли, което показва тяхната висока синтетична и пролиферативна активност. Границата между епидермиса и дермата е права линия. Тортинг слой е добре развит, се състои от 3-5 слоя клетки с кръгла форма, има 2 ядрени клетки.

Непосредствено под базална мембрана - plotnoraspolozhennye тънки връзки от колагенови влакна успоредно на големия брой съдове zapustevshih дълбоки колагенови влакна груба събрани в тесни връзки. Много големи фибробласти, мастни клетки (2-3 в областта на зрението), макрофаги, левкоцити и празни съдове, чиито стени се разхлабват, около тях има свободно разположени колагенови влакна. В някои съдове - стазис, диапедеза на еднородни елементи. Около съдовете - фибробласти, единични лимфоцити. Присъединяването към кожата отсъства.

Когато кератиноцитната суспензия се трансплантира до полиран белег, микроскопската картина се различава от предишната. При повечето животни - епидермисът е тънък, се състои от 5-6 слоя клетки. Долният слой се състои от клетки с неправилна полигонална форма с закръглени неправилно оформени ядра. Състоянието на подпедердермалния слой е подобно на това в групата животни без трансплантация.

В този случай може да се говори или за забавяне на процесите, придружаващи клетъчната трансплантация, или за голяма загуба на клетки, трансплантирани под формата на суспензия. Следователно е направено заключение, че корекцията на белези чрез трансплантация на кератиноцити под формата на суспензия е неподходяща.

Белези на плъха 2 месеца след трансплантацията на MPA1 плъши кератиноцити от плъх.

Клинична картина. Белегът изглежда тънък, нежен. На места има екдиза, скали.

Микроскопични снимки. В роговия слой се удебелява, на места - хиперкератоза. Епидермисът е сгъстен, състои се от 12-20 реда клетки. Границата между епидермиса и дермата е права линия. Деликатните колагенови влакна под епидермиса лежат доста плътно. В по-дълбоките слоеве на брега се събират в груби големи снопове. В субсеридермалния слой се появява ново образуване на съдове. В долните слоеве на белези тъкан - много празни съдове, разположени успоредно на повърхността на епидермиса. Големите фибробласти са равномерно разпределени в дебелината на рогата, има гигантски, многостранен, много макрофаги.

Белези на плъхове 5 месеца след трансплантацията на MP на сперматоцити от плъх.

Клинична картина. Белег изглежда гладка, гладка, без обелване, има един косъм на тяхната по-голяма плътност на периферията на белега, който показва ръба подкожни космените фоликули в търбуха и неоплазма на космените фоликули. Районът на белезите продължава да намалява.

Микроскопична картина. Епидермиса все още е дебел (15-20 слоя, понякога до 30) в горните слоеве се напълва с кератогиалин зърна. Базалната мембрана е ясно видима. Под нейните колагенови влакна лежи свободно. В долните слоеве - колагенът е по-мощен и плътно опакован. Сред гредите на колаген има много капиляри .. В горните слоеве броят на празните съдове намалява. Епидермиса и дермата са леко вълнисти. Има дълбоки епидермални израстъци в тъканта на белезите. Сред колагенните влакна се виждат новообразувани съдове. Появяват се единични космени фоликули и мастните жлези.

Белези на плъха 9 месеца след трансплантацията на епидермоцити от плъхове от IPA плъхове.

Клинична картина. Белезите стават много по-малки в сравнение с по-ранните срокове, а площта им е около 1,5-2,0 см ². Белезите са неравномерно покрити с тънка коса, особено около периферията. Използва се маловажното мащабиране на малки пластини.

Микроскопична картина.

Епидермисът става по-тънък, представен от 6-8 редици клетки, напомнящ за епидермалната структура на нормалната кожа на плъхове, само плътността на клетките с 1 mm. По-високи и по-малки. Основният слой се състои от малки клетки с кръгла цилиндрична форма. Базалната мембрана е добре дефинирана, хемидемозомите са ясно видими. Наблюдава се наличието на епидермални израстъци в подперидънния слой. Папиларният слой се изразява по цялата дължина на белега. Тези факти показват, че за този период от време адхезията на трансплантираните кератиноцити е станала значително по-силна с подлежащите тъкани на бременността. Следователно грижата за белези на хора с трансплантация на МАЛС на 9 месеца след трансплантацията на ИКС може да бъде традиционна. Под епидермиса има по-деликатни колагенни влакна, отколкото в дълбоките слоеве. Имаше много плавателни съдове, особено повърхностно разположени. При по-големи съдове стените се уплътняват. Космените фоликули и мастните жлези в големи количества. Микроскопичният модел прилича на дермална тъкан.

Резултати от експерименталната работа и тяхното обсъждане.

По време на работата на изкуствени кожни белези на плъхове след операция дермабразио, трансплантирани кератиноцити в различни formah- на рани повърхности, като суспензия в батиста и образуване пластове без субстрат. Работата беше извършена за получаване на морфологични данни за ефекта на трансплантираните алогенни кератиноцити върху белези, както и за определяне на оптималните варианти на трансплантация.

Установено е, че и трите метода за разсаждане реално, но без трансплантация Mpaka субстрат - много трудоемко процедура, по време на който Mpaka може да се нараните, се отразява на резултатите от трансплантация. Освен това, този метод на трансплантация изключва работата на големи повърхности.

Трансплантация на кератиноцит суспензия - е значително по-икономичен метод не изисква дълго култивиране на клетки и просто в настоящото изпълнение, контакт използват стерилни батиста преформи, размерите на които съответстват на стойността на белези. Backlog терапевтичен ефект, когато трансплантиране на клетъчната суспензия в продължение на около един месец, в сравнение с IPC на превръзката на раната - не значителен момент, когато продължителността на количество за лечение на много месеци. Известно е, че по време на трансплантацията на IPC за изгаряне на пациенти, трансформацията на състоянието на кожната структура е станала постепенно и в продължение на няколко години. Трансплантацията на кератиноцитната култура върху обвивките на рани е най-удобният и обещаващ метод, но също така е много по-скъп. В допълнение, се изисква търсенето на днешния подобрени варианти покрития, които трябва да бъдат гъвкав, хигроскопична, са бактериостатични или бактерицидни свойства и да бъдат биологично неутрален за клетки. Филмът "Polipor" - междинна версия на покритие на вътрешния филм рана, въпреки някои недостатъци, ни позволи да учат експериментално кератиноцити плъхове трансплантации на белези и да се направят изводи за ефективността на тази посока привличане белези.

Авторите, които извършват трансплантацията на раните IPC изгорени, отбелязват, че по време на първата седмица след трансплантацията на многослойни кератиноцитите резервоар на раната хигиенизирани, епидермиса се сгъстява и стратифицирана. Всички слоеве на епидермиса са добре дефинирани. Интересно е, че броят на клетъчните слоеве в трансплантатите е с 10-30% по-голям, отколкото при проби от биопсия на кожата. Авторите отбелязват появата на гранули на кератогиалин на 5-ия ден след трансплантацията на МРА, основната мембрана и хемидесмозомите - още на третия ден.

J. Rives et al. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuznetsov и сътр. (1998) откриват, че по време на ранните периоди след трансплантация пациенти КМП с polnosloynymi дефекти на кожата след изгаряния, комуникацията между дермиса и епидермиса е много слаба и е права линия, папиларен слой отсъства. До края на втория месец започва формирането на плитка папили и кожни придатъци, комуникационни дермата и епидермиса става по-силно. Литература данни govoryato трансплантация на алогенни кератиноцити за рана изгорени пациенти като обещаващ метод. Въпреки факта, че отхвърлянето на алогенни кератиноцити настъпва, представена от различни автори в периода от 10 дни до 3 месеца, обаче, те имат роля в заздравяването на повърхността на раната, освобождавайки фактори на растежа и механично затваряне на дефекта. Смята се, че MPAlK да намали антигенна активност, както при култивиране ин витро губят Лангерхансови клетки, която им позволява да съществува продължително време в тялото на реципиента. В допълнение, алогенна култура, получена от кожата на здрави млади хора имат много по-голям биологичен потенциал от автоложна култура на пациентите след травма.

Основната цел на нашето изследване беше да разбере дали алогенните кератиноцити ще оцелеят върху белезите и какви ще бъдат промените в тъканта на белега под влияние на такова биологично активно "покритие на раната". В случай на положителен резултат, разработете най-ефективната и най-малко трудоемка технология в тази област на рехабилитационната медицина.

Данните, получени от нас в много отношения, се оказаха подобни на литературните данни за морфологичните промени, настъпващи в човешкия епидермис след прехвърлянето на алогенни кератиноцити към изгаряне на рани. Но съществуват значителни различия както по отношение на морфологичния субстрат, който се трансплантира, така и по отношение на технологията. И така образуването на базалната мембрана и дермални-епидермален връзки (poludesmosom, папили) се извършва в по-късен момент в сравнение с прехвърляне на кератиноцити при повърхности на раната без белези. Това изглежда се дължи на лошото хранене на тъканите на рогата, в сравнение с дермата или мускулната фасция. Белегът, особено старият, е гъста съединителна тъкан с много малък брой съдове, а дъното на изгорелите рани е гранулационна тъкан, богата на кръвоносни съдове. По този начин е очевидно, че условията, при които се осъществява трансплантацията и присаждането на кератиноцитите, са напълно различни. Колкото по-кръвоснабдено е областта на трансплантацията на клетките, толкова по-лесно е да се обработват. От този постулат има заключение за предпочитанието за работа с млади белези, при които съединителната тъкан е все още достатъчно свободна и богата на кръвоносни съдове.

В резултат на тази експериментална работа се доказва, че:

1. Може да се извърши трансплантация на MALK до белези. 
2. Оптималният метод за трансплантация е трансплантацията на кератиноцити върху капака на раната.
3. Повърхността на белега трябва да се смила, като се използва оперативна дермабразия, като се използва лазер на Schumann или резачка.
4. Под влияние на MPALK се наблюдава бързото епителизиране на земната повърхност на бурето.
5. По-добрата васкуларизирана тъкан на белег, т.е. Колкото по-млад е белегът, толкова по-добри са резултатите от кератиноцитната трансплантация.
6. Тъканта на белега, под влияние на трансплантирани кератиноцити, постепенно се трансформира и се превръща в дермална (по-ужасна белезна тъкан с придатъци на кожата).
7. Постепенното разхлабване на тъканта на белега започва с подперидънния слой. Подобрява кръвоснабдяването му, снопчетата от колагенни влакна в горната и долната част на ръба получават по-крехко место, отколкото в тъканта на белега без трансплантация на клетки. Има космени фоликули и мастните жлези. Епидермиса в своята структура, след преминаване на фазата на хипертрофия, се доближава до епидермиса на нормалната кожа.
8. Наблюдаваните промени са свързани с кератиноцити секретирани растежни фактори, цитокини, които подобряват трофизъм на съединителна тъкан допринесе за превръщането му от твърда фиброзна тъкан в свободни, което води до подобряване на белега.

По този начин, въз основа на това проучване, може да се заключи, че благотворният ефект на трансплантираните кератиноцити върху тъканта на белега, което може да бъде от практическо значение за рехабилитацията на пациенти с различни видове белези.

Тази работа върху плъхове също позволи да се формулират изисквания. На обвивките за рани, на които се отглеждат кератиноцитите.

Покритията за рани трябва да бъдат:

• биосъвместим с клетки,
• дишаща
• имат еластична основа за изграждане на формата,
• да бъдат хидрофилни,
• тъй като лекарствените добавки съдържат антибактериални лекарства и антиоксидантите не са токсични за култивираните клетки.

Клинични резултати от биотехнологичното лечение на белези.

По-рано, N. Carver et al. (1993) откриват, че оклузивните превръзки са най-подходящи за прикрепване към раната и оцеляването на кератиноцитите, но не позволяват образуването на стратифициран (зрял) епидермис. За да се образува стратифицирана епидермиса, е необходима въздушна среда. Следователно, след прикрепяне на многослойния слой, след 7-10 се препоръчва оклузивно покриване на раната, за да се отстранят и да се извършват рани под сухи превръзки или водоразтворими мехлеми. Можем да кажем, че качеството и свойствата на "субстрата", върху който се отглеждат клетките, са много важни за ефективността на трансплантацията на клетъчния материал и следователно за резултатите от работата на лекарите. Но днес не съществува идеална рана, въпреки изобилието от предложените опции (изкуствена кожа, нетъкани платове от карбоксиметилцелулоза, фибринови покрития, полупропускливи полиуретанови филми). Незначителен момент по този въпрос са разходите за "субстрати" (специални покрития за рани), тъй като високата им цена увеличава общите разходи за биотехнологично лечение.

Ефективността на клетъчните технологии е доказана досега, но за съжаление тези технологии са много скъпи, особено в страни, където индустриалното производство на клетъчни състави не е установено. Въпреки това страни като Съединените щати отдавна създадоха индустрия за производство на клетъчен материал за трансплантация на изгорени. В частност, компанията BioSurface Technology Inc, от 1989 г. Насам, повдигнати 37,000 ламинирани слоя от кератиноцити, които са били използвани за лечение на 240 пациенти в 79 страни по целия свят (R.Odessey, 1992) с 1 cm ² клетъчна култура струва около 7-8 $ US.

Технологията за лечение на различни заболявания и кожни проблеми има редица различия, но сърцето на всяко лечение с клетки е производството на качествен клетъчен материал и неговата трансплантация.

Този процес се състои от следните стъпки:

• подбор на кожата от засегнатите (или от донори),
• транспортиране на кожни крила до биотехнологичния център,
• изолирането на клетките на основния слой и тяхното размножаване,
• натрупване на многослойни слоеве кератиноцити (IPC).
• трансплантация на клетъчни култури.

Основният проблем при лечението с трансплантация на многослойни кератиноцитни слоеве е необходимостта от жизнеспособни клетки на всички стадии на клетъчна трансплантация. Кожните части за изолиране на автоложни или алогенни клетки трябва да бъдат възможно най-тънки, тъй като в този случай те се разделят по-лесно с помощта на механични и ензимни методи и за получаване на суспензия от живи клетки за растеж. Те могат да бъдат получени чрез отрязване на дерматома или чрез използване на кожата на клепачите, препуциума, вътрешната повърхност на рамото. Като се има предвид, че клетките са чувствителни към халогени (хлор, йод), водороден пероксид, те не могат да се използват при лечението на кожата по време на приемането на материала.

Количественият и качествен добив на клетки от кожни присадки и ефективността на тяхното отглеждане също зависят от здравния статус и възрастта на донора. Освен това екземплярите от кожна биопсия трябва да бъдат доставени в лабораторията възможно най-скоро и при подходящи условия (околна среда, температура) да бъдат доставени в сертифицирана и акредитирана лаборатория.

Средната или средата на Eagle 199 с добавяне на 10% говежди серум, DMEM среда, допълнена с 5% фетален говежди серум и антибиотици, може да се използва за съхраняване и транспортиране на кожните клапи.

В цитологично лаборатория кожна биопсия първо механично отделено на малки парченца, последвано от третиране на кожни парчета с помощта на ензими: трипсин, колагеназа, диспаза, и др.

Под действието на ензими се извършва разрушаване с дезмозоми и кератиноцитите се освобождават в средата като отделни клетки или агрегати, състоящи се от различен брой клетки. За култура се използват само базални кератиноцити, които се отглеждат върху специална среда в инкубатори, съдържащи 5% СО. В петриеви блюда или във флакони при t = 37 ° С. В рамките на 48 часа се наблюдава образуване на кератиноцитни колонии, което постепенно се слива в монослой. След получаване на достатъчен брой клетки, получената суспензия се разстила върху капачките за рани, приготвени за тази цел, и се поставя в петриеви блюда. От суспензията се образува първо монослой и след това многослоен слой кератиноцити. Схематично, етапите на процеса на култивиране на кератиноцитите са показани на Фиг. 12 (33.43.54.65).

Образуването на многослойна кератиноцитна формация, подходяща за трансплантация, обикновено отнема 7-10 дни. Понякога този период е по-дълъг, което зависи от качеството на изходния материал (възраст, здраве на донора, точност на материала, качество на използваните медии и т.н.). Ако многослойният слой прераства, тогава на неговата повърхност може да има клетки с апоптозни явления, неподходящи за трансплантация. Петриеви блюда, които се отглеждат върху тях на многопластови слоеве кератоцити (IPC), се доставят в клиниката в специални контейнери при температура не по-ниска от + 15 ° С.

Модифицираният метод на Зелени за отглеждане на IPC

В нашата работа като покритие за рани ние използвахме многопластов камбрик, изоставяйки полипорните филми, с които започнахме да работим в експеримента с плъхове. По този начин, многослойни кератиноцитни слоеве се отглеждат от нас върху префектен и стерилен бастист, въпреки че не е и оптималното покриване на раната.

Проведени са клинични проучвания върху доброволци при спазване на необходимите етични норми: подписване на договор и информирано съгласие.

1. Провежда се култура от собствени (автоложни) и взети от банковите клетки (алогенни) кератиноцити.
2. Собствените кератиноцити се получават от парче кожа, изрязано от вътрешността на рамото на пациентите.
3. Експлоатацията на дермабразията на белезите се извършва с помощта на термодвойки, ротационни дискове и ербиен лазер.
4. Бяха взети групи от пациенти с норматрофни, хипотрофични и хипертрофични белези.

Технологичният процес за прилагане на клетъчна технология за подобряване на вида на кожните петна се състои от следните етапи:

1. Избор на пациенти.
2. Обяснете същността на лечението, времето за получаване на очакваните резултати, подписването на договор и информираното съгласие.
3. Назначаване на пациенти за 2-3 седмици преди операцията selmevit от 1t. 3 пъти на ден, zinkteral на 1t. 3 пъти на ден.
4. Приемане на парче кожа, дълъг от 2,0 см и широчина 0,7-1,0 см от вътрешната повърхност на рамото, високо, почти на дъното на аксиларната област, за да се получат автоложни кератиноцити.
5. В случай, че пациентите отказват да изолират собствените си кератиноцити поради възможността да получат линеен белег на вътрешната повърхност на рамото, клетъчният материал е взет от клетъчна банка (алогенни кератиноцити).
6. Кератиноцитите се изолират и отглеждат в условия на лаборатория, сертифицирана за този вид работа.
7. След получаване на IPC, достатъчен за трансплантация, ден на хирургическа интервенция се прилага на белезите в клиниката, където материалът се поставя в специални контейнери в петриеви блюда.
8. операция Дермабразио извършва търбуха хемостаза земната повърхност се промива със стерилен физиологичен разтвор, изсушава се, след което трансплантирани в стерилни IPC батиста "клетки надолу." Това означава, че клетките, които са били в горната част на MIC, са по-ниски, съседни на полираната повърхност.
9. Стерилен филм е насложен отгоре, който е фиксиран към кожата с еластична превръзка или емулсионна лента Omnifix. Вместо филм могат да се използват и безразлични покрития за рани, съдържащи силикон, например Mepitel, Mepiform, силиконови гел плочи.

След 5-7 дни филмът или силиконовото покритие се отстраняват. По това време всички кератиноцити трябва да пълзят по полиран белег и да се прикрепят към повърхността му.

10. Влажната среда, създадена под филма и силиконовото покритие, активно допринася за това. Баптистът, останал на белега от тази точка, може да бъде импрегниран с любопитен или хитозанов гел. В резултат на това на 2-ия ден се създава гъста коричка, която за удобство на пациента е по-добре да се фиксира с еластична пропусклива за въздух мазилка, например Omnifix. Дишащата коричка позволява на новообразуваната епидермис да се диференцира и да се превърне в зряла.

В зависимост от вида на белега и дълбочината на смилане, превръзката се отхвърля след 8-10 дни. Епидермисът в този момент има 30-40% повече клетъчни слоеве, отколкото в нормалната кожа. Базалната мембрана не се образува. Кератоцитите от сгъстения епидермис освобождават маса от биологично активни молекули в тъканта на белега.

Успехът на биотехнологичното лечение на белези до голяма степен зависи от начина, по който се полагат грижи в следоперативния период. Клетъчните култури са "нежен" вид покритие на раната и в ранните периоди след трансплантацията BMD може лесно да се отдели от тъканите, които лежат под нея. Ето защо пациентите се съветват да се грижат за белега след операцията. За 8-9 месеца не търкайте и не работете лесно с студена преварена вода, за да избегнете изтръгване на тънък, новосъздаден епидермис, който не е здраво захванат с подлежащите тъкани.

Забележка.

Преди операция и по време на използването на дермабразио халогенирани оксиданти и консерванти (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, хлорхексидин, водороден пероксид) е допустимо преди трансплантиране kletok- абсолютно противопоказано поради техните цитотоксични ефекти. Токсични за клетките също са метиленово синьо. Брилянтно зелено.

За да се избегне инфекция, особено при работа с хипертрофични белези, е възможно да се третира оперативното поле с неомицин сулфат, полимиксин или гентамицин. Те не оказват цитотоксичен ефект върху кератиноцитите.

В резултат на това лечение се постига тройно въздействие.

1. Подравняване на повърхността на ръба.
2. Създайте слой над него на нов епидермис, с нормална дебелина.
3. Превръщането на съединителна тъкан в dermopodobnuyu чрез действието на цитокини, растежни фактори и други биоактивни молекули, секретирани от трансплантираните клетки и кератиноцити, стимулирани от тях, фибробласти и макрофаги.

Белегът става по-малко забележим, по-еластичен, в него се порасват пори, косъмът се пуши, пигментацията може да се възстанови поради наличието на меланоцити в МРС.

Всички тези положителни моменти в цикатрикса обаче не идват веднага. В тази връзка е необходимо да се предупреждават пациентите. Че процесът на трансформация на тъканта на белега в дермата е бавен и оптималният резултат от такова лечение може да се очаква не по-рано от 10-14 месеца. Веднага след като обличането е отхвърлено, полираните повърхности имат подчертан полихром, толкова по-светъл е процесът на смилане. Най-малкото увреждане на кожата се получава при смилане на нормотрофните белези с ербиев лазер. Цветът на белезите и обграждащата се кожа е възстановен в периода от 3 до 8 седмици. Въпреки тези предпазни мерки, понякога има постоперативна хиперпигментация, която може да продължи самостоятелно в продължение на няколко месеца.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]