Невирусната генна терапия дава надежда за хронична болка в гърба

В скорошно проучване, публикувано в списанието Biomaterials, изследователи разработиха нова невирусна генна терапия за лечение на дискогенна болка в гърба (DBP) чрез доставяне на транскрипционния фактор Forkhead Box F1 (FOXF1), използвайки проектирани извънклетъчни везикули (eEV) в дегенеративни междупрешленни дискове (IVD) in vivo.

Хроничната болка в долната част на гърба (ХБГ) е нарастващ глобален проблем поради застаряващото население и влошаващите се проблеми с опиоидите. Съвременните лечения включват краткосрочно облекчение или скъпи хирургични интервенции, което подчертава необходимостта от непристрастяващи и по-малко инвазивни терапии.

Съвременните биологични подходи, включително прилагането на растежни фактори, клетъчната терапия и вирусната генна терапия, могат да намалят дегенерацията при животински и човешки модели. Проблеми като краткосрочни ефекти, слаба дългосрочна ефикасност и ненужна имуногенност и онкогенност обаче могат да възпрепятстват директното приложение на тези подходи.

В това проучване изследователите са установили невирусна генна терапия за дегенерация на междупрешленните дискове (IVD), използвайки FOXF1-eEV.

Изследователите трансфектирали първични миши ембрионални фибробласти (PMEF) с плазмиди, съдържащи FOXF1 или pCMV6 като контрола, и характеризирали eEV проби, използвайки анализ на проследяване на наночастици (NTA).

Те оцениха ефикасността на зареждането на молекулярен товар в eEV, използвайки количествена обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция (qRT-PCR) и конвенционална PCR. Western blot анализът идентифицира FOXF1 и EV-специфични протеини във формациите на eEV. Екипът използва плазмиди, които усилват горните и долните полилинкерни региони, за да определи наличието на FOXF1 плазмидна ДНК в донорските клетки и генерира eEV.

Те изследваха мРНК с пълна дължина, произведена от плазмидна ДНК в eEV и донорски клетки.

Изследователите създадоха извънклетъчни везикули с транскрипционни фактори, за да възстановят тъканната функция и да променят реакциите на болка в животински модел на DBP.

Те идентифицираха EV за транспорта и разпределението на FOXF1 в увредени междупрешленни дискове в миши модел на дискогенна болка в гърба, за да определят инхибирането на FOXF1 eEV на дегенерацията на междупрешленните дискове.

Екипът комбинира биомеханично тестване на междупрешленните дискове при мишки с образна диагностика, промени в извънклетъчната матрица (ECM) и реакции на болка, оценени след 12 седмици, за да потвърдят промените в структурата и функцията, както и болката, предизвикани от терапевтичната интервенция.

Предоперативните и следоперативните оценки на болката включваха микрокомпютърна томография (микро-КТ), магнитен резонанс (MRI), механично изследване, оцветяване с Alcian blue (AB) и picrosirius red (PSR), тест с диметилметиленово синьо и имунохистохимия (IHC).

Проучването включва хирургична техника, при която изследователите прилагат бупренорфин ER подкожно на мишки, за да контролират следоперативната болка.

Екипът провежда поведенчески оценки преди операцията и на всеки две седмици от четири до 12 седмици след операцията, използвайки различни методи, включително тест на открито поле, студена плоча, окачване на опашката и окачване с тел.

Тестът с отворено поле оцени спонтанната активност на мишките; тестовете със студена плоча измериха термична хипералгезия; тестовете с окачване на опашка измериха аксиална болка; а тестовете с окачване с тел измериха сила.

Дванадесет седмици след операцията екипът дисектира лумбалните гръбначни прешлени на животните, използвайки проследяване на бедрените нерви и артерии, за да идентифицира междупрешленните дискове между L4 и L5, L5 и L6, както и L6 и S1 IVD. Те използваха L5/L6 IVD, за да оценят хистологията и да определят съдържанието на гликозаминогликан (GAG).

FOXF1 eEV значително намаляват болковите реакции, като същевременно възстановяват структурата и функцията на IVD, включително подобрена височина на диска, тъканна хидратация, съдържание на протеогликани и механични свойства.

Проучването се фокусира върху освобождаването на заредени с FOXF1 eEV от първични фибробласти, трансфектирани с транскрипционния фактор FOXF1. Количествената RT PCR показа значително повишаване на нивата на FOXF1 mRNA транскрипти и нивата на FOXF1 mRNA с пълна дължина в сравнение с pCMV6-трансфектирани клетки.

Терапията с FOXF1 eEV може да намали болковите реакции в модел на лумбална дискова пункция при мишки до 12 седмици. Женските мишки показват по-дълго време на гърчовете в третираната с FOXF1 група, отколкото в увредената група, което продължава поне 12 седмици след лечението.

Терапията с FOXF1 eEV подобри хидратацията и височината на IVD тъканите при увредени и дегенеративни животни in vivo, като същевременно поддържаше нивата на хидратация и интензитета на T2-претегленото изображение на IVD диска.

Екипът обаче наблюдава намаляване на височината на диска при увредени животни и животни, третирани с pCMV6 eEV. Мишките, третирани с FOXF1 eEV, не са имали намаление на височината на диска 12 седмици след лечението. Полът не е повлиял на функционалните резултати.

FOXF1 eEV възстановиха механичната функция на увредени и дегенерирани IVD in vivo. Под аксиално напрежение, третираните с FOXF1 eEV IVD показаха по-висока нормализирана NZ твърдост в сравнение с увредените IVD.

При условия на пълзене, повредените IVD показват увеличени нормализирани измествания при пълзене, което показва намаляване на нормализираната еластична коравина при пълзене.

Резултатите показват, че намаляването на съдържанието на GAG в увредени IVD (междинни дискове) увеличава механичната гъвкавост, но терапията с eEV предотвратява загубата на гликозаминогликани и последващите промени в механичната функция.

FOXF1 eEV индуцираха структурни и функционални промени в IVD чрез повишаване на нивата на протеогликан и GAG.

Резултатите от проучването показват, че eEV, заредени с фактори за развитие на транскрипция, могат да лекуват болезнени ставни заболявания като DBP, като доставят тези транскрипционни фактори в дегенеративни и болезнени стави чрез IVD.

Тази стратегия може да помогне за намаляване на структурните и функционалните аномалии, причинени от заболяването, и да регулира реакциите на болка по специфичен за пола начин.

Изследователите също така препоръчват използването на фактори за развитие на транскрипция, като FOXF1, за да се преместят дегенеративните NP клетки в проанаболно състояние in vivo. Необходими са допълнителни изследвания, за да се определи терапевтичната им ефикасност.