Невирусната генна терапия предлага надежда за хронична болка в кръста

В скорошно проучване, публикувано в списание Biomaterials, изследователите разработиха нова невирусна генна терапия за лечение на дискогенна болка в гърба (DBP) чрез доставяне на транскрипционния фактор Forkhead Кутия F1 (FOXF1) с използване на инженерни извънклетъчни везикули (eEV) в дегенеративни междупрешленни дискове (IVD) in vivo.

Хроничната болка в кръста (LBP) е нарастващ глобален проблем поради застаряващото население и влошаващите се проблеми с опиоидите. Настоящите лечения включват краткотрайно облекчение или скъпи операции, което подчертава необходимостта от непристрастяващи и по-малко инвазивни терапии.

Настоящите биологични терапии, включително приложение на растежен фактор, клетъчна терапия и вирусни генни терапии, могат да намалят дегенерацията при животински и човешки модели. Въпреки това опасения като краткосрочни ефекти, слаба дългосрочна ефикасност и ненужна имуногенност и туморогенност могат да попречат на директното прилагане на тези методи.

В това проучване изследователите установиха невирусна генна терапия за дегенерация на междупрешленните дискове (IVD), използвайки FOXF1-eEV.

Изследователите са трансфектирали първични миши ембрионални фибробласти (PMEF) с плазмид, съдържащ FOXF1 или pCMV6 като контрола, и са характеризирали eEV проби с помощта на анализ за проследяване на наночастици (NTA).

Те оцениха ефективното зареждане на молекулен товар в eEV, използвайки количествена полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (qRT-PCR) и конвенционална PCR. Western blot анализът идентифицира FOXF1 и специфични EV протеини в eEV образувания. Екипът използва плазмиди, които подобряват полилинкерните области нагоре и надолу по веригата, за да определи наличието на FOXF1 плазмидна ДНК в донорни клетки и генерирани eEV.

Те изследваха иРНК с пълна дължина, произведена от плазмидна ДНК в eEV и донорни клетки.

Изследователите създадоха извънклетъчни везикули с транскрипционни фактори, за да възстановят функцията на тъканите и да променят реакциите на болка в животински модел на DBP.

Те идентифицираха EV за транспортиране и разпространение на FOXF1 към увредени междупрешленни дискове в миши модел на дискогенна болка в гърба, за да определят инхибирането на FOXF1 eEV на дегенерация на междупрешленните дискове.

Екипът комбинира биомеханични тестове на междупрешленни дискове на мишки с изображения, промени в извънклетъчния матрикс (ECM) и реакции на болка, оценени след 12 седмици, за да потвърди промените в структурата и функцията, както и болката, предизвикана от терапевтичната интервенция.

Оценките на болката преди операцията и след лечението включват микро-компютърна томография (micro-CT), ядрено-магнитен резонанс (MRI), механични тестове, оцветяване с Alcian blue (AB) и picrosirius red (PSR), тест с диметилметиленово синьо и имунохистохимия (IHC ) ).

Проучването включваше хирургична техника, при която изследователите инжектираха Buprenorphine ER подкожно в мишки, за да контролират следоперативната болка.

Екипът проведе оценки на поведението преди операцията и на всеки две седмици от четири до дванадесет седмици след операцията, използвайки различни техники като тест на открито, студена плоча, окачване на опашката и окачване с тел.

Тестът в открито поле оценява спонтанната активност на мишки; тестове със студена плоча измерват термична хипералгезия; Тестовете за окачване на опашката измерват аксиална болка; и тестове за телено окачване, измерена якост.

Дванадесет седмици след операцията екипът дисектира лумбалните прешлени на животните, използвайки проследяване на феморален нерв и артерия, за да идентифицира междупрешленните дискове между L4 и L5, L5 и L6 и L6 и S1 IVD. Те използваха L5/L6 IVD за оценка на хистологията и определяне на съдържанието на глюкозаминогликан (GAG).

FOXF1 eEV значително намаляват реакциите на болка, като същевременно възстановяват структурата и функцията на IVD, включително подобрения във височината на диска, хидратацията на тъканите, съдържанието на протеогликан и механичните свойства.

Проучването се фокусира върху освобождаването на заредени с FOXF1 eEV от първични фибробласти, трансфектирани с транскрипционния фактор FOXF1. Количествената RT PCR показа значително увеличение на нивата на транскрипт на FOXF1 иРНК и нивата на транскрибирана FOXF1 иРНК в пълна дължина в сравнение с клетки, трансфектирани с pCMV6.

Терапията с FOXF1 eEV може да намали реакциите на болка в модел на мишка с пункция на лумбален диск за до 12 седмици. Женските мишки показват по-дълги времена на придобиване в групата, лекувана с FOXF1, отколкото в групата с лезии, което е продължило поне 12 седмици след лечението.

Терапията с FOXF1 eEV подобри хидратацията и височината на IVD тъканта при наранени и дегенеративни животни in vivo, като същевременно поддържа нивата на хидратация и интензитета на Т2-претегленото IVD изображение.

Въпреки това, екипът наблюдава намаляване на височината на диска при ранени животни и животни, третирани с pCMV6 eEV. Мишки, третирани с FOXF1 eEV, не са имали намаление на височината на диска 12 седмици след лечението. Полът не е повлиял на функционалните резултати.

FOXF1 eEVs възстанови механичната функция на увредени и дегенерирали IVD in vivo. При аксиален стрес третираните с FOXF1 eEV IVD показват по-висока нормализирана NZ коравина в сравнение с увредените IVD.

При условия на пълзене, повредените IVD показват увеличени нормализирани измествания при пълзене, което показва намаляване на нормализираната еластична твърдост при пълзене.

Резултатите показват, че намаляването на съдържанието на GAG в увредените IVD увеличава механичната гъвкавост, но eEV терапията предотвратява загубата на глюкозаминогликан и последващите промени в механичната функция.

FOXF1 eEV причиняват структурни и функционални промени в IVD чрез повишаване на нивата на протеогликани и GAG.

Резултатите от проучването показаха, че eEVs, заредени с транскрипционни фактори за развитие, могат да лекуват болезнени ставни заболявания като DBP, като доставят тези транскрипционни фактори на дегенеративни и болезнени IVD стави.

Тази стратегия може да помогне за намаляване на структурните и функционални аномалии, причинени от болестта, както и да регулира специфичните за пола реакции на болка.

Изследователите също препоръчват използването на транскрипционни фактори на развитието като FOXF1 за превръщане на дегенеративни NP клетки в проанаболно състояние in vivo. Необходими са допълнителни изследвания, за да се определи неговата терапевтична ефективност.